Новые белки н5, кодирующие их молекулы нуклеиновых кислот и векторы, и их применение в медицине

Новые белки н5, кодирующие их молекулы нуклеиновых кислот и векторы, и их применение в медицине

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области медицины, предпочтительно к области инфекционных болезней. В частности, настоящее изобретение относится к белкам вируса гриппа, нуклеиновым кислотам и векторам, которые кодируют указанные белки, и к вакцинам против гриппа. Более конкретно настоящее изобретение относится к применению любых из указанных белков, молекул нуклеиновых кислот, векторов или вакцин для лечения и предупреждения инфекции, вызываемой вирусом гриппа, а также для предупреждения внутри- и межвидовой передачи вируса гриппа.

Предпосылки создания изобретения

Инфекция, вызываемая вирусом гриппа, остается важной для животных и человека инфекцией. Грипп вызывается вирусами, которые претерпевают постоянные антигенные изменения/модификации и которые имеют животное резервуар. В результате этого в будущем могут возникать новые эпидемии и пандемии и трудно достичь искоренения заболевания. Вирусы гриппа хорошо известны в данной области и описаны более подробно у Р. Palese, Nature Medicine, т.10, №.12, декабрь 2004 г., сс.82-86 и в дополнительных указанных в этой публикации ссылках. В целом, геном вируса гриппа А состоит из одноцепочечных сегментов, и на поверхности вирусных частиц присутствуют два основных гликопротеина: гемагглютинин (Н) и нейраминидаза (N). В результате того, что имеется по меньшей мере 16 различных подтипов гемагглютинина (H1-H16) и 9 различных подтипов нейраминидаз (N1-N9), существует значительная антигенная вариабельность между вирусами гриппа.

Продемонстрировано, что вирус гриппа типа H5N1, т.е. вирус чумы домашней птицы (Fowl Plague) заражает домашнюю птицу, свиней и человека. Вирусы могут передаваться также непосредственно от различных видов птиц человеку (Claas и др., Lancet, 351, 1998, с.472; Suarez и др., J. Virol. 72, 1998, с.6678; Subbarao и др., Science, 279, 1998, с.393; Shortridge, Vaccine, 17 (приложение 1), 1999, сс.26-29). Известны клинические случаи, когда смертность людей достигала примерно 50%.

В течение последнего десятилетия свиньи стали важным переносчиком при пандемиях гриппа. Свиньи, верблюды и тюлени, предпочтительно свиньи, могут служить в качестве «камеры для смешения» для вирусов птичьего гриппа и поэтому представляют собой потенциальный фактор риска, позволяющий преодолевать видовые барьеры от домашней птицы, являющейся природным резервуаром вирусов гриппа, к млекопитающим. Это происходит, как правило, путем двойного заражения чувствительных животных, например свиней, как свойственным для млекопитающих (свиным), так и птичьим вирусом гриппа. Такое двойное заражение может приводить к возникновению новых рекомбинантных вирусов, которые могут вызывать человеческие или свиные пандемии. Однако согласно современным данным рекомбинация существующих штаммов вируса птичьего гриппа Н5 и вирусов гриппа млекопитающих не привела к получению обладающих высокой вирулентностью рекомбинантов. С другой стороны, вирус птичьего гриппа может заражать свиней и в результате спонтанных мутаций может адаптироваться к организму свиней. Критический барьер может быть преодолен, если вирус приобретет способность к горизонтальному пути передачи в популяции свиней (или других млекопитающих).

Тем не менее, большая часть свиней в Юго-Восточной Азии оказались зараженной штаммом птичьего вируса гриппа (Н5), источником которого оказались соседние птичники. До тех пор пока указанные инфекции являются доклиническими, их можно диагностировать только лабораторными методами, и поэтому они часто остаются незамеченными. Существует высокий риск, что такие свиньи, имеющие заражение на доклиническом уровне, могут служить в качестве благоприятного организма для адаптации вируса к системе млекопитающих, что приводит к распространению вируса в популяции свиней, а также может приводить к заражению человека.

Современные вакцины против гриппа представляют собой субъединичную вакцину (Babai и др., Vaccine, 17(9-10), 1999, cc.1223-1238; Crawford и др., Vaccine, 17(18), 1999, cc.2265-2274; Johansson и др., Vaccine, 17(15-16), 1999, cc.2073-2080), ослабленную вакцину (Horimoto и др., Vaccine, 22(17-18), 2004, cc.2244-2247), ДНК-вакцину (Watabe и др., Vaccine, 19(31), 2001, cc.4434-4444) и инактивированную вакцину против гриппа (Сао и др., Vaccine, 10(4), 1992, cc.238-242), причем последняя нашла наиболее широкое применение в промышленности (Lipatov и др., J Virol, 78(17), 2004, cc.8951-8959).

Субъединичные вакцины, рекомбинантные гемагглютинин и нейраминидаза (Babai и др., Vaccine, 17(9-10), 1999, cc.1223-1238; Crawford и др., Vaccine, 17(18), 1999, cc.2265-2274; Johansson и др., Vaccine, 17(15-16), 1999, cc.2073-2080) могут являться важной альтернативной инактивированной вакцине, хотя они не нашли в настоящее время применения в качестве имеющихся в продаже вакцин. Очевидно, что получение таких вакцин является более безопасным, чем получение инактивированной вакцины. Кроме того, субъединичные вакцины не вызывают гуморальный иммунный ответ на существующие в организме белки вируса гриппа, и поэтому они позволяют отличать вакцинированных и инфицированных животных (Crawfbrd и др., Vaccine, 17(18), 1999, cc.2265-2274).

Белок гемагглютинина представляет собой связывающийся с рецептором и слитый с мембраной гликопротеин вируса гриппа, и он является мишенью для нейтрализующих инфекционность антител. Полный белок гемагглютинина (НА) из H5N1 состоит из 568 аминокислот, имеет молекулярную массу 56 кДа. Молекула НА состоит из субъединиц НА1 и НА2, при этом субъединица НА1 опосредует первоначальный контакт с клеточной мембраной, а НА2 ответственна за слияние с мембраной (Chizmadzhev, Bioelectrochemistry, 63(1-2), 2004, сс.129-136).

Системы бакуловирус/клетка насекомого применяли для экспрессии генов гемагглютинина, выделенных из подтипов птичьего гриппа (Babai и др., Vaccine, 17(9-10), 1999, cc.1223-1238; Crawford и др., Vaccine, 17(18), 1999, cc.2265-2274; Johansson и др., Vaccine, 17(15-16), 1999, cc.2073-2080); Nwe и др., ВМС Mircobiology, 6(16), 2006, doi:10.1186/1471-2180-6-16). Однако указанные рекомбинантные белки, вероятно, в некоторых случаях могут не обладать защитным действием или обладают лишь невысокой эффективностью в отношении некоторых видов (Treanor и др., Vaccine, 19, 2001, cc.1732-1737).

Таким образом, существует необходимость в повышении доступности улучшенных вакцин и новых подходов вакцинации для обеспечения борьбы с гриппом и оказания положительного воздействия на вирусную нагрузку при заболевании.

Описание изобретения

Перед описанием вариантов осуществления настоящего изобретения следует отметить, что в контексте настоящего описания и в прилагаемой формулы изобретения при упоминании единственного числа подразумевает также и множественное число, если из контекста ясно не следует иное. Так, например, ссылка на «препарат» относится к множеству указанных препаратов; ссылка на «носитель» относится к одному или нескольким носителям или их эквивалентам, известным специалистам в данной области, и т.д. Если не указано иное, то все технические и научные понятия имеют значения, общеизвестные специалистам в области, к которой относится настоящее изобретение. Все приведенные диапазоны и значения могут отличаться на 1-5%, если специально не указано иное или если иное не известно специалистам в данной области, таким образом, понятие «примерно» исключено из описания. Хотя для применения на практике или оценки настоящего изобретения можно применять любые методы и материалы, подобные или эквивалентные приведенным в настоящем описании, в нем представлены предпочтительные методы, устройства и материалы. Все упомянутые публикации включены в настоящее описание в качестве ссылки с целью описания или раскрытия субстанций, эксципиентов, носителей и методологий, описанных в публикациях, которые можно применять в связи с изобретением. Ничто в настоящем описании не должно рассматриваться как допущение того, что изобретение не имеет права включать задним числом такое описание посредством ссылки на предшествующее изобретение.

Решение указанной выше технической проблемы предложено в описании и вариантах осуществления изобретения, объем которых представлен в формуле изобретения.

Белки вирусов гриппа и кодирующие их молекулы нуклеиновых кислот

Настоящее изобретение относится к белку Н5 вируса гриппа, где белок Н5 имеет аминокислоту 223N и модификацию 328K+, при этом нумерация аминокислотных положений белка Н5 соответствует нумерации аминокислотных положений в приведенной в качестве примера SEQ ID NO:1, и где модификация 328K+ означает, что в аминокислотное положение 328 белка Н5 встроен второй лизин (K+). Предпочтительно указанный белок Н5 и любой другой белок Н5, предлагаемый в изобретении, представляет собой выделенный белок Н5. При создании изобретения неожиданно было установлено, что белки Н5, которые имеют указанные выше модификации, обладают более высокой антигенностью по сравнению с белками Н5, которые не имеют соответствующих аминокислот в положениях 223 и 328/329.

Понятие «гемагглютинин 5 (Н5)», или «Н5 вируса птичьего гриппа», или «белок Н5» в контексте настоящего описания относится, но, не ограничиваясь только ими, к любому встречающемуся в естественных условиях белку Н5 и любым модифицированным формам белка Н5, включая любой делеционный, несущий замену и/или инсерционный мутант белка Н5, где указанные белки Н5 имеют аминокислоту 223N и модификацию 328K+.

Нумерация аминокислотных положений белка Н5 в контексте настоящего описания в качестве примера представлена в SEQ ID NO:1. SEQ ID NO:1 обозначает аминокислотную последовательность гемагглютинина штамма duck/China/E319-2/03 (утиный/Китай/Е319-2/03), но в ней отсутствует аминоконцевой сигнальный пептид. Другими словами, при ссылке на аминокислоту в положении 223 (аминокислота 223) подразумевается аминокислотный остаток, который соответствует аминокислоте 223 SEQ ID NO:1. Однако этот не означает, что белки Н5, предлагаемые в изобретении, имеют аминокислотную последовательность, идентичную SEQ ID NO:1. Это обозначает только то, что соответствующие аминокислотные остатки белков Н5, предлагаемых в изобретении, представляют собой именно указанный аминокислотный остаток. В данном случае аминокислота 223 должна представлять собой серин (S). Например, понятия «223N» или «155N» означают, что аминокислота в положениях 223 и 155 соответственно (нумерация согласно аминокислотным положениям в SEQ ID NO:1) должна представлять собой аминокислоту аспарагин (N). Другими словами, если ссылка сделана на «белок Н5, имеющий аминокислоту 223N», это означает, что аминокислота в молекуле Н5 в аминокислотном положении 223 (нумерация согласно аминокислотным положениям в SEQ ID NO:1), которая в норме представляет собой серин, заменена на аспарагин (N). Понятие «328K+» или «модификация 328K+» означает, что в аминокислотное положение 328 белка Н5 (нумерация согласно аминокислотным положениям в SEQ ID NO:1) встроен второй лизин (K+). В том случае, когда встречающиеся в естественных условиям аминокислоты в положениях 328 и 329 аминокислотной последовательности представляют собой лизин-лизин, то дополнительный лизин (K) не может быть встроен. Однако в большинстве известных последовательностей Н5 в положениях 328 и 329 присутствуют аминокислоты лизин-аргинин. В любом случае понятие «модификация 328K+» означает, что второй лизин (K) может быть встроен между лизином в положении 328 и аргинином в положении 329. В результате модифицированная последовательность должна считываться как лизин-лизин-аргинин (KKR).

Таким образом, настоящее изобретение относится к белку Н5 и любым модифицированным формам белка Н5, включая делеционный, полученный в результате замены и/или инсерционный мутант белка Н5, где указанные белки Н5 имеют аминокислоту 223N и модификацию 328K+, где нумерация аминокислотных положений белка Н5 соответствует нумерации аминокислотных положений в представленной в качестве примера в SEQ ID NO:1 и где модификация 328K+ означает, что в аминокислотное положение 328 белка Н5 встроен второй лизин (K+). Очевидно, что любой из белков Н5, представленных в настоящем изобретении, является антигенным, т.е. обладает антигенными свойствами при оценке с помощью стандартного для вирусов гриппа теста торможения гемагглютинации.

Следующим вариантом осуществления настоящего изобретения является любая часть белка Н5, т.е. любой пептидный фрагмент, который обладает антигенными свойствами при оценке с помощью стандартного для вирусов гриппа теста торможения гемагглютинации, несущий по меньшей мере аминокислоту 223N и модификацию 328K+, где нумерация аминокислотных положений белка Н5 соответствует нумерации аминокислотных положений в представленной в качестве примера в SEQ ID NO:1 и где модификация 328K+ означает, что в аминокислотное положение 328 белка Н5 встроен второй лизин (K+).

Белок Н5 обладает антигенными свойствами, если он ингибирует (тормозит) гемагглютинацию при оценке с помощью стандартного теста торможения гемагглютинации, который описан, например, в примере 2. Как правило, указанный антигенный фрагмент белка Н5 содержит 200, 180, 160, 150, 140, 130, 120, 110 или предпочтительно 105 смежных аминокислот аминокислотной последовательности, соответствующей белку Н5, как он описан выше, модифицированному или немодифицированному, который обладает антигенными свойствами при оценке с помощью стандартного теста торможения гемагглютинации, который описан, например, в примере 2. Стандартный тест торможения гемагглютинации, например, описан также с дополнительными ссылками у Stephenson и др., Virus Research т.103, 2004, cc.91-95. Однако следует понимать, что описанный в примере 2 HI-тест представляет собой соответствующий эталонный анализ, который можно применять в сочетании со всеми объектами изобретения, которые представлены в настоящем описании.

В целом, HI-тест осуществляли для выявления присутствия НА-специфических антител. Гетерологичный вирус H5N2-подтипа A/chicken/Mexico/232/94 (А/куриный/Мехико/232/94) применяли в концентрации, соответствующей четырем гемагглютинирующим единицам [4 НА-единиц] в HI-тесте. В титрационных микропланшетах с U-образным дном последовательно смешивали серийные двукратные разведения в ЗФР с равными объемами (25 мкл) содержащего 4 НА-единицы вируса и инкубировали при комнатной температуре (примерно 25°C) в течение 30 мин. Куриные эритроциты в концентрации 0,5% в ЗФР добавляли в лунки, содержащие сыворотку-вирус, и инкубировали 40 мин при комнатной температуре. Определяли HI-титры в виде обратных величин наибольших разведении сыворотки, при которых обнаружено торможение гемагглютинации.

Следует отметить, что Haesebrouck и Pensaert, 1986, установили, что «может существовать корреляция между HI-титрами в отношении контрольного заражения вирусом и защиты от контрольного заражения». Haesebrouck и Pensaert, 1986, определи также, что свиньи, у которых HI-титры составляли ≥40, были «полностью устойчивы к контрольному заражению и в их дыхательных путях не происходила репликация вирусов при контрольном заражении». Таким образом, достижение при вакцинации свиней HI-титров ≥40 должно коррелировать с защитой животных (F. Haesebrouck и М.В. Pensaert, 1986, «Effect of intratracheal challenge of fattening pigs previously immunized with an inactivated influenza H IN 1 vaccine», Veterinary Microbiology, 11, 1986, cc.239-249). Можно предположить, что эквивалентные или по меньшей мере близкие эквивалентным HI-титры Н5 должны также приводить к полной иммунной защите свиней от вируса птичьего гриппа. Более низкие титры приводят по меньшей мере к сероконверсии у вакцинированных животных и в результате этого к частичной иммунной защите указанных животных, что может также резко снижать риск пандемий.

Кроме того, антигенный фрагмент белка Н5, предлагаемый в изобретении, включает, но, не ограничиваясь только ими, делеционные мутанты белка Н5, которые содержат:

I. по меньшей мере 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9 или наиболее предпочтительно 8 смежных аминокислот аминокислотной последовательности, которые окружают и включают аминокислоту 223N; и

II. по меньшей мере 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9 или наиболее предпочтительно 8 смежных аминокислот аминокислотной последовательности, которые окружают и включают аминокислотную модификацию 328K+; и

III. при этом любой из указанных антигенных фрагментов белка Н5 опосредует торможение гемагглютинации при оценке с помощью стандартного теста торможения гемагглютинации, описанного в примере 2.

Предпочтительно аминокислоты, окружающие аминокислоту 223N и/или 328K+, соответствуют указанным в SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:4.

Кроме того, предпочтительные белки Н5, предлагаемые в изобретении, представляют собой:

I. любой из указанных выше белков, имеющий аминокислоту 223N и модификацию 328K+;

II. любой из указанных выше белков, имеющий аминокислоту 94N/223N и модификацию 328K+;

III. любой белок Н5 птичьего происхождения, имеющий аминокислоту 223N и модификацию 328K+, где под птичьим происхождением подразумевается, что последовательность Н5 выведена из изолята вируса, который первоначально выделен из домашней птицы, зараженной вирусом птичьего гриппа типа 5; или

IV. любой; белок Н5 птичьего происхождения, имеющий аминокислоты 94N/223N и модификацию 328K+, где под птичьим происхождением подразумевается, что последовательность Н5 выведена из изолята вируса, который первоначально выделен из домашней птицы, зараженной вирусом птичьего гриппа типа 5; или

V. любой белок Н5 птичьего происхождения, имеющий аминокислоты 155N/223N и модификацию 328K+, где под птичьим происхождением подразумевается, что последовательность Н5 выведена из изолята вируса, который первоначально выделен из домашней птицы, зараженной вирусом птичьего гриппа типа 5; или

VI. любой белок Н5 птичьего происхождения, имеющий аминокислоты 120N/155N/223N и модификацию 328K+, где под птичьим происхождением подразумевается, что последовательность Н5 выведена из изолята вируса, который первоначально выделен из домашней птицы, зараженной вирусом птичьего гриппа типа 5; или

VII. любой белок Н5, имеющий модификации 94N/223N и модификацию 328K+; или

VIII. любой белок Н5, имеющий модификации 94N/155N/223N и модификацию 328K+; или

IX. любой белок Н5, имеющий модификации 94N/120N/155N/223N и модификацию 328K+; или

X. любой белок Н5, имеющий модификацию 223N, модификацию 328K+ и один или несколько следующих аминокислотных кластеров, выбранных из группы, включающей:

а. ак 93-95: GNF

б. ак 123-125: SDH

в. ак 128-130: SSG

г. ак 138-140: GSS

д. ак 226-228: MDF

е. ак270-272: EVE

ж. ак 309-311: NKL; или

XI. любой белок Н5, имеющий аминокислоту 223N и модификацию 328K+ и один или несколько следующих аминокислотных кластеров, выбранных из группы, включающей:

а. ак 93-95: GNF

б. ак 128-130: SSG

в. ак 138-140: GSS; или

XII. любой белок Н5, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.

Кроме того, предпочтительные белки Н5, предлагаемые в изобретении, включают белки Н5, которые описаны у Hoffmann и др., PNAS, т.106, №.36, 6 сентября 2005 г., сс.12915-12920, где белки Н5 включают одну или несколько описанных выше модификаций, по меньшей мере аминокислоту 223N и модификацию 328K+, при этом нумерация аминокислотных положений белка Н5 соответствует нумерации аминокислотных положений, приведенной в качестве примера в SEQ ID NO:1, и где модификация 328K+ означает, что в аминокислотное положение 328 белка Н5 встроен второй лизин (K+). Содержание указанной публикации полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Кроме того, предпочтительные белки Н5, предлагаемые в изобретении, включают белки Н5, которые содержат пептид, который несет аминокислоту 223N и модификацию 328K+, при этом нумерация аминокислотных положений белка Н5 соответствует нумерации аминокислотных положений, приведенной в качестве примера в SEQ ID NO:1, и где модификация 328K+ означает, что в аминокислотное положение 328 белка Н5 встроен второй лизин (K+), и:

I. аминокислотные последовательности SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3; SEQ ID NO:4; SEQ ID NO:5 или SEQ ID NO:6; или

II. любой пептид, последовательность которого гомологична по меньшей мере на 85%, более предпочтительна последовательность которого гомологична по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительна последовательность которого гомологична по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительна последовательность которого гомологична по меньшей мере примерно на 97%, еще более предпочтительна последовательность которого гомологична по меньшей мере примерно на 98% и еще более предпочтительна последовательность которого гомологична по меньшей мере примерно на 99% полипептиду, описанному в подпункте I), который опосредует торможение гемагглютинации при оценке стандартным тестом торможения гемагглютинации, который описан выше; или

III. любой антигенный фрагмент полипептидов, представленных в подпунктах I) или II), который содержит по меньшей мере 35, 30, 25, 20, 18, 15, 13, 10, 9 или наиболее предпочтительно 8 смежных аминокислот любого из пептидов, представленных в подпунктах I) или II);

IV. любой из пептидов, представленных в подпунктах I), II) или III), имеющий аминокислоты 36Т, 36K, 83А, 83Т, 83D, 86А, 86V, 120N, 120S, 155N, 155S, 156А, 156Т, 189R, 189K, 212K, 212R, 212Е, 223N, 223N или 120N/155N;

V. любой из пептидов, представленных в подпунктах I), II), III) или IV), имеющий один или несколько следующих аминокислотных кластеров, выбранных из группы, включающей:

а. ак 93-95: GNF

б. ак 123-125: SDH

в. ак 128-130: SSG

г. ак 138-140: GSS

д. ак 226-228: MDF

е. ак 270-272: EVE

ж. ак 309-311: NKL; или

VI. любой из пептидов, представленных в подпунктах I), II), III) или IV), имеющий один или несколько следующих аминокислотных кластеров, выбранных из группы, включающей:

а. ак 93-95: GNF

б. ак 128-130: SSG

в. ак 138-140: GSS.

Определение «гомологии последовательностей» в контексте настоящего описания относится к методу определения сходства двух последовательностей. Для определения гомологии последовательностей две или большее количество последовательностей подвергают оптимальному выравниванию и при необходимости интродуцируют бреши. В отличие от оценки идентичности последовательностей при определении гомологии последовательностей консервативные аминокислотные замены считают удовлетворяющими условиям гомологии. Другими словами, для того чтобы полипептид или полинуклеотид имел 95% гомологию последовательности с референс-последовательностью, 85%, предпочтительно 90%, еще более предпочтительно 95% аминокислотных остатков или нуклеотидов в референс-последовательности должны соответствовать или содержать консервативную замену на другую аминокислоту или нуклеотид, или количество аминокислот или нуклеотидов, составляющее вплоть до 15%, предпочтительно вплоть до 10%, еще более предпочтительно вплоть до 5% от общего количества аминокислотных остатков или нуклеотидов, не включая консервативные замены, в референс-последовательности можно встраивать в референс-последовательность. Предпочтительно гомологичная последовательность содержит по меньшей мере участок, состоящий из 50, еще более предпочтительно из 100, еще более предпочтительно из 250, еще более предпочтительно из 500 нуклеотидов. При указанном сравнительном анализе первичной структуры гомологию последовательностей оценивают по типу «положение с положением», например, последовательности являются «гомологами» в конкретном положении, если в этом положении нуклеотиды или аминокислотные остатки являются идентичными. Общее количество таких идентичных положений затем делят на общее количество нуклеотидов или аминокислотных остатков в референс-последовательности, получая % гомологии последовательностей. Гомологию последовательностей легко рассчитывать с помощью известных методов, включая, но, не ограничиваясь только ими, методы, описанные в Computational Molecular Biology, под ред. Lesk A. N., изд-во Oxford University Press, New York 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, под ред. Smith D.W., изд-во Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, часть I, под ред. Griffin A.M. и Griffin H. G., изд-во, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge G., изд-во Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, под ред. Gribskov M. и Devereux J., изд-во M. Stockton Press, New York, 1991; и Carillo H. и Lipman D., SIAM J. Applied Math., 48, 1988, с.1073, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки. Предпочтительные методы определения гомологии последовательностей созданы так, чтобы получать наибольшее соответствие между изучаемыми последовательностями. Методы определения гомологии последовательностей приведены в систему в доступных общественности компьютерных программах, которые позволяют определять идентичность последовательностей между данными последовательностями. Примерами таких программ являются, но, не ограничиваясь только ими, пакет программ GCG (Devereux J. и др., Nucleic Acids Research, 12(1), 1984, с.387), BLASTP, BLASTN и FASTA (Altschul S.F. и др., J. Molec. Biol., 215, 1990, cc.403-410). Программа BLASTX является доступной общественности от фирмы NCBI и других источников (BLAST Manual, Altschul S. и др., NCVI NLM NIH Bethesda, MD.20894, Altschul S.F. и др., J. Molec. Biol., 215, 1990, cc.403-410), содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки). Эти программы позволяют осуществлять оптимальное выравнивание последовательностей, с помощью принимаемых по умолчанию значений, таких как вес бреши, для того чтобы получать наиболее высокий уровень гомологии последовательностей между исследуемой последовательностью и референс-последовательностью.

Кроме того, предпочтительные белки Н5 включают белки Н5, которые содержат указанную выше модификацию 328K+, и аминокислотную последовательность, представленную в таблице 1, или ее любой иммуногенный фрагмент:

Кроме того, настоящее изобретение относится к белкам Н5, которые имеют по меньшей мере аминокислоту 223N и модификацию 328K+, где нумерация аминокислотных положений белка Н5 соответствует нумерации аминокислотных положений, приведенной в качестве примера в SEQ ID NO:1, и где модификация 328K+ означает, что в аминокислотное положение 328 белка Н5 встроен второй лизин (K+), и которые содержат:

I. пептид, включающий последовательности, которые имеют регистрационные номера NCBI: AAT65209, CAJ32556, АВС47656, CAF21874, CAF21870, ААС58998, ААС58997, ААС58996, ААС58994, ААС58993, ААС58992, ААС58991, ААС58990, ААС58995, AAS45134, AAN17270, AAN17269, AAN17268, AAN17267, AAN17266, AAN17265, AAN17264, AAN17263, AAN17262, AAN17261, AAN17260, AAN17259, AAN17257, AAN17256, AAN17255, AAN17254, ААА43083, ААА43082, ААВ19079, ВАЕ48696, ВАЕ48693, ВАЕ48696, ВАЕ48695, ВАЕ48694, ВАЕ48692, ВАЕ48691, ВАЕ48690, ВАЕ48689, ВАЕ48688, ВАЕ48687, ВАЕ48686, ВАЕ48685, ВАЕ48684, ВАЕ48683, ААС58999, АВС72082, AAV91149, ААР71993, ААР71992, ААР71991, ААР71990, ААР71989, ААР72011, ААР72010, ААР72009, ААР72008, ААР72007, ААР72006, ААР72005, ААР72004, ААР72003, ААР72002, ААР72001, ААР72000, ААР71999, ААР71998, ААР71997, ААР71996, ААР71995, ААР71994. AAF99718, ABF58847, AAG38534, ААС32102, ААС32099, AAL75847, ААС32101, ААС32098, ААС32088, ААС32078, AAR99628, ААС32100, ААМ49555, AAL75843, AAL75839, AAD13573, AAD13568, AAF04720, AAF04719, ААС34263, AAR16155, AAD13574, AAD13570, AAD13575, AAD13572, AAD13569, AAD13567, AAD13566, AAK57506, AAG01225, AAG01215, AAG01205, AAG01195 или ABD83813, модифицированные, как описано выше, это означает, что эти последовательности несут вышеуказанные модификации 223N и 328K+, которые не являются частью последовательностей дикого типа; или

II. любой пептид, последовательность которого гомологична по меньшей мере на 85%, более предпочтительна последовательность которого гомологична по меньшей мере примерно на 90%, еще более предпочтительна последовательность которого гомологична по меньшей мере примерно на 95%, еще более предпочтительна последовательность которого гомологична по меньшей мере примерно на 97%, еще более предпочтительна последовательность которого гомологична по меньшей мере примерно на 98% и еще более предпочтительна последовательность которого гомологична по меньшей мере примерно на 99% полипептиду, описанному в подпункте I), и который опосредует торможение гемагглютинации при оценке стандартным тестом торможения гемагглютинации, который описан выше;

III. любой из пептидов, представленных в подпунктах I) или II), имеющий аминокислоты 36Т, 36K, 83А, 83Т, 83D, 86А, 86V, 120N, 120S, 155N, 155S, 156А, 156Т, 189R, 189K, 212K, 212K, 212Е, 263А, 263Т или 120N/155N; или

IV. любой из пептидов, представленных в подпунктах I), II) или III), имеющий один или несколько следующих аминокислотных кластеров, выбранных из группы, включающей:

а. ак93-95: GNF

б. ак 123-125: SDH

в. ак 128-130: SSG

г. ак 138-140: GSS

д. ак 226-228: MDF

е. ак 270-272: EVE

ж. ак 309-311: NKL; или

V. любой из пептидов, представленных в подпунктах I), II), III) или IV), имеющий один или несколько следующих аминокислотных кластеров, выбранных из группы, включающей:

а. ак 93-95: GNF

б. ак 128-130: SSG

в. ак 138-140: GSS.

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения являются также молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют любой из белков Н5, описанных выше. Предпочтительно указанные молекулы нуклеиновых кислот представляют собой молекулы РНК, ДНК или ДНК-копии (кДНК). Таким образом, настоящее изобретение относится к молекуле нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекуле кДНК, кодирующей белок Н5 или любые модифицированные формы белка Н5, включая любой делеционный, несущий замену и/или инсерционный мутант белка Н5, где указанные белки Н5 имеют аминокислоту 223N и модификацию 328K+, при этом нумерация аминокислотных положений белка Н5 соответствует нумерации аминокислотных положений, приведенной в качестве примера в SEQ ID NO:1, и где модификация 328K+ означает, что в аминокислотное положение 328 белка Н5 встроен второй лизин (K+).

Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является также молекула нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекула кДНК, кодирующая любой фрагмент белка Н5, т.е. кодирующая любой пептидный фрагмент, который обладает антигенными свойствами при оценке с помощью стандартного теста торможения гемагглютинации, описанного выше, и который имеет по меньшей мере аминокислоту 223N и модификацию 328K+, при этом нумерация аминокислотных положений белка Н5 соответствует нумерации аминокислотных положений, приведенной в качестве примера в SEQ ID NO:1, и где модификация 328K+ означает, что в аминокислотное положение 328 белка Н5 встроен второй лизин (K+). Как правило, такие молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют антигенный фрагмент белка Н5, сдержат 600, 540, 480, 450, 420, 390, 360, 330 или наиболее предпочтительно 315 смежных нуклеотидов нуклеотидной последовательности, которая кодирует указанный выше белок Н5, модифицированный или немодифицированный, и который обладает антигенными свойствами при оценке с помощью стандартного теста торможения гемагглютинации, описанного выше.

Другие варианты антигенных фрагментов белка Н5 описаны выше. В компетенции специалиста в данной области находится конструирование любых указанных молекул нуклеиновых кислот, предпочтительно молекул кДНК, которые кодируют антигенный фрагмент белка Н5, описанный выше. Они включают также, но, не ограничиваясь только ими, конструирование молекул нуклеиновых кислот, предпочтительно молекул кДНК, которые кодируют описанные выше антигенные фрагменты белка Н5, в том числе делеционные мутанты белка Н5, которые содержат:

I. по меньшей мере 105, 90, 75, 60, 48, 45, 39, 30, 27 или наиболее предпочтительно 24 смежных кодирующих аминокислоту нуклеотидов нуклеотидной последовательности, которая окружает и включает кодирующую последовательность, которая кодирует аминокислоту 223N; и

II. по меньшей мере 105, 90, 75, 60, 48, 45, 39, 30, 27 или наиболее предпочтительно 24 смежных кодирующих аминокислоту нуклеотидов нуклеотидной последовательности, которая окружает и включает кодирующую последовательность, которая кодирует модификацию 328K+; и

III. при этом, любой указанный антигенный фрагмент белка Н5 опосредует торможение гемагглютинации при оценке с помощью стандартного теста торможения гемагглютинации, который описан в примере 2.

Предпочтительными нуклеотидами, которые окружают нуклеотиды, которые кодируют аминокислоты 223N и/или 328K+, являются те нуклеотиды, которые кодируют SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:4.

Кроме того, предпочтительными молекулами нуклеиновых кислот, кодирующих белок Н5, предлагаемый в изобретении, являются:

I. любая из указанных выше молекул, которая кодирует аминокислоту 223N и модификацию 328K+;

II. любая из указанных выше молекул, которая кодирует аминокислоту 94N/223N и модификацию 328K+;

III. любая из молекул нуклеиновых кислот птичьего происхождения, кодирующая аминокислоту 223N и модификацию 328K+, где под птичьим происхождением подразумевается, что последовательность Н5 выведена из изолята вируса, который первоначально выделен из домашней птицы, зараженной вирусом птичьего гриппа типа 5; или

IV. любая из молекул нуклеиновых кислот птичьего происхождения, кодирующая аминокислоты 94N/223N и модификацию 328K+, где под птичьим происхождением подразумевается, что последовательность Н5 выведена из изолята вируса, который первоначально выделен из домашней птицы, зараженной вирусом птичьего гриппа типа 5; или

V. любая из молекул нуклеиновых кислот птичьего происхождения, кодирующая аминокислоты 155N/223N и модификацию 328K+, где под птичьим происхождением подразумевается, что последовательность Н5 выведена из изолята вируса, который первоначально выделен из домашней птицы, зараженной вирусом птичьего гриппа типа 5; или

VI. любая молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок Н5 птичьего происхождения, который имеет аминокислоты 120N/155N/223N и модификацию 328K+, где под птичьим происхождением подразумевается, что последовательность Н5 выведена из изолята вируса, который первоначально выделен из домашней птицы, зараженной вирусом птичьего гриппа типа 5; или

VII. любая молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок Н5, который имеет модификации 94N/223N и модификацию 328K+; или

VIII. любая молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок Н5, который имеет модификации 94N/155N/223N и модификацию 328K+; или

IX. любая молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок Н5, который имеет модификации 94N/120N/155N/223N и модификацию 328K+; или

X. любая молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок Н5, который имеет модификации 223N, модификацию 328K+ и один или несколько следующих аминокислотных кластеров, выбранных из группы, включающей:

а. ак 93-95: GNF

б. ак 123-125: SDH

в. ак 128-130: SSG

г. ак 138-140: GSS

д. ак 226-228: MDF

е. ак 270-272: EVE

ж. ак 309-311: NKL; или

XI. любая молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок Н5, который имеет аминокислоту 223N, модификацию 328K+ и один или несколько следующих аминокислотных кластеров, выбранных из группы, включающей:

а. ак 93-95: GNF

б. ак 128-130: SSG

в. ак 138-140: GSS; или

XII. любая молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок Н5, который имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.

Кроме того, предпочтительные белки Н5, предлагаемые в изобретении, включают белки Н5, которые описаны у Hoffmann и др., PNAS, т.106, №.36, 6 сентября 2005 г., сс.12915-12920, где белки Н5 включают одну или несколько описанных выше модификаций, по меньшей мере аминокислоту 223N и модификацию 328K+, при этом нумерация аминокислотных положений белка Н5 соответствует нумерации аминокислотных положений, приведенной в качестве примера в SEQ ID NO:1, и где модификация 328K+ означает, что в аминокислотное положение 328 белка Н5 встроен второй лизин (K+). Содержание указанной публикации полностью включено в настоящее описание в качестве ссылки. Таким образом, следующими вариантами осуществления настоящего изобретения является также молекула любой нуклеиновой кислоты, предпочтительно молекула кДНК, которая кодирует любой их белков, описанных у Hoffmann и др., PNAS, т.106, №.36, 6 сентября 2005 г., сс.12915-12920, где белки Н5 включают одну или несколько описанных выше модификаций, по меньшей мере аминокислоту 223N и модификацию 328K+, при этом нумерация аминокислотных положений белка Н5 соответствует нумерации аминокислотных положений, приведенной в качестве примера в SEQ ID NO:1, и где модификация 328K+ означает, что в аминокислотное положение 328 белка Н5 встроен второй лизин (K+).

Методы интродукции любой из указанных выше модификаций в нуклеотидную последовательность, включая кодирующую последовательность белка Н5 вируса гриппа, хорошо известны в данной области. Геномную последовательность полного вируса гриппа можно модифицировать согласно изобретению, например, с помощью методов, описанных в US 6951754, в том числе в дополнительных, приведенных в нем ссылках.

Кроме того, можно применять традиционные методы молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантной ДНК, известные в данной области, для модификации нуклеотидной последовательности, которая кодирует антиген, представленный в настоящем описании. Такие методы подробно описаны в литературе (см., например, Sambrook и др., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-ое изд., изд-во Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; DNA Cloning: A Practical Approach, т.I и т.II, под ред. D. N. Glover, 1985; Oligonucleotide Synthesis, под ред. M. J. Gait, 1984; Nucleic Acid Hybridization под ред. В. D. Hames и S. J. Higgins, 1985; Transcription And Translation, под ред. В. D. Hames и S. J. Higgins, 1984; Animal Cell Culture, под ред. R. I. Freshney, 1986; Immobilized Cells And Enzymes, изд-во IRL Press, 1986; В. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning, 1984, Current Protocols in Molecular Biology, под ред. F. M. Ausubel и др., изд-во, John Wiley & Sons, Inc., 1994).

Следующим вариантом осуществления настоящего изобретения является также вектор, который содержит любую из описанных выше молекул нуклеино