Композиции моющих средств

Композиции моющих средств

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Данное изобретение относится к композициям, содержащим липазы и оттеночные агенты для ткани, и способам получения и использования таких продуктов.

Известный уровень техники

Появление липазных ферментов, пригодных для использования в моющих средствах, создает для разработчика новые возможности улучшить удаление жиров. Такие ферменты катализируют гидролиз триглицеридов, которые составляют основной компонент многих широко распространенных жировых загрязнений, таких как секрет сальных желез, животные жиры (например, лярд, топленый жир, масло) и растительные масла (например, оливковое масло, подсолнечное масло, арахисовое масло). Однако эти ферменты типично обладают низкой эффективностью в первом цикле стирке и типично приводят к образованию неприятного запаха, возникающего, как считается, в результате гидролиза жиров, присутствующих в пятнах от молочных продуктов, таких как молочные напитки, сливки, масло и йогурты. Без ограничения теорией, считается, что такие загрязнения имеют тенденцию к образованию индуцируемого липазой неприятного запаха, поскольку они содержат триглицериды, функционализированные короткоцепочечными (например, C₄) жирными ацильными звеньями, которые после липолиза высвобождают неприятно пахнущие летучие жирные кислоты. Даже в случае улучшения эффективности таких ферментов проблема неприятного запаха остается. Таким образом, использование этой технологии сильно ограничено.

Мы обнаружили, что комбинация оттеночного агента для ткани с определенными вариантами липаз приводит к улучшению эффективности очистки, в то же время сводя к минимуму неприемлемый неприятный запах. Не желая быть связанными теорией, укажем, что такие полезные эффекты, как считается, вероятно, обеспечиваются следующими механизмами: выбранные варианты липаз повышают степень удаления жира, что приводит к улучшенному доступу оттеночного агента для ткани к поверхности ткани и, благодаря этому, улучшенному отложению. Полученная комбинация улучшенного удаления маслянистых загрязнений и отложения оттеночного красителя приводит к улучшению внешнего вида ткани; даже в случае недостаточного удаления масляных загрязнений гидролиз жиров до более гидрофильных жирных кислот, моно- и диглицеридов приводит к улучшенному отложению оттеночного красителя и, таким образом, ощущению чистоты; и присутствие молекул красителя, откладывающихся в масляные загрязнения, находящиеся на ткани, может ингибировать активность фермента, приводящую к появлению неприятного запаха.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям, содержащим оттеночный агент для ткани и вариант липазы с уменьшенным потенциалом образования запаха и хорошей относительной эффективностью, без присоединения C-концевого удлинения. Вариант липазы получают путем введения мутаций в одну или больше областей, идентифицированных в родительской липазе. Вариант, полученный таким образом, должен иметь липазную активность, равную не менее 80% от активности родительской липазы, выраженной как относительная эффективность.

Краткое описание фигур

Фигура 1 изображает сравнительный анализ первичной структуры липаз.

Перечни последовательностей

SEQ ID NO: 1 изображает последовательность ДНК, кодирующую липазу Thermomyces lanoginosus.

SEQ ID NO: 2 изображает аминокислотную последовательность липазы Thermomyces lanoginosus.

SEQ ID NO: 3 изображает аминокислотную последовательность липазы Absidia reflexa.

SEQ ID NO: 4 изображает аминокислотную последовательность липазы Absidia corymbifera.

SEQ ID NO: 5 изображает аминокислотную последовательность липазы Rhizomucor miehei.

SEQ ID NO: 6 изображает аминокислотную последовательность липазы Rhizopus oryzae.

SEQ ID NO: 7 изображает аминокислотную последовательность липазы Aspergillus niger.

SEQ ID NO: 8 изображает аминокислотную последовательность липазы Aspergillus tubingensis.

SEQ ID NO: 9 изображает аминокислотную последовательность липазы Fusarium oxysporrum.

SEQ ID NO: 10 изображает аминокислотную последовательность липазы Fusarium heterosporum.

SEQ ID NO: 11 изображает аминокислотную последовательность липазы Aspergillus oryzae.

SEQ ID NO: 12 изображает аминокислотную последовательность липазы Penicillium camemberti.

SEQ ID NO: 13 изображает аминокислотную последовательность липазы Aspergillus foetidus.

SEQ ID NO: 14 изображает аминокислотную последовательность липазы Aspergillus niger.

SEQ ID NO: 15 изображает аминокислотную последовательность липазы Aspergillus oryzae.

SEQ ID NO: 16 изображает аминокислотную последовательность липазы Landerina penisapora.

Детальное описание изобретения

Определения

В используемом тут значении термин "моющая композиция" включает, если не указано иное, гранулированные или порошкообразные универсальные или "для тяжелых условий работы" моющие средства, особенно моющие средства для стирки; жидкие, гелевые или пастообразные универсальные моющие средства, особенно так называемые средства жидкого типа для тяжелых условий работы; жидкие моющие средства для тонких легких тканей; средства для мытья посуды вручную или посудомоечные средства для облегченных режимов, особенно сильнопенящегося типа; средства для посудомоечных машин, включая различные таблетированные, гранулированные, жидкие типы и средства для уменьшения количества остающихся на посуде капель для использования в домашних условиях и в учреждениях питания; жидкие моющие и дезинфицирующие агенты, включая антибактериальные средства для ручной стирки, кусковые стиральные средства, жидкости для полоскания рта, очищающие средства для зубов и полости рта, шампуни для мытья машин и ковров, средства для уборки ванной комнаты; шампуни и ополаскиватели для волос; гели для душа и пены для душа и средства для очистки металлов, а также добавки для моющих средств, такие как отбеливающие добавки и "карандаши для выведения пятен" или средства для предварительной обработки.

В используемом тут значении термин "оттеночный агент для ткани" означает красители или пигменты, которые при включении в состав моющих композиций могут откладываться на ткани, когда указанную ткань вводят в контакт с моющим раствором, содержащим указанные моющие композиции, тем самым изменяя оттенок указанной ткани. В целях данной заявки флуоресцентные оптические осветлители не считаются оттеночными агентами для ткани.

В используемом тут значении фраза "независимо выбранный из группы, состоящей из…" означает, что компоненты или элементы, выбранные из указанной группы Маркуша, могут быть одинаковыми, могут быть разными или могут быть любой смесью элементов.

Методики проведения испытаний, раскрытые в разделе Методики проведения испытаний данной заявки, должны использоваться для определения соответствующих значений параметров заявляемых изобретений.

Если не указано иное, все уровни компонентов или композиций относятся к активным уровням данного компонента или композиции и не учитывают примеси, например остаточные растворители или побочные продукты, которые могут присутствовать в коммерчески доступных источниках.

Все величины процентного содержания и соотношения рассчитываются по весу, если не указано иное. Все величины процентного содержания и соотношения рассчитываются по отношению ко всей композиции, если не указано иное.

Следует понимать, что каждый максимальный численный предел, указанный в настоящем описании, включает каждый нижний численный предел, как если бы такие нижние численные пределы были явным образом указаны тут. Каждый минимальный численный предел, указанный в настоящем описании, будет включать каждый верхний численный предел, как если бы такие верхние численные пределы были явным образом указаны тут. Каждый интервал численных значений, приведенный в данном описании, будет включать каждый более узкий интервал численных значений, попадающий в такой более широкий интервал численных значений, как если бы такие более узкие интервалы численных значений были все явным образом указаны тут.

Все цитируемые документы в релевантной части включаются сюда в качестве ссылок; ссылка на любой документ не должна истолковываться как допущение того, что он является известным уровнем техники по отношению к настоящему изобретению.

Композиции

Композиции по настоящему изобретению могут содержать от примерно 0,00003% до примерно 0,1%, от примерно 0,00008% до примерно 0,05%, или даже от примерно 0,0001% до примерно 0,04%, оттеночного агента для ткани и от примерно 0,0005% до примерно 0,1%, от примерно 0,001% до примерно 0,05%, или даже от примерно 0,002% до примерно 0,03%, липазы.

Такие композиции могут иметь любую форму, например форму моющей композиции и/или композиции для обработки.

Остальная часть моющих композиций по любому из вышеупомянутых аспектов состоит из одного или больше вспомогательных материалов.

Пригодные варианты липаз

Липаза композиции по настоящему изобретению представляет собой вариант липазы без C-концевого удлинения, но с мутациями, введенными в определенные области родительской липазы, благодаря чему уменьшается тенденция к образованию запаха.

Родительская липаза

Родительская липаза может быть грибковой липазой с аминокислотной последовательностью, имеющей по меньшей мере 50% гомологии, как определено в разделе "Гомология и сравнительный анализ первичной структуры", с последовательностью липазы Т. lanuginosus, приведенной в SEQ ID NO: 2.

В другом предпочтительном аспекте родительская липаза является липазой Thermomyces.

В более предпочтительном аспекте родительская липаза является липазой Thermomyces lanuginosus. В еще более предпочтительном варианте воплощения родительская липаза представляет собой липазу SEQ ID NO: 2.

Идентификация областей и замещений

Положения, указанные в Области I - Области IV ниже, представляют собой положения аминокислотных остатков в SEQ ID NO: 2. Для того чтобы найти соответствующие (или гомологичные) положения в другой липазе, используют процедуру, описанную в разделе "Гомология и сравнительный анализ первичной структуры".

Замещения в Области I

Область I состоит из аминокислотных остатков, окружающих N-концевой остаток Е1. В этой области предпочтительно замещают аминокислоту родительской липазы на более положительную аминокислоту. Область I охватывает аминокислотные остатки, соответствующие следующим положениям: 1-11 и 223-239. Следующие положения представляют особый интерес: 1, 2, 4, 8, 11, 223, 227, 229, 231, 233, 234 и 236. В частности, были идентифицированы следующие замещения: X1N/*, X4V, X227G, X231R и X233R.

В предпочтительном варианте воплощения родительская липаза имеет по меньшей мере 80%, например 85% или 90%, например по меньшей мере 95%, или 96%, или 97%, или 98%, или 99%, идентичность с SEQ ID NO: 2. В наиболее предпочтительном варианте воплощения родительская липаза идентична SEQ ID NO: 2.

Замещения в Области II

Область II состоит из аминокислотных остатков, контактирующих с субстратом с одного бока ацильной цепи и одного бока спиртовой части. В этой области предпочтительно замещают аминокислоту родительской липазы на более положительную аминокислоту или на менее гидрофобную аминокислоту. Область II охватывает аминокислотные остатки, соответствующие следующим положениям: 202-211 и 249-269. Следующие положения представляют особый интерес: 202, 210, 211, 253, 254, 255, 256, 259. В частности, были идентифицированы следующие замещения: X202G, X210K/W/A, X255Y/V/A, X256K/R и X259G/M/Q/V.

В предпочтительном варианте воплощения родительская липаза имеет по меньшей мере 80%, например 85% или 90%, например по меньшей мере 95%, или 96%, или 97%, или 98%, или 99%, идентичность с SEQ ID NO: 2. В наиболее предпочтительном варианте воплощения родительская липаза идентична SEQ ID NO: 2.

Замещения в Области III

Область III состоит из аминокислотных остатков, которые образуют гибкую структуру и тем самым позволяют субстрату заходить в активный сайт. В этой области предпочтительно замещают аминокислоту родительской липазы на более положительную аминокислоту или на менее гидрофобную аминокислоту. Область III охватывает аминокислотные остатки, соответствующие следующим положениям: 82-102. Следующие положения представляют особый интерес: 83, 86, 87, 90, 91, 95, 96, 99. В частности, были идентифицированы следующие замещения: Х83Т, X86V и X90A/R.

В предпочтительном варианте воплощения родительская липаза имеет по меньшей мере 80%, например 85% или 90%, например по меньшей мере 95%, или 96%, или 97%, или 98%, или 99%, идентичность с SEQ ID NO: 2. В наиболее предпочтительном варианте воплощения родительская липаза идентична SEQ ID NO: 2.

Замещения в Области IV

Область IV состоит из аминокислотных остатков, которые электростатически связываются с поверхностью. В этой области предпочтительно замещают аминокислоту родительской липазы на более положительную аминокислоту. Область IV охватывает аминокислотные остатки, соответствующие следующим положениям: 27 и 54-62. Следующие положения представляют особый интерес: 27, 56, 57, 58, 60. В частности, были идентифицированы следующие замещения: X27R, X58N/AG/T/P и X60V/S/G/N/R/K/A/L.

В предпочтительном варианте воплощения родительская липаза имеет по меньшей мере 80%, например 85% или 90%, например по меньшей мере 95%, или 96%, или 97%, или 98%, или 99%, идентичность с SEQ ID NO: 2. В наиболее предпочтительном варианте воплощения родительская липаза идентична SEQ ID NO: 2.

Аминокислоты в других положениях

Родительская липаза может опционально включать замещения других аминокислот, особенно менее 10 или менее 5 таких замещений. Примерами являются замещения, соответствующие одному или больше из положений 24, 37, 38, 46, 74, 81, 83, 115, 127, 131, 137, 143, 147, 150, 199, 200, 203, 206, 211, 263, 264, 265, 267 и 269 родительской липазы. В конкретном варианте воплощения имеется замещение в по меньшей мере одном из положений, соответствующих положениям 81, 143, 147, 150 и 249. В предпочтительном варианте воплощения по меньшей мере одно замещение выбирают из группы, состоящей из X81Q/E, X143S/C/N/D/A, X147M/Y, X150G/K и X249R/I/L.

Вариант может включать замещения за пределами указанных Областей I-IV, причем число замещений за пределами указанных Областей I-IV предпочтительно составляет менее шести, или менее пяти, или менее четырех, или менее трех, или менее двух, например пять, или четыре, или три, или два, или одно. Альтернативно, вариант не включает каких-либо замещений за пределами указанных Областей I-IV.

Другие замещения могут, например, быть осуществлены в соответствии с принципами, известными специалистам, например замещения, описанные в WO 92/05249, WO 94/25577, WO 95/22615, WO 97/04079 и WO 97/07202.

Родительские варианты липаз

В одном аспекте указанный вариант, по сравнению с указанным родительским, содержит в общем по меньшей мере три замещения, причем указанные замещения выбирают из одной или больше из следующих групп замещений:

a) по меньшей мере двух, или по меньшей мере трех, или по меньшей мере четырех, или по меньшей мере пяти, или по меньшей мере шести, например двух, трех, четырех, пяти или шести замещений в Области I,

b) по меньшей мере одного, по меньшей мере двух, или по меньшей мере трех, или по меньшей мере четырех, или по меньшей мере пяти, или по меньшей мере шести, например одного, двух, трех, четырех, пяти или шести замещений в Области II,

c) по меньшей мере одного, по меньшей мере двух, или по меньшей мере трех, или по меньшей мере четырех, или по меньшей мере пяти, или по меньшей мере шести, например одного, двух, трех, четырех, пяти или шести замещений в Области III,

d) и/или по меньшей мере одного, по меньшей мере двух, или по меньшей мере трех, или по меньшей мере четырех, или по меньшей мере пяти, или по меньшей мере шести, например одного, двух, трех, четырех, пяти или шести замещений в Области IV.

Вариант может включать замещения, по сравнению с родительским вариантом, соответствующие замещениям, перечисленным ниже в Таблице 1.

Таблица 1
Некоторые конкретные варианты
Область I	Область II	Область III	Область IV	За пределами областей
X4V+X227G+X231R+233R	X210K+X256K	Х83Т+X86V	Х58А+X60S	X150G
X227G+X231R+X233R	X256K	X86V	X58N+X60S	X150G
X231R+X233R	X255Y
X231R+X233R	X202G
X227G+X231R+X233R	X256K	X86V
X4V+X231R+X233R			X58N+X60S
X231R+X233R		X90R	X58N+X60S
X231R+X233R	X255V	Х90А
X227G+X231R+X233R	X256K	X86V	X58N+X60S	X150G
X231R+X233R	X211L		X58N+X60S	Х147М
X231R+X233R				X150K

В следующем конкретном варианте воплощения родительская липаза идентична SEQ ID NO: 2 и варианты из Таблицы 1 будут, таким образом, представлять:

Таблица 2
Некоторые конкретные варианты SEQ ID NO: 2
Область I	Область II	Область III	Область IV	За пределами областей
Q4V+L227G+T231R+N233R	E210K+P256K	S83T+I86V	S58A+V60S	A150G
L227G+T231R+N233R	P256K	I86V	S58N+V60S	A150G
T231R+N233R	I255Y
T231R+N233R	I202G
L227G+T231R+N233R	P256K	I86V
Q4V+T231R+N233R			S58N+V60S
T231R+N233R		I90R	S58N+V60S
T231R+N233R	I255V	I90A
L227G+T231R+N233R	P256K	I86V	S58N+V60S	A150G
T231R+N233R	F211L		S58N+V60S	L147M
X231R+X233R				X150K

Номенклатура аминокислотных модификаций

При описании вариантов липаз в соответствии с изобретением для удобства указания используют следующую номенклатуру: Исходная аминокислота(ы):положение(я):замещенная аминокислота(ы).

В соответствии с этой номенклатурой, например, замещение глутаминовой кислоты на глицин в положении 195 описывается как G195E. Делеция глицина в том же положении описывается как G195*, и инсерция дополнительного аминокислотного остатка, такого как лизин, описывается как G195GK. В тех случаях, когда конкретная липаза содержит "делецию" по сравнению с другими липазами и выполняется инсерция в таком положении, это обозначается как *36D для инсерции аспарагиновой кислоты в положении 36. Многочисленные мутации разделены плюсами, т.е.: R170Y+G195E обозначает мутации в положениях 170 и 195 с замещением тирозина и глутаминовой кислоты на аргинин и глицин соответственно.

Х231 указывает аминокислоту в родительском полипептиде, соответствующую положению 231, при применении описанной процедуры сравнительного анализа первичной структуры. X231R указывает, что аминокислота замещается на R. Для SEQ ID NO: 2 X обозначает Т и X231R, таким образом, указывает замещение Т в положении 231 на R. В тех случаях, когда аминокислота в положении (например, 231) может быть замещена на другую аминокислоту, выбранную из группы аминокислот, например группы, состоящей из R, Р и Y, это будет обозначено как X231R/P/Y.

Во всех случаях используются принятые IUPAC однобуквенные или трехбуквенные сокращенные обозначения аминокислот.

Деление аминокислот на группы

В данном описании аминокислоты классифицируются как отрицательно заряженные, положительно заряженные или электрически нейтральные, в соответствии с их электрическим зарядом при pH 10. Таким образом, отрицательно заряженными аминокислотами являются Е, D, С (цистеин) и Y, особенно Е и D. Положительно заряженными аминокислотами являются R, K и Н, особенно R и K. Нейтральными аминокислотами являются G, А, V, L, I, Р, F, W, S, Т, М, N, Q и С, когда он образует часть дисульфидного мостика. Замещение на другую аминокислоту из той же группы (отрицательно заряженной, положительно заряженной или нейтральной) называется консервативным замещением.

Нейтральные аминокислоты могут быть разделены на гидрофобные или неполярные (G, А, V, L, I, Р, F, W и С как часть дисульфидного мостика) и гидрофильные или полярные (S, Т, М, N, Q). В данном описании аминокислоты классифицируются как отрицательно заряженные, положительно заряженные или электрически нейтральные в соответствии с их электрическим зарядом при pH 10. Таким образом, отрицательно заряженными аминокислотами являются Е, D, С (цистеин) и Y, особенно Е и D. Положительно заряженными аминокислотами являются R, K и Н, особенно R и K. Нейтральными аминокислотами являются G, А, V, L, I, Р, F, W, S, Т, М, N, Q и С, когда он образует часть дисульфидного мостика. Замещение на другую аминокислоту из той же группы (отрицательно заряженной, положительно заряженной или нейтральной) называется консервативным замещением.

Нейтральные аминокислоты могут быть разделены на гидрофобные или неполярные (G, А, V, L, I, Р, F, W и С как часть дисульфидного мостика) и гидрофильные или полярные (S, Т, М, N, Q).

Аминокислотная идентичность

Степень сродства между двумя аминокислотными последовательностями или между двумя нуклеотидными последовательностями описывается параметром "идентичность".

В целях настоящего изобретения сравнительный анализ первичной структуры двух аминокислотных последовательностей осуществляется с использованием программы Needle из пакета EMBOSS (http://emboss.org), версия 2.8.0. Программа Needle реализует алгоритм глобального сравнения, описанный Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970), J. Mol. Biol., 48, 443-453. Используется матрица замещения BLOSUM62, штраф за начало разрыва равен 10 и штраф за продолжение разрыва равен 0,5.

Степень идентичности между аминокислотными последовательностями по настоящему изобретению ("последовательность по изобретению"; например, аминокислоты 1-269 SEQ ID NO: 2) и отличной от них аминокислотной последовательностью ("чужеродная последовательность") рассчитывается как число точных совпадений при сравнительном анализе первичной структуры двух последовательностей, деленное на длину "последовательности по изобретению" или длину "чужеродной последовательности", в зависимости от того, какая из них короче. Результат выражают в процентах идентичности.

Точное совпадение наблюдается тогда, когда "последовательность по изобретению" и "чужеродная последовательность" имеют идентичные аминокислотные остатки в одинаковых положениях участка перекрывания. Длина последовательности равна числу аминокислотных остатков в последовательности (например, длина SEQ ID NO: 2 равна 269).

Родительская липаза имеет аминокислотную идентичность по меньшей мере 50% с липазой Т. lanuginosus (SEQ ID NO: 2), особенно по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, более 95% или более 98%. В конкретном варианте воплощения родительская липаза идентична липазе Т. lanuginosus (SEQ ID NO: 2).

Описанная выше процедура может быть использована для расчета идентичности, а также гомологии и для сравнительного анализа первичной структуры. В контексте настоящего изобретения гомология и сравнительный анализ первичной структуры рассчитывались, как описано ниже.

Гомология и сравнительный анализ первичной структуры

В целях настоящего изобретения степень гомологии может быть удобно определена с помощью компьютерных программ, известных специалистам, таких как GAP, входящая в программный пакет GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45), при использовании GAP со следующими настройками для сравнения полипептидных последовательностей: штраф за создание разрыва 3,0 и штраф за продолжение разрыва 0,1.

В настоящем изобретении соответствующие (или гомологичные) положения в последовательностях липаз Absidia reflexa, Absidia corymbefera, Rhizmucor miehei, Rhizopus delemar, Aspergillus niger, Aspergillus tubigensis, Fusarium oxysporum, Fusarium heterosporum, Aspergillus oryzea, Penicilium camembertii, Aspergillus foetidus, Aspergillus niger, Thermomyces lanoginosus (синоним: Humicola lanuginose) и Landerina penisapora определяют с помощью сравнительного анализа первичной структуры, показанного на Фигуре 1.

Для того чтобы найти гомологичные положения в последовательностях липаз, не показанных в сравнительном анализе первичной структуры, последовательность, представляющую интерес, сравнивают с последовательностями, изображенными на Фигуре 1. Новую последовательность сопоставляют с первичной структурой по настоящему изобретению на Фигуре 1, используя сравнительный анализ первичной структуры методом GAP для наиболее гомологичной последовательности, найденной с помощью программы GAP. GAP входит в программный пакет GCG (Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D. (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-45). Для сравнения полипептидных последовательностей используются следующие параметры настройки: штраф за создание разрыва 3,0 и штраф за продолжение разрыва 0,1.

Родительская липаза имеет гомологию по меньшей мере 50% с липазой Т. lanuginosus (SEQ ID NO: 2), особенно по меньшей мере 55%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 75%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, более 95% или более 98%. В конкретном варианте воплощения родительская липаза идентична липазе Т. lanuginosus (SEQ ID NO: 2).

Гибридизация

Настоящее изобретение также относится к изолированным полипептидам, обладающим липазной активностью, которые кодируются полинуклеотидами, гибридизующимися в условиях очень низкой жесткости, предпочтительно условиях низкой жесткости, предпочтительнее условиях средней жесткости, предпочтительнее условиях средневысокой жесткости, еще предпочтительнее условиях высокой жесткости и наиболее предпочтительно условиях очень высокой жесткости, с (i) нуклеотидами 178-660 SEQ ID NO: 1, (ii) последовательностью кДНК, содержащейся в нуклеотидах 178-660 SEQ ID NO: 1, (iii) подпоследовательностью (i) или (ii) или (iv) комплементарной цепью (i), (ii) или (iii) (J.Sambrook, E.F.Fritsch and T.Maniatus, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor, New York). Подпоследовательность SEQ ID NO: 1 содержит по меньшей мере 100 непрерывных нуклеотидов или предпочтительно по меньшей мере 200 непрерывных нуклеотидов. Кроме того, подпоследовательность может кодировать полипептидный фрагмент, обладающий липазной активностью.

Для длинных зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов условия от очень низкой до очень высокой жесткости определяются как предгибридизация и гибридизация при 42°C в 5×SSPE, 0,3% SDS, 200 мкг/мл деградированной с помощью гидродинамического сдвига и денатурированной ДНК спермы лосося и или 25% формамида для условий очень низкой и низкой жесткости, или 35% для условий средней и средневысокой жесткости, или 50% формамида для высокой и очень высокой жесткости оптимально в соответствии со стандартными процедурами саузерн-блоттинга в течение от 12 до 24 часов.

Для длинных зондов длиной по меньшей мере 100 нуклеотидов материал носителя в конце промывают три раза по 15 минут с использованием 2×SSC, 0,2% SDS, предпочтительно при по меньшей мере 45°C (очень низкая жесткость), предпочтительнее при по меньшей мере 50°C (низкая жесткость), предпочтительнее при по меньшей мере 55°C (средняя жесткость), предпочтительнее при по меньшей мере 60°C (средневысокая жесткость), еще предпочтительнее при по меньшей мере 65°C (высокая жесткость) и наиболее предпочтительно при по меньшей мере 70°C (очень высокая жесткость).

Последовательность ДНК, вектор экспрессии, клетка-хозяин, продуцирование липазы

Изобретение предусматривает последовательность ДНК, кодирующую липазу по изобретению, вектор экспрессии, включающий последовательность ДНК, и трансформированную клетку-хозяина, содержащую последовательность ДНК или вектор экспрессии. Они могут быть получены с помощью методов, известных специалистам. Изобретение также предусматривает способ продуцирования липазы путем культивации трансформированной клетки-хозяина в условиях, способствующих продуцированию липазы, и выделения липазы из полученной среды. Способ может быть осуществлен в соответствии с принципами, известными специалистам.

Липазная активность

- Липазная активность по трибутирину при нейтральном pH (LU)

Субстрат для липазы готовят путем эмульгирования трибутирина (глицеринтрибутират) с использованием гуммиарабика в качестве эмульгатора. Гидролиз трибутирина при 30°C и pH 7 или 9 отслеживают с помощью титровального эксперимента в pH-стате. Единица липазной активности (1 LU) равняется количеству фермента, способного выделять 1 мкмоль масляной кислоты/мин при pH 7.

- Польза-Риск

Соотношение Польза-Риск, описывающее эффективность по сравнению с уменьшенным риском запаха, определяется как: BR=RP_avg/R. Варианты липаз, описанные в настоящем изобретении, могут иметь BRs больше 1, больше 1,1 или даже от больше 1 до примерно 1000.

- Средняя относительная эффективность

Процедура расчета средней относительной эффективности (RP_avg) приведена в примере 5 настоящего описания. Варианты липаз, описанные в настоящем изобретении, могут иметь (RP_avg) по меньшей мере 0,8, по меньшей мере 1,1, по меньшей мере 1,5 или даже от по меньшей мере 2 до примерно 1000.

Пригодные оттеночные агенты для ткани

Флуоресцентные оптические осветлители излучают по меньшей мере некоторую часть видимого света. В отличие от них, оттеночные агенты для ткани могут изменять оттенок поверхности за счет поглощения по меньшей мере части спектра видимого света. Пригодные оттеночные агенты для ткани включают красители, конъюгаты краситель-глина и пигменты, удовлетворяющие требованиям Метода испытаний 1 в разделе Методы испытаний настоящего описания. Пригодные красители включают красители с малыми молекулами и полимерные красители. Пригодные красители с малыми молекулами включают красители с малыми молекулами, выбранные из группы, состоящей из:

(1) Трис-азо прямые синие красители формулы

где по меньшей мере два из нафтильных колец А, В и С замещены сульфонатной группой, кольцо С может быть замещено в положении 5 группой NH₂ или NHPh, X обозначает бензильное или нафтильное кольцо, замещенное до 2 сульфонатных групп, и может быть замещено в положении 2 группой ОН и также может быть замещено группой NH₂ или NHPh.

(2) Бис-азо прямые фиолетовые красители формулы:

где Z обозначает Н или фенил, кольцо А предпочтительно замещено метильной и метоксигруппой в положениях, указанных стрелочками, кольцо А также может быть нафтильным кольцом, группа Y представляет собой бензильное или нафтильное кольцо, замещенное сульфатной группой, и может быть моно- или дизамещенной метильными группами.

(3) Синие или красные кислотные красители формулы

где по меньшей мере один из Х и Y должен быть ароматической группой. В одном аспекте обе ароматические группы могут быть замещены бензильной или нафтильной группой, которая может быть замещена не солюбилизирующимися в воде группами, такими как алкильные, или алкилокси-, или арилоксигруппы, Х и Y не могут быть замещены солюбилизирующимися в воде группами, такими как сульфонаты или карбоксилаты. В другом аспекте Х представляет собой нитрозамещенную бензильную группу и Y обозначает бензильную группу.

(4) Красные кислотные красители структуры

или

где В является нафтильной или бензильной группой, которая может быть замещена не солюбилизирующимися в воде группами, такими как алкильные, или алкилокси-, или арилоксигруппы, В не могут быть замещены солюбилизирующимися в воде группами, такими как сульфонаты или карбоксилаты.

(5) Дис-азо красители структуры

или

где Х и Y, независимо друг от друга, обозначают каждый водород, C₁-C₄-алкил или C₁-С₄-алкокси, Rα обозначает водород или арил, Z обозначает С₁-С₄-алкил; C₁-C₄-алкокси; галоген; гидроксил или карбоксил, n равен 1 или 2 и m равен 0, 1 или 2, а также их соответствующие соли и их смеси.

(6) Трифенилметановые красители следующих структур

,

,

,

,

и/или

и их смеси. В другом аспекте пригодные красители с малыми молекулами включают красители с малыми молекулами, выбранные из группы, состоящей из красителей с номерами по Colour Index (Society of Dyers and Colourists, Bradford, UK) прямого фиолетового 9, прямого фиолетового 35, прямого фиолетового 48, прямого фиолетового 51, прямого фиолетового 66, прямого синего 1, прямого синего 71, прямого синего 80, прямого синего 279, кислотного красного 17, кислотного красного 88, кислотного красного 150, кислотного фиолетового 15, кислотного фиолетового 17, кислотного фиолетового 24, кислотного фиолетового 49, кислотного синего 15, кислотного синего 17, кислотного синего 29, кислотного синего 40, кислотного синего 75, кислотного синего 80, кислотного синего 83, кислотного синего 90 и кислотного синего 113, основного фиолетового 1, основного фиолетового 3, основного фиолетового 4, основного фиолетового 10, основного фиолетового 35, основного синего 3, основного синего 16, основного синего 22, основного синего 47, основного синего 66, основного синего 75, основного синего 159 и их смесей.

Пригодные полимерные красители включают полимерные красители, выбранные из группы, состоящей из полимеров, содержащих конъюгированные хромогены (конъюгаты краситель-полимер), и полимеров с хромогенами, сополимеризованными в основную цепь полимера, и их смеси.

В другом аспекте пригодные полимерные красители включают полимерные красители, выбранные из группы, состоящей из субстантивных красителей для тканей, продаваемых под наименованием Liquitint® (Milliken, Spartanburg, South Carolina, USA), конъюгаты краситель-полимер, образованные из по меньшей мере одного реакционно-способного красителя и полимера, выбранного из группы, состоящей из полимеров, включающих фрагмент, выбранный из группы, состоящей из гидроксильной группы, первичной аминогруппы, вторичной аминогруппы, тиольной группы и их смесей. В еще одном аспекте пригодные полимерные красители включают полимерные красители, выбранные из группы, состоящей из Liquitint® (Milliken, Spartanburg, South Carolina, USA), фиолетовый CT, карбоксиметилцеллюлозы (CMC), конъюгированной с реактивным синим, реактивным фиолетовым или реактивным красным красителем, такой как CMC, конъюгированная с CL реактивным синим 19, которая продается фирмой Megazyme, Wicklow, Ireland, под торговым знаком AZO-CM-CELLULOSE, код продукта S-ACMC, и их смеси.

Пригодные конъюгаты краситель-глина включают конъюгаты краситель-глина, выбранные из группы, включающей по меньшей мере один катионный/основный краситель и смектитную глину и их смеси. В другом аспекте пригодные конъюгаты краситель-глина включают конъюгаты краситель-глина, выбранные из группы, состоящей из одного катионного/основного красителя, выбранного из группы, состоящей из основных желтых C.I. 1-108, основных оранжевых C.I. 1-69, основных красных C.I. 1-118, основных фиолетовых C.I. 1-51, основных синих C.I. 1-164, основных зеленых C.I. 1-14, основных коричневых C.I. 1-23, основных черных C.I. 1-11, и глины, выбранной из группы, состоящей из монтмориллонитовой глины, гекторитовой глины, сапонитовой глины и их смесей. В еще одном аспекте пригодные конъюгаты краситель-глина включают конъюгаты краситель-глина, выбранные из группы, состоящей из конъюгата монтмориллонита и основного синего В7 C.I. 42595, конъюгата монтмориллонита и основного синего В9 C.I. 52015, конъюгата монтмориллонита и основного фиолетового V3 C.I. 42555, конъюгата монтмориллонита и основного зеленого G1 C.I. 42040, конъюгата монтмориллонита и основного красного R1 C.I. 45160, конъюгата монтмориллонита и основного черного C.I. 2, конъюгата гекторита и основного синего В7 C.I. 42595, конъюгата гекторита и основного синего В9 C.I. 52015, конъюгата гекторита и основного фиолетового V3 C.I. 42555, конъюгата гекторита и основного зеленого G1 C.I. 42040, конъюгата гекторита и основного красного R1 C.I. 45160, конъюгата гекторита и основного черного C.I. 2, конъюгата сапонита и основного синего В7 C.I. 42595, конъюгата сапонита и основного синего В9 C.I. 52015, конъюгата сапонита и основного фиолетового V3 C.I. 42555, конъюгата сапонита и основного зеленого G1 C.I. 42040, конъюгата сапонита и основного красного R1 C.I. 45160, конъюгата сапонита и основного черного C.I. 2, и их смеси.

Пригодные пигменты включают пигменты, выбранные из группы, состо