Способ раннего прогнозирования исходов противовирусной терапии хронического вирусного гепатита "с"

Способ раннего прогнозирования исходов противовирусной терапии хронического вирусного гепатита "с"

Реферат

Предлагаемое изобретение относится к медицине, а именно к инфекционным заболеваниям, гепатологии, и может быть использовано при лечении хронического вирусного гепатита «С» (ХВГ «С»). Способ позволяет с высокой точностью прогнозировать исход противовирусной терапии до ее начала, тем самым предотвращая проведение заведомо неэффективного дорогостоящего лечения и нерационального расходования денежных средств. Кроме того, способ доступен и прост в исполнении, поскольку основывается на результатах стандартных общепринятых лабораторных методов.

Проблема противовирусной терапии больных хроническим вирусным гепатитом «С» (ХВГ «С») остро стоит в современной гепатологии в связи с тем, что остается достаточно многочисленная группа пациентов, не отвечающих на лечение или демонстрирующих рецидив заболевания после прекращения терапии.

В настоящее время фармакотерапия больных ХВГС определена стандартами, которые предусматривают использование препаратов рекомбинантных α-интерферонов в комбинации с аналогами нуклеозидов. Высокая стоимость и недостаточная эффективность противовирусной терапии обусловливает исследования в плане изыскания предикторов ее исходов.

С учетом того, что интерферонотерапия напрямую воздействует на иммунную систему больного, еще более актуален поиск иммунологических критериев как предикторов эффективности до начала противовирусной терапии, поскольку подход с позиций исходного иммунологического фона позволяет с высокой достоверностью прогнозировать эффективность лечения с учетом индивидуального уровня иммунного ответа и позволяет избежать нерационального использования денежных средств

Аналог.

Известно решение задачи выбора тактики лечения больных хроническим вирусным гепатитом В и С на основе прогнозирования эффективности противовирусного лечения путем определения анатомических, анамнестических, иммунологических, биохимических данных (С.Н.Соринсон. Вирусные гепатиты. - СПб.: ТЕЗА. 1998. С.147, 234; В.Т.Ивашкин. Комбинированное лечение хронического гепатита В // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 1998. - №5. - С.57-60).

При этом прогностически благоприятными, в плане выбора интерферонотерапии, считают следующие факторы:

- женский пол, молодой возраст, низкий вес, генотип не 1 (при хроническом вирусном гепатите С),

- продолжительность заболевания (до 2-х лет),

- повышение активности трансаминаз более чем в 2 раза,

- низкая концентрация вирусов в крови,

- отсутствие иммунодефицитного состояния,

- низкое содержание железа в сыворотке крови.

Данный способ прогнозирования позволяет оценить возможную эффективность противовирусной терапии до ее начала, однако имеет определенные недостатки, объективно снижающие его достоверность.

Недостатком данного способа является прежде всего то, что он основан на сложной субъективной интегральной оценке клинических показателей, и, в целом, не на объективном, а на субъективном подходе к больному без оценки исходного состояния его иммунной системы.

За ближайший аналог предлагаемого способа раннего прогнозирования эффективности интерферонотерапии ХВГ С выбран способ, включающий определение иммунологических показателей крови ребенка (А.С.Журкин, С.В.Соловьев. Продукция цитокинов и интерферонотерапия у больных хроническими вирусными гепатитами // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 1999. - №5. - С.27-29).

Данный способ основан на определении цитокинового статуса, поскольку установлено, что у детей с хроническим вирусным гепатитом С, достигших первичной вирусологической ремиссии, определялись исходно повышенные уровни содержания интерлейкина-4, интерлейкина-6, интерлейкина-8, фактора некроза опухоли, и также отмечено повышение этих показателей в крови у детей, ответивших на терапию.

Недостатками данного способа являются дорогостоящее оборудование и реактивы, сложность проведения исследований, малая доступность определения предложенных показателей в условиях клинической лаборатории лечебного учреждения.

Кроме того, данные критерии недостоверны в виде прогностических ввиду противоречивости, выявленной в результате их использования на практике с этой целью. Но данным литературы, не отмечено достоверных различий показателей цитокинов интерлейкина-1, интерлейкина-6, интерлейкина-10, фактора некроза опухоли у больных с позитивным и негативным ответами на интерферонотерапию. Таким образом, данный способ не обладает прогностической точностью.

Задачи.

Достоверное прогнозирование эффективности противовирусной терапии до ее начала но результатам исследования исходного иммунологического фона пациента и генотипирования вируса гепатита С.

Техническим результатом изобретения является:

- Высокая достоверность прогнозирования эффективности противовирусной терапии хронического вирусного гепатита С до ее начала.

- Предотвращение нерационального расходования денежных средств - исключение проведения заведомо неэффективной противовирусной терапии.

Сущностью изобретения является то, что в комплексе определяют до начала противовирусной терапии количество В-лимфоцитов (CD₁₉), Т-лимфоцитов-супрессоров (CD₈), натуральных киллеров (CD₁₆), содержание циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК), уровень иммуноглобулина A (IgA) и процент фагоцитоза (Ф%), затем но сумме постоянных весовых коэффициентов указанных показателей определяют коэффициент иммунологического прогноза (КИП);

Способ раннего прогнозирования исходов противовирусной терапии хронического вирусного гепатита «С» по КИП апробирован более чем на 300 больных, проходивших стандартную противовирусную терапию в рамках Национального проекта «Здоровье» на базе ГБУЗ «Специализированная клиническая инфекционная больница» г.Краснодара. Доказана достоверность способа путем ретроспективного анализа 460 историй болезни. Выявлено, что достоверность составила p<0,05.

Способ осуществляют следующим образом.

До начала противовирусной терапии больному выполняют генотипирование вируса HCV (это исследование входит в Международный стандарт противовирусной терапии) и стандартное исследование иммунного статуса в клинической лаборатории, включающее определение показателей гуморального и клеточного иммунитета, функцию фагоцитоза и определение количества ЦИК. Далее проводят сравнительную опенку иммунологических показателей с учетом норм по лаборатории, выполнявшей исследование, и определяют коэффициент иммунологического прогноза (КИП) эффективности противовирусной терапии в каждом конкретном случае.

Исследуемый материал: периферическая венозная кровь. Взятие крови производят в асептических условиях из вены локтевого сгиба в стерильные силиконизированные пробирки. В одну из них предварительно вносят 0,2 мл. раствора ЭДТА, затем добавляют 5 мл венозной крови. В другую (сухую) пробирку вносят 3 мл крови.

Оценку состояния клеточного звена иммунитета производят с применением моноклональных антител к CD₃-, CD₄-, CD₈-, CD₁₆-, CD₁₉-рецепторам лимфоцитов.

Ход исследования

Гепаринизированную кровь смешивают в объемном соотношении 2:1 с 3% раствором желатина на среде 199, перемешивают и помещают на 20-25 минут в термостат при температуре +37°C. После расслаивания верхний слой осторожно переносят пастеровской пипеткой в центрифужные пробирки и центрифугируют 10 минут при 1000 об/мин на холоде. Для удаления эритроцитов осадок ресуспендируют в 1 мл в 1 мл гемолитического буфера или в 0,5 мл дистиллированной воды (время воздействия 20-30 с) с последующим разбавлением 20-кратным объемом забуференного фосфатами физиологического раствора (ЗФР). Клетки осаждают центрифугированием при 400-430 об/мин в течение 20 минут на холоде и собирают в интерфазу, содержащую лимфоциты, при помощи пастеровской пипетки. Полученную суспензию лимфоцитов трижды отмывают в ЗФР.

Выделенные лимфоциты ресуспендируют в необходимом объеме ЗФР, доводя их концентрацию до 1-2 млн/мл и вносят но 100 мл клеточных суспензий в U-образные лунки 96-луночпого планшета. Планшеты центрифугируют на холоде в течение 2 минут при 1000 об/мин, супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 100 мкл моноклональных антител требуемого разведения на забуференном фосфатами изотоническом растворе с 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,02% азида натрия. Клетки инкубируют с антителами при +4°C в течение 30 минут с периодическим осторожным встряхиванием. После окончания срока инкубации клетки центрифугируют при +4°C в течение 2 минут, осадок ресуспендируют в 150-200 мкл ЗФР или среды 199, осаждают, подвергают повторной отмывке.

Полученные фиксированные пробы анализируют под микроскопом в ультрафиолетовом свете. Для оценки результатов реакции с достаточной степенью достоверности необходимо подсчитать не менее 200-300 клеток в каждой пробе.

Физиологические нормы относительного содержания лимфоцитов, принятые в лаборатории:

- CD₃ - 40-67%;

- CD₄ - 23-48%;

- CD₈ - 12-25%;

- CD₁₆ - 9-15%;

- CD₁₉ - 3-13%.

Титр иммуноглобулинов классов А, М, G вычисляют математически на основе данных радиальной иммунодиффузии в агаровом геле но методу Манчини.

Ход исследования

При температуре 55-56°C смешивают агар с соответствующей антисывороткой в соотношении 3:1. Быстро выливают смесь в стеклянную чашку Петри, лежащую на горизонтальном столе. После застывания агара в нем по трафарету пробойником выбивают 33 лунки, в каждую лунку пастеровской пипеткой вносят но 5 мл испытуемой сыворотки, в средние четыре лунки добавляют в 4-кратных разведениях тест-сыворотку с известным содержанием иммуноглобулинов. После этого чашки помещают во влажную среду в строго горизонтальном положении на 24-48 часов при 4°C (для IgA и IgG - 24 часа, для IgM - 48 часов). Через 24-48 часов реакцию учитывают. При косом освещении кольцо преципитации становится видимым и измеряется линейкой. По диаметру кольца вокруг лунок с тест-сывороткой строят калибровочную кривую на полулогарифмической бумаге. При ее построении учитывают то обстоятельство, что в определенном интервале концентрации иммуноглобулинов диаметр кольца прямо пропорционален логарифму концентрации иммуноглобулинов.

После измерения диаметра кольца в испытуемых пробах но калибровочной кривой оценивают концентрацию иммуноглобулина соответствующего класса в исследуемых образцах.

Концентрацию выражают в МЕ или в мг белка на 100 мл (мг%) или г/л (система СИ).

Физиологически нормальное содержание иммуноглобулинов:

- IgA - 1,5-3,0 г/л;

- IgG - 7,7-12,0 г/л;

- IgM - 0,6-2,5 г/л.

Уровень содержания в сыворотке крови общей фракции циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) оценивают методом преципитации 3,5% раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ).

Необходимые материалы и оборудование:

- изотонический раствор натрия хлорида;

- 7% раствор ПЭГ;

- 0,1 н. раствор едкого натрия;

- центрифуга;

- спектрофотометр;

- центрифужные пробирки;

- пипетки емкостью 1 мл и 5 мл.

Реактивы.

7% раствор ПЭГ: 7 г ПЭГ растворяют 100 мл боратного буфера (рН 8,4). Боратный буфер готовят путем смешивания 55 мл 1,24% раствора борной кислоты и 45 мл 1,9% раствора буры, доводят до 200 мл дистиллированной водой. 3,5% раствор ПЭГ: 20 мл 7% раствора ПЭГ и 20 мл боратного буфера. 0,1 н. раствора едкого натрия: 4 г NaOH разводят в 1 мл дистиллированной воды.

Постановка метода

Сыворотку крови разводят изотоническим раствором хлорида натрия в соотношении 1:25 (0,1 мл + 2,5 мл). Разведенную сыворотку смешивают с 7% раствором ПЭГ в соотношении 1:1 (0,5 мл + 0,5 мл). Для проведения реакции преципитации пробирки помещают в холодильник при 4°C на 18 часов. Пробирки центрифугируют 15 минут при 1500 об/мин и удаляют надосадочную жидкость. Далее осадок растворяют в 2,5 мл 0,1 н. раствора NaOH, очень тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре не менее чем на 30 минут. Пробы замеряют на спектрофотометре, длина волны 280 нм против 0,1 н. раствора NaOH. Уровни ЦИК выражают в единицах оптической плотности. Уровни ЦИК, определенные методом преципитации 3,5% раствором ПЭК, в норме составляют 0,017-0,047 единиц оптической плотности.

Поглотительную активность нейтрофильных гранулоцитов и степень завершенности фагоцитоза исследуют с помощью реакции с живой культурой золотистого стафилококка (штамм 209).

Ход исследования

Каплю венозной крови в количестве 0,1 мл помешают на чистое обезжиренное покровное стекло. Его выдерживают во влажной камере при 37°C 45 минут, после чего образовавшийся сгусток осторожно удаляют пинцетом. Покровное стекло с прикрепленными нейтрофилами промывают в растворе Хенкса, наносят расчетную дозу суточной культуры Staf. aurens и снова помещают во влажную камеру при 37°C па 30 минут. После инкубации стекло промывают в растворе Хенкса для удаления непоглощенных частиц и высушивают. Высушенный препарат фиксируют и красят по Романовскому-Гимзе.

Учет фагоцитарной активности проводят, определяя процент нейтрофилов с фагоцитарным материалом - фагоцитарное число - и количество поглощенных частиц из расчета на один нейтрофил - фагоцитарный индекс.

В каждом препарате подсчитывают не менее 200 клеток. Физиологические нормы по лаборатории:

- процент фагоцитоза - 40-80%;

- фагоцитарное число - 2,2-6;

- фагоцитарный индекс - 1,4-2,5;

- переваривающая активность - более 50%;

- индекс переваривания - 1,3-2,0.

Дизайн исследования был построен таким образом, что 64 больных хроническим вирусным гепатитом «С», которые начали противовирусную терапию после предварительного исследования иммунологических показателей, ретроспективно (по исходам терапии) были разделены на две группы - с благоприятным и неблагоприятным результатом лечения. Далее для каждого параметра в каждой группе были введены минимальные и максимальные значения интервала нормы, затем для каждого пациента вычислен квадрат отклонения каждого показателя, т.е. квадрат отклонения в большую сторону от максимального и в меньшую от минимального значений. По каждому параметру в группах было подсчитано количество «нулевых» и «ненулевых» значений, и вычислен «весовой» коэффициент, который является отношением количества «нулевых» и «ненулевых» значений к количеству «ненулевых» значений. Поскольку «весовой» коэффициент каждого параметра находится в границах от 0 до 1, показатели нормированы, и коэффициенты имеют фиксированные величины.

Коэффициент иммунологического прогноза определяется по формуле:

КИП=W(генС)+W(CD₁₉)+W(CD₈)+W(CD₁₆)+W(ЦИК)+W(IgA)+W(Ф%),

Где W - коэффициент, равный «нулю» при отсутствии отклонений показателя от границ его нормы, а при отклонении от нормы - ниже минимального или выше максимального значения, равный:

W(CD₁₉) - 0,54; W(CD₈) - 0,8; W(CD₁₆) - 0,2; W(ЦИК) - 0,41;

W(IgA) - 0,73; W(Ф%) - 0,76.

Для весового показателя генотипа вируса гепатита С (WгенC) определены соответствующие значения:

- при генотипе вируса гепатита С «1b» WгенC=0,7;

- при генотипе вируса гепатита С «3а» WгенC=0,29;

- при генотипе вируса гепатита С «2а» или «неопределенном» WгенC=0,1.

При значении КИП 1,2÷3,2 определяют благоприятный прогноз исхода лечения, при значениях КИП 3,3÷3,9 возможен рецидив, а при КИП более 3,9 определяют неблагоприятный прогноз.

Работоспособность способа демонстрируется на клинических примерах.

Пример 1.

Больной К., история болезни №Г-2475, 34 лет, с диагнозом: Хронический вирусный гепатит «С», репликативная фаза, умеренной степени активности. До начала противовирусной терапии проведено определение генотипа вируса гепатита С (3а) и исследование иммунного статуса (результаты исследований приведены в таблице 1).

Таблица 1.
Показатель	Значение показателя у больного	Норма
CD19	19	3-13%.
CD8	22	12-25%
CD16	12	9-15%;
ЦИК	0,05	0,017-0,047 ед. опт. плотн.
IgA	1,7	1,5-3,0 г/л
% фагоцитоза	50	40-80%;

Исходя из приведенных значений, W(генС)=0,29, W(CD₁₉)=0,54; W(CD₈)=0; W(CD₁₆)=0; W(ЦИК)=0,41; W(IgA)=0; W(Ф%)=0.

КИП=0,29+0,54+0+0+0,41+0+0=1,24.

КИП соответствовал благоприятному прогнозу противовирусной терапии.

Больному начата стандартная противовирусная терапия по схеме Пегинтрон + Рибавирин, через 1 мес. от начала терапии получен ранний вирусологический ответ, спустя 6 и 12 мес. ПЦР HCV отрицательна. Результат лечения положительный, проведенная противовирусная терапия эффективна.

Пример 2.

Больная С., история болезни №Г-1272, 48 лет, с диагнозом: Хронический вирусный гепатит «С», репликативная фаза, умеренной степени активности. До начала противовирусной терапии проведено определение генотипа вируса гепатита С (1в) и исследование иммунного статуса (результаты исследований приведены в таблице 2).

Таблица 2.
Показатель	Значение показателя у больной	Норма
CD19	11	3-13%.
CD8	32	12-25%
CD16	24	9-15%;
ЦИК	0,025	0,017-0,047 ед. опт. плотн.
IgA	1,42	1,5-3,0 г/л
% фагоцитоза	30	40-80%;

Исходя из приведенных значений, W(генС)=0,7; W(CD₁₉)=0; W(CD₈)=0,81; W(CD₁₆)=0,2; W(ЦИК)=0; W(IgA)=0,73; W(Ф%)=0,7.

КИП=0,7+0+0,81+0,2+0+0,73+0,76=3,2.

КИП соответствовал благоприятному прогнозу противовирусной терапии. Больной начата стандартная противовирусная терапия по схеме: Пегасис + Рибавирин, через 1 мес. от начала терапии вирусологический ответ не получен, через 3 и 6 мес. ПЦР HCV отрицательная. Результат лечения в целом положительный.

Пример 3.

Больной X., история болезни №Г-2562, 41 год, с диагнозом: Хронический вирусный гепатит «С», репликативная фаза, умеренной степени активности. До начала противовирусной терапии проведено определение генотипа вируса гепатита С (3а) и исследование иммунного статуса (результаты исследований приведены в таблице 3).

Таблица 3.
Показатель	Значение у больного	Норма лаборатории
CD19	28	3-13%.
CD8	32	12-25%
CD16	26	9-15%;
ЦИК	0,01	0,017-0,047 ед. опт. плотн.
IgA	1,42	1,5-3,0 г/л
% фагоцитоза	38	40-80%;

Исходя из приведенных значений, W(генС)=0,29; W(CD₁₉)=0,54; W(CD₈)=0,81; W(CD₁₆)=0,2; W(ЦИК)=0,41; W(IgA)=0,74; W(Ф%)=0,76.

КИП=0,29+0,54+0,81+0,2+0,41+0,73+0,76=3,74.

КИП соответствовал неопределенному прогнозу лечения. Больному начата стандартная противовирусная терапия но схеме: Пегинтрон + Рибавирин, через 1 и 3 мес. от начала терапии вирусологический ответ не получен, спустя 6 мес. ПЦР HCV отрицательна. Результат лечения неопределенный, поскольку ранний вирусологический ответ не получен и возможен рецидив заболевания.

Пример 4.

Больная Н., история болезни №Г-2479, 52 лет, с диагнозом: Хронический вирусный гепатит «С», репликативная фаза, умеренной степени активности. До начала противовирусной терапии проведено определение генотипа вируса гепатита С (1в) и исследование иммунного статуса (результаты исследований приведены в таблице 4).

Таблица 4.
Показатель	Значение у больного	Норма лаборатории
CD19	32	3-13%.
CD8	27	12-25%
CD16	20	9-15%;
ЦИК	0,100	0,017-0,047 ед. опт. плотн.
IgA	1,42	1,5-3,0 г/л
% фагоцитоза	33	40-80%;

Исходя из приведенных значений, W(генС)=0,7; W(CD₁₉)=0,54; W(CD₈)=0,81; W(CD₁₆)=0,2; W(ЦИК)=0,41; W(IgA)=0,73; W(Ф%)=0,76.

КИП=0,7+0,54+0,81+0,2+0,41+0,73+0,76=4,15.

КИП соответствовал неблагоприятному исходу противовирусной терапии. Больной начата стандартная противовирусная терапия по схеме: Пегасис + Рибавирин, через 1 и 3 мес.от начала терапии вирусологический ответ не получен, спустя 6 мес.больная снята с противовирусной терапии ввиду ее неэффективности. Результат лечения отрицательный, проведенная противовирусная терапия неэффективна.

Таким образом, определение КИП является способом достоверного раннего прогнозирования исходов противовирусной терапии хронического вирусного гепатита «С».

Способ раннего прогнозирования исходов противовирусной терапии хронического вирусного гепатита «С», включающий выявление иммунологических показателей в венозной крови больного, в том числе содержание циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) и вирусологического показателя (генотип вируса гепатита «С»), отличающийся тем, что в комплексе определяют до начала противовирусной терапии количество В-лимфоцитов (CD₁₉), T-лимфоцитов-супрессоров (CD₈), натуральных киллеров (CD₁₆), уровень иммуноглобулина A (IgA) и процент фагоцитоза (Ф%), затем по сумме весовых коэффициентов показателей определяют коэффициент иммунологического прогноза (КИП) по формуле:КИП=W(генС)+W(CD₁₉)+W(CD₈)+W(CD₁₆)+W(ЦИК)+W(IgA)+W(Ф%),где W - коэффициент, равный «нулю» при отсутствии отклонений показателя от границ нормы, а при отклонении от нормы - ниже минимального или выше максимального, равный:W(CD₁₉) - 0,54; W(CD₈) - 0,8; W(CD₁₆) - 0,2; W(ЦИК) - 0,41; W(IgA) - 0,73; W(Ф%) - 0,76,для весового показателя генотипа вируса гепатита «С» (WгенC) определены соответствующие значения:- при генотипе вируса гепатита «С» «1b» WгенС=0,7;- при генотипе вируса гепатита «С» «3a» WгенС=0,29;- при генотипе вируса гепатита «С» «2а» или «неопределенном» WгенC=0,1,и при значении КИП 1,2÷3,2 определяют благоприятный прогноз исхода лечения, при значениях КИП 3,3÷3,9 возможен рецидив, а при КИП более 3,9 определяют неблагоприятный прогноз.