Штаммы бактерий bacillus subtilis и bacillus amyloliquefaciens, обеспечивающие восстановление микробиоценозов почвы и желудочно-кишечного тракта животных, обладающие бактерицидной, фунгицидной и вирулицидной активностью, и препарат на основе этих штаммов

Штаммы бактерий bacillus subtilis и bacillus amyloliquefaciens, обеспечивающие восстановление микробиоценозов почвы и желудочно-кишечного тракта животных, обладающие бактерицидной, фунгицидной и вирулицидной активностью, и препарат на основе этих штаммов

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к штаммам микроорганизмов, стимулирующим восстановление микробиоценоза почвы и желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) животных и человека, обладающим антибактериальной, фунгицидной и вирулицидной активностью, продуцирующим интерферон α-2 лейкоцитарный человеческий, и к препаративной форме на их основе и может быть использовано в биотехнологии, ветеринарной медицине, медицине и защите растений для:

получения препаратов против бактериальных, грибных и вирусных инфекций животных и растений; использования в качестве микробиологических удобрений, предназначенных для восстановления почвенной микробиоты; изготовления лечебно-профилактических препаратов для животных и человека, способных восстанавливать и поддерживать микробиоценоз желудочно-кишечного тракта; корректировать и поддерживать в норме иммунный статус.

Среди бактериальных фунгицидов, имеющих государственную регистрацию и внесенных в Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации, в настоящее время нет фунгицида, обладающего столь широким спектром действия как в настоящем изобретении.

Препарат Интеграл (жидкость на основе штамма 24Д Bacillus subtilis) зарегистрирован в качестве средства, предназначенного для применения против болезней зерновых культур (пшеница, ячмень яровой), овощных культур (картофеля, томатов и огурцов) и для борьбы с антракнозом черной смородины.

Препарат Фитоспорин-М (порошок на основе штамма 24Д Bacillus subtilis) зарегистрирован для применения против болезней зерновых культур (пшеница, ячмень), бобовых (горох), овощных культур (картофель, капуста, томаты, огурцы), (патент РФ №2129375, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубликован 27.04.1999).

Препарат Бактофит (смачивающийся порошок на основе штамма ИПМ 215 Bacillus subtilis) предназначен для защиты от болезней овощных культур, выращиваемых в открытом и защищенном грунте, цветочных культур, а также черной смородины от мучнистой росы.

Среди микробиологических удобрений аналогом заявляемого препарата является Бактофосфин, основу которого составляют почвенные микроорганизмы Bacillus mucilaginosus, предназначенные для обогащения почвы усвояемыми растениями формами фосфора, а также восстановления плодородия почв, повышения всхожести и урожайности на многих видах сельскохозяйственных культур в открытом и защищенном грунте. Авторами данного удобрения не приводятся конкретные данные по влиянию на показательные для плодородных почв группы микроорганизмов, а также влияния на урожайность культур.

Микробиологическое удобрение Байкал ЭМ-1 содержит консорциум представителей различных групп микроорганизмов, в том числе грибов, которые, при внесении в почву развиваясь как симбиотическое сообщество, призваны увеличить численность почвенной микрофлоры и, соответственно, плодородие и урожайность.

Однако вышеприведенные препараты обладают узким спектром действия. В отличие от вышеперечисленных заявляемый бактериальный препарат на основе заявляемого штамма Bacillus subtilis ВКПМ В 10641 зарекомендовал себя в лабораторных и полевых экспериментах как эффективное средство для борьбы с такими высоковредоносными болезнями малины и черной смородины, как пурпуровая пятнистость, фузариоз, альтернариоз, серая гниль, и не имеет аналогов на территории Российской Федерации.

Известен ряд штаммов бактерий рода Bacillus, являющихся антагонистами различных возбудителей болезней сельскохозяйственных культур. Штамм Bacillus subtilis В-116 оказывает антагонистическое действие на грибы Pythium и Rhysoctonia. Штамм бактерий Bacillus subtilis ВНИИСХМ N128 используется для получения препарата против грибковых болезней хлопчатника (Авторское свидетельство СССР №1717156, кл. A01N 63/00, опубл. 1992 г.)

Однако эти штаммы оказывают ограниченное действие, направленное на отдельных возбудителей грибковых болезней различных сельскохозяйственных культур.

Известен штамм бактерий Bacillus subtilis ВНИИСХМ N131, используемый для получения препарата против возбудителей гнилей яблок и винограда при их хранении (Авторское свидетельство СССР №1706504, кл. A01N 63/00, 1992 г.). Однако данный штамм также оказывает ограниченное действие, направленное на отдельных возбудителей грибковых болезней сельскохозяйственных культур.

Однако вышеприведенные штаммы не были исследованы на антагонистическую активность и на способность восстанавливать микробиоценоз почвы и ЖКТ животных до эволюционно нормального, а также не обладают противовирусной активностью и не являются продуцентами интерферона.

Известен штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-7036 для получения препарата против грибковых болезней растений (Патент РФ №2086128, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубликован 10.08.1997 г.). Штамм подвергался селекции на подавление бактериального роста. С лучшими вариантами проводили эксперименты по подавлению роста: Phytophthora infestans, Microsporium solani, Fusarium solani (возбудитель сухой гнили).

Наиболее близким аналогом (прототипом) является штамм бактерий Bacillus subtilis IC-16, полученный путем трансформации штамма В. subtilis ВКПМ В-7048 (IC-9) рекомбинантной плазмидой ДНК рВМВ 105, содержащий ген альфа-2 интерферона (патент РФ №2142287, МКИ C12N 1/20, опубл. 10.12.1999 г.). Полученный штамм IC-16 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ГНИИ Генетика под номером ВКПМ В-7092. Плазмида рВМВ 105 способна реплицироваться в бациллах и содержит в своем составе ген альфа-2- интерферона человека, промотор для экспрессии этого гена, сайт посадки рибосом (SD-сайт) и сигнальный пептид альфа-амилазы В. amyloliquefaciens для секреции интерферона в культуральную среду, а также обеспечения устойчивости к канамицину.

Наиболее близким аналогом (прототипом) препаративной формы является препарат Фитоп, полученный на основе вышеуказанного штамма Bacillus subtilis ВКПМ В-7036 при следующем соотношении компонентов, мас.% (Патент РФ №2086128, МПК A01N 63/00, C12N 1/20, опубликован 10.08.1997 г.): споры бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-7036 с титром 7×10¹⁰ спор/г 0,1-1,0%; крахмал 0,2-3,0%; сахар - остальное до 100%. Остаточная влажность препарата составляет не более 2-5%. Препарат Фитоп выпускается и используется в сельском хозяйстве более 10 лет.

Однако штамм-прототип и препарат на его основе обладает недостаточно широким спектром антагонистической активности, а также не исследовался на способность восстановления микробиоценоза ЖКТ животных и почвы до эволюционно нормального.

Техническим результатом заявляемых технических решений является обеспечение восстановления до эволюционно нормального микробиоценоза почвы, ЖКТ животных и расширение спектра антибактериальной, фунгицидной и вирулицидной активности с использованием препарата, полученного на основе заявляемых штаммов.

Указанный технический результат достигается путем получения методом направленной селекции штаммов бактерий:

- Bacillus subtilis IC-1435-1-1, обеспечивающий восстановление микробиоценоза почвы и желудочно-кишечного тракта животных, обладающий бактерицидной, фунгицидной и вирулицидной активностью и депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером ВКПМ В-10641 (справка о депонировании прилагается);

- Bacillus amyloliquefaciens IC-1436-1-23, обеспечивающий восстановление микробиоценоза почвы и желудочно-кишечного тракта животных, обладающий бактерицидной и фунгицидной активностью и депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером ВКПМ В-10642 (справка о депонировании прилагается);

- Bacillus amyloliquefaciens IC-1437-1-23, обеспечивающий восстановление микробиоценоза почвы и желудочно-кишечного тракта животных, обладающий бактерицидной и фунгицидной активностью и депонированный во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика под регистрационным номером ВКПМ В-10643 (справка о депонировании прилагается).

Указанный технический результат достигается также тем, что препарат характеризуется содержанием наполнителя или воды с биомассой бактерий в споровой форме Bacillus subtilis IC-1435-1-1 (ВКПМ В-10641), или Bacillus amyloliquefaciens IC-1436-1-23 (ВКПМ В-10642), или Bacillus amyloliquefaciens IC-1437-1-23 (ВКПМ В-10643), или их смеси в соотношении 1:1:1 с титром каждого штамма бактерий не менее 1·10⁴ КОЕ/г или 1·10⁴ КОЕ/мл.

В качестве порошкообразного сорбента препарат содержит порошок отрубей, или цеолит, или полисахарид, или моносахарид, или дисахарид, или смесь полисахарида с моносахаридом или дисахаридом в соотношении от 1:100 до 1:10.

В качестве полисахарида препарат содержит крахмал, в качестве моносахарида - глюкозу, в качестве дисахарида - сахарозу.

Иммобилизация спор бактерий на сорбенте обеспечивает им дополнительную механическую защиту, предотвращает агрегирование спор и обеспечивает более равномерное их распределение в массе наполнителя.

При применении препарата крахмал (полисахарид) способствует ускорению прорастания спор бактерий, что повышает эффективность его действия.

Порошкообразный сорбент на основе сахарозы (сахара) или глюкозы является не только сорбентом - наполнителем, но и оказывает на препарат стабилизирующий и консервирующий эффект, создает более мягкие условия для хранения спор бактерий.

Характеристика заявляемых штаммов. Штаммы бактерий Bacillus amyloliquefaciens подвергались селекции на подавление бактериального и грибного роста.

Штамм Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 получен путем селекции рекомбинантного штамма бактерий Bacillus subtilis IC-16. Указанный штамм подвергался селекции на подавление бактериального и грибного роста, а также по признаку количества продуцируемого интерферона α-2 лейкоцитарного человеческого. Исходный рекомбинантный штамм-прототип Bacillus subtilis IC-16 (из которого селекцией получен заявляемый штамм Bacillus subtilis IC-1435-1-1) сконструирован путем трансформации штамма В.subtilis ВКПМ В-7048 (IC-9) рекомбинантной плазмидой ДНК рВМВ 105, содержащий ген альфа-2 интерферона (патент РФ №2142287, МКИ C12N 1/20, опубл. 10.12.1999 г.) и депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ГНИИ Генетика под номером ВКПМ В-7092. Плазмида рВМВ 105 способна реплицироваться в бациллах и содержит в своем составе ген альфа-2- интерферона человека, промотор для экспрессии этого гена, сайт посадки рибосом (SD-сайт) и сигнальный пептид альфа-амилазы В.amyloliquefaciens для секреции интерферона в культуральную среду. С лучшими клонами проводили эксперименты по подавлению роста: энтеробактерий, грамположительных кокков, неферментируюших бактерий, грибов рода Candida, возбудителей фузариоза растений, пурпуровой пятнистости малины, септориоза малины. Определение активности интерферона проводили на культуре клеток с использованием вируса энцефаломиокардита мышей.

Штамм Bacillus amyloliquefaciens IC-1436-1-23 получен путем селекции штамма бактерий Bacillus subtilis IC-9. Указанный штамм подвергался селекции на подавление бактериального и грибного роста. Исходный штамм-прототип Bacillus subtilis IC-9 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ГНИИ Генетика под номером ВКПМ В-7048. В связи с изменением методов идентификации микроорганизмов в Российской Федерации и других странах была выполнена работа по повторному определению видовой принадлежности заявляемого отселектированного штамма IC-1436-1-23 во всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) методом детекции по 16s pPHK, который был идентифицирован как Bacillus amyloliquefaciens с присвоением заявляемому штамму в коллекции ГНИИ Генетика номера ВКПМ В-10642.

Штамм Bacillus amyloliquefaciens IC-1437-1-23 получен путем селекции штамма бактерий Bacillus licheniformis IC-1. Указанный штамм подвергался селекции на подавление бактериального и грибного роста. Исходный штамм-прототип Bacillus licheniformis IC-1 депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов (ВКПМ) ГНИИ Генетика под номером ВКПМ В-7038. В связи с изменением методов идентификации микроорганизмов в Российской Федерации и других странах была выполнена работа по повторному определению видовой принадлежности заявляемого отселектированного штамма IC-1437-1-23 во всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) методом детекции по 16s pPHK, который был идентифицирован как Bacillus amyloliquefaciens с присвоением заявляемому штамму в коллекции ГНИИ Генетика номера ВКПМ В-10643.

Культурально-морфологические и биохимические свойства штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10642, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643.

Штаммы относятся к грамположительным факультативно аэробным палочковидным бактериям. При росте на мясопептонном агаре штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 образует шероховатые колонии белого цвета, врастающие в поверхность питательной среды. Клетки палочковидные, эндоспоры овальные, расположены центрально или парацентрально, не раздувают клетку при спорообразовании. Длина клетки - (2-3) мкм, ширина - (0,7-0,8) мкм. Капсулу не образуют. По Граму окрашиваются положительно. Штаммы бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10642 и Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643 образуют шероховатые колонии кремового цвета. Клетки палочковидные, эндоспоры овальные, расположены центрально или парацентрально, не раздувают клетку при спорообразовании. Длина клетки - 2,0-3,8 мкм, ширина - 0,5-1,0 мкм. Капсулу не образуют. Штаммы являются олигофильными, размножаются при 25-45°С, оптимальный рост наблюдается при температуре 33-37°С. Через 48 часов роста при 37°С на мясопептонном агаре культура имеет непрозрачные колонии однородной мучнистой консистенции, с ровным краем. рН среды: минимальная 5,7; максимальная 8,0; оптимальная 7,0-7,2. Штаммы размножаются при 37°С на мясопептонном агаре и мясопептонном бульоне.

Биохимические свойства штаммов. Не растут в анаэробных условиях, не образуют ацетилметилкарбинол из глюкозы в реакции Фогес - Проскауэра, ферментируют с образованием кислоты глюкозу, маннозу, фруктозу, рибозу, ликсозу, целлобиозу, трегалозу, мальтозу, туранозу. Гидролизуют крахмал, мочевину и эскулин. Обладают лецитиназной, каталазной активностью. Толерантны к концентрациям хлорида натрия в питательной среде в диапазоне 1-9%.

Штаммы не являются зоопатогенными и фитопатогенными.

Штаммы продуцируют биологически активные метаболиты, в том числе антибиотики и ферменты широкого спектра действия, подавляющие рост патогенной и условно-патогенной бактериальной и грибной микрофлоры, штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 продуцирует интерферон α-2 лейкоцитарный человеческий.

Для длительного хранения штаммов бактерий споровую массу лиофильно высушивают. Для массового размножения бактерий используют мясопептонный бульон. Культивирование проводят при температуре 37°С.

Определение количества единиц активности интерферона α-2 лейкоцитарного человеческого, продуцируемого заявляемым штаммом Bacillus subtilis ВКПМ В-10641.

Пяти беспородным белым мышам массой 18-20 г с помощью автоматической пипетки вводили перорально 0,1 см³ водной суспензии клеток штамма в концентрации 50 мг/см³ в течение 5 сут.

Через 5 сут от начала введения штамма у 5 мышей отбирали для исследования образцы (отдельно от каждого животного). Животных подвергали эвтаназии методом цервикальной дислокации. Асептически вскрывали брюшную полость и извлекали по 0,5 см дистального и проксимального отделов кишечника. Извлеченные фрагменты кишечника помещали в предварительно взвешенную стерильную микропробирку с налитой в нее 0,5 см³ среды Игла MEM. Микропробирку с фрагментами кишечника взвешивали. Все пробы до анализа хранили при температуре минус 80°С. Образцы кишечника гомогенизировали в микропробирках с помощью тефлонового гомогенизатора. Осветляли центрифугированием при 10000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант дополнительно осветляли и стерилизовали фильтрацией.

В лунки планшета добавляли по 0,05 см³ раствора нейтрального красного (1,1 г/см³) в среде Игла MEM. Инкубировали в течение 90 мин. Содержимое лунок удаляли и лунки промывали трехкратно физиологическим раствором. Планшеты подсушивали в ламинарном потоке воздуха. В каждую лунку добавляли 0,1 см³ этанола (подкисленного соляной кислотой до рН 4,0). Инкубировали в течение 30 мин и измеряли оптическую плотность при длине волны 490 нм.

Определение специфической активности интерферона в биологических субстратах экспериментальных животных определяли с использованием 2-3-суточного монослоя культур клеток L-929 и Л-68, чувствительных к интерферону α-2 лейкоцитарному человека. Культуру клеток выращивали на матрацах, используя ростовую питательную среду Игла MEM с двойным набором аминокислот с 10% сыворотки крови плодов коров жидкой с добавлением бензатилбензилпенициллина стерильного 100 ед/см³ и стрептомицина сульфата 100 ед/см³. Клетки инкубировали при температуре 36,0±1,0°С. После формирования полного монослоя клетки снимали с матрацев смесью Версена и трипсина в соотношении 1:1. Монослой клеток заливали указанной смесью, выдерживали при комнатной температуре 2-5 мин до набухания и начала отслоения клеток от поверхности матрацев, после чего смесь Версена с трипсином сливали, а клетки диспергировали в 40-50 см³ поддерживающей среды (питательная среда Игла с антибиотиками без сыворотки плодов коров). В полученной взвеси подсчитывали количество клеток в камере Горяева и доводили концентрацию клеток до (150000-300000) клеток/мл путем добавления ростовой среды. Приготовленную таким образом взвесь клеток разливали в 96-луночные культуральные планшеты по 200 мм³ в лунку. Инкубировали планшеты с культурой клеток при температуре 36,0±1,0°С в атмосфере с 5,0±0,5% СО₂ в течение 48-72 час до образования полного монослоя.

Для определения активности (титра) индикаторного вируса готовили десятикратные разведения культуры вируса, полученной из коллекции культур, в поддерживающей среде. Далее в культуральные планшеты вносили по 100 мм³ приготовленных разведении, используя на каждое разведение не менее четырех лунок. Инокулированные и контрольные культуры клеток инкубировали в течение 24 час при температуре 36,0±1,0°С в атмосфере с 5,0±0,5% CO₂. За титр вируса принимали величину, обратную разведению препарата, при которой клеточная культура в 50% лунок оказалась полностью пораженной цитопатическим действием вируса.

Активность (титр) вируса определяли методом Спирмена - Кербера по формуле:

,

где D_max - десятичный логарифм разведения, выше которого произошла 100% гибель клеток (+);

d - десятичный логарифм шага разведении (1,0);

n - число лунок на каждую дозу (4);

p - число лунок, давших гибель (+) в D_max и последующих разведениях.

Для определения активности интерферона в фильтрате гомогенатов фрагментов проксимального, дистального отделов кишечника экспериментальных животных и его содержимого готовили их двукратные разведения и двукратные разведения контрольного образца интерферона в поддерживающей среде (на 4 разведения ниже и выше предполагаемого титра).

Из лунок культуральных планшетов удаляли ростовую среду и вносили по 100 мкл приготовленных разведении экспериментальных и контрольных образцов, используя на каждое разведение не менее 4 лунок с культурой клеток. Для контроля дозы индикаторного вируса оставляли 16 лунок с культурой клеток, а для контроля состояния монослоя клеток - 4 лунки. В эти 20 лунок вносили по 100 мкл поддерживающей среды, используемой для приготовления разведении анализируемых образцов. Инокулированные и контрольные культуры клеток инкубировали в течение 24 часов при температуре 36,0±1,0°С в атмосфере с 5,0±0,5% СО₂. Затем в каждую лунку с опытными образцами и контролем интерферона вносили рассчитанную заранее дозу индикаторного вируса - вируса энцефаломиокардита мышей, соответствующую 100 ТЦД₅₀, в объеме по 0,1 см³ на каждую лунку.

Учет и анализ результатов измерений проводили на вертикальном многоканальном спектрофотометре-флюориметре FL-600 с помощью программного обеспечения КС-4 Bio-Tek Ink., USA. Концентрация человеческого альфа-2 интерферона, полученная методом подавления ЦПД, была не менее 30 МЕ/г исследуемого образца, что на порядок выше, чем в исходном штамме-прототипе В.subtilis ВКПМ В-7092.

Пример 1. Исследование непатогенности штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10642, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643.

Исследование проведено в лаборатории биотехнологического контроля НПФ «Исследовательский центр».

Патогенность каждого микроорганизма оценивали по выживаемости инфицированных животных, их внешнему виду и поведению, высеваемости бактерий из крови и органов в различные сроки после заражения, а также макроскопической картине внутренних органов при вскрытии животных в конце срока наблюдения.

В работе использованы лабораторные животные двух видов: нелинейные белые мыши массой 18-20 г в количестве 40 особей обоего пола и крысы породы Вистар массой 180-200 г в количестве 40 особей обоего пола. Из животных формировали опытную и контрольную группу по 20 особей в каждой. Для выявления проникновения бактерий в органы экспериментальных животных животным из опытных групп на протяжении 60 суток перорально вводили суточную культуральную жидкость бактерий, полученную путем культивирования исследуемого штамма на мясопептонном бульоне.

Животных из опытных и контрольных групп забивали по следующей схеме:

- день 5 - по 4 особи из каждой группы (контрольной и опытной);

- день 15 - по 4 особи из каждой группы (контрольной и опытной);

- день 30 - по 4 особи из каждой группы (контрольной и опытной);

- день 45 - по 4 особи из каждой группы (контрольной и опытной);

- день 60 - по 4 особи из каждой группы (контрольной и опытной).

После проведения вскрытия посев органов (сердце, легкое, печень, селезенка) и крови производили на мясопептонный и кровяной агары в чашки Петри методом отпечатков. Посевы инкубировали в термостате при температуре 37±1°С в течение 24 часов. Результат учитывали по наличию/отсутствию колоний на поверхности питательной среды в чашке Петри.

В результате проведенных исследований установлено нижеследующее. В течение опыта не зарегистрировано гибели животных. Не отмечено каких-либо изменений в их внешнем виде и поведении. При макроскопической оценке внутренних органов во все периоды проведения вскрытий патологических изменений не обнаружено.

Микробиологический анализ показал, что внутренние органы и кровь были стерильными в опытном и контрольном вариантах во все периоды проведения исследований.

На основании отсутствия гибели животных и каких-либо изменений в их внешнем виде и общем поведении, на протяжении 60-дневного наблюдения, отрицательных результатов микробиологического анализа сердца, легких, печени, селезенки и крови сделан вывод, что штаммы бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10642, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643 являются непатогенными.

Пример 2. Исследование антагонистической активности штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10642, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643.

Полученные путем селекции штаммы бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10642, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643 характеризуются высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов.

Антагонистическую активность в отношении тест-культур проверяли методом отсроченного антагонизма. В качестве тест-штаммов использовали Staphylococcus aureus, Candida albicans, Klebsiella pneumonia, Shigella flexneri, Shigella sonnet, Yersinia pseudotuberculosis, Serratia marcescens, Escherichia coli, Enterococcus spp.

Используемые тест-штаммы удовлетворяли следующим требованиям: находились в S-форме, имели типичные морфологические и ферментативные свойства.

Исследование антагонистической активности заявляемых штаммов бактерий Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens производили на мясопептонном агаре.

Рецептура мясопептонного агара на 1 дм³:

- пептон мясной ферментативный - 10,0 г;

- дрожжевой экстракт - 5,0 г;

- хлорид натрия - 5,0 г;

- агар микробиологический - 15,0 г.

- дистиллированная вода - до общего объема 1 дм³.

После смешивания компонентов среду разогревали до полного растворения агара и фильтровали через ватно-марлевый фильтр в колбы вместимостью 500 см³ по 300 см³. Колбы со средой закрывали ватно-марлевыми пробками, оборачивали горловину пергаментом и стерилизовали в автоклаве при давлении 0,15 МПа в течение 40 мин. После остывания до температуры 45±1°С среду разливали по стерильным чашкам Петри. Для контроля стерильности чашки с подсушенной средой помещали в термостат при температуре 37±1°С на 24±2 часа. Нестерильные чашки отбраковывали.

Культуры патогенных микроорганизмов, указанные выше, выращивали на чашках Петри в течение 18±2 часов на мясопептонном агаре. В стерильные пробирки приливали по 1 мл физиологического раствора и готовили суспензии тест-штаммов с концентрацией микробных клеток (5,0±1,0)×10⁸ КОЕ/см³.

Для проведения испытания от каждой серии препарата отбирали 3 пробы по 1 г.

Далее 0,5 г препарата разводили в 0,5 см³. Полученную взвесь высевали штрихом с помощью микробиологической петли по диаметру чашки Петри с мясопептонным агаром. Посевы инкубировали в термостате при температуре 37±1°С в течение 48±2 часов. Затем к выросшей в виде штриха культуре подсевали с помощью микробиологической петли суспензии патогенов методом перпендикулярных штрихов.

Учет результатов проводили через 8 часов инкубирования при 37±1°С по величине зон угнетения роста тест-штаммов. Контролем роста культур патогенов служил их параллельный высев на чашки Петри с той же плотной средой (мясопептонным агаром) без исследуемой ассоциации антагонистов. Полученные в опыте данные представлены в таблицах 1, 2 и 3.

Таким образом, исследуемые штаммы бактерий проявляют антагонистическую активность в отношении широкого спектра патогенных и условно патогенных микроорганизмов.

Пример 3. Методика культивирования бактерий Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens для получения микробной биомассы.

Для получения биомассы спор бактерий штаммы Bacillus subtilis ВКПМ В-10641, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10642, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643 культивировали на жидкой питательной среде следующего состава:

- пептон мясной ферментативный - 10,0 г;

- дрожжевой экстракт - 5,0 г;

- хлорид натрия - 5,0 г;

- дистиллированная вода - до общего объема 1 дм³.

рН 7,2±0,2.

На 1 дм³ ферментационной питательной среды использовали 10 см³ посевного материала с титром 10⁸ КОЕ/см³. Процесс выращивания биомассы осуществляли в ферментере в течение 48±2 часов. При указанном способе культивирования может быть получен титр спор (5-10)×10¹⁰ КОЕ/см³.

Пример 4. Получение готовой формы препарата на основе бактерий штаммов Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens.

Вначале готовят смесь собранной и проверенной по показателям качества сырой биомассы с наполнителем. В качестве наполнителя может быть использована вода (для обработки растений методом распыления) с титром спор не менее 1·10⁴ КОЕ/мл или порошкообразный сорбент, например цеолит. В качестве сорбента используют также порошок из отрубей или сахарную пудру и крахмал в соотношении биомасса, пудра и крахмал 1:5:5, тщательно перемешивают. В процессе перемешивания происходит иммобилизация спор бактерий на частицы крахмала. Далее в полученную смесь вводят сахарную или глюкозную пудру из расчета 1 часть смеси на 10 частей пудры. В результате получают концентрат препарата с титром спор не менее 1×10¹⁰ КОЕ/г. Далее его смешивают с сахарной или глюкозной пудрой и крахмалом в такой пропорции, чтобы получить готовый препарат с титром спор не менее 1·10⁴-10⁶ КОЕ/г.

Остаточная влажность препарата составляет не более 5%.

Пример 5. Составы препаратов

5.1. Состав 1. Водный раствор биомассы спор бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10642 с титром спор не менее 1·10⁴ КОЕ/мл. Данный раствор хранят в темном месте не более 1-2 суток.

5.2. Состав 2. Смесь биомассы спор бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10642 с цеолитом с титром спор не менее 1·10⁶ КОЕ/г.

5.3. Состав 3. Смесь биомассы спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 не менее 1·10⁶ КОЕ/г со смесью крахмала и пудры на основе сахарозы в соотношении 1:100.

5.4. Состав 4. Смесь биомассы спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 с порошком из отрубей с титром спор не менее 1·10⁶ КОЕ/г.

5.5. Состав 5. Смесь биомассы спор бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643 с титром спор не менее 1·10⁶ КОЕ/г со смесью крахмала и пудры на основе сахарозы в соотношении 1:50.

5.6. Состав 6. Смесь биомассы спор бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643 с титром спор не менее 1·10⁶ КОЕ/г со смесью крахмала и пудры на основе сахарозы в соотношении 1:10.

5.7. Состав 7. Биомасса спор бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10642, Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 в соотношении 1:1:1 с титром спор каждого вида бактерий не менее 1·10⁴ КОЕ/г со смесью крахмала и пудры на основе глюкозы в соотношении 1:20.

5.8. Состав 8. Смесь биомассы спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 с крахмалом с титром не менее 1·10⁶ КОЕ/г.

5.9. Состав 9. Смесь биомассы спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 с сахарозой с титром не менее 1·10⁶ КОЕ/г.

5.10. Состав 10. Смесь биомассы спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 с глюкозой с титром не менее 1·10⁶ КОЕ/г.

5.11. Состав 11. Водный раствор биомассы спор бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643 с титром спор не менее 1·10⁴ КОЕ/мл. Данный раствор хранят в темном месте не более 1-2 суток.

5.12. Состав 12. Водный раствор биомассы спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 с титром спор не менее 1·10⁴ КОЕ/мл. Данный раствор хранят в темном месте не более 1-2 суток.

5.13. Состав 13. Водный раствор биомасс спор бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10642, Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 в соотношении 1:1:1 с титром спор каждого вида бактерий не менее 1·10⁴ КОЕ/г. Данный раствор хранят в темном месте не более 1-2 суток.

5.14. Состав 14. Водный раствор биомассы спор бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 с титром спор не менее 1·10⁶ КОЕ/мл.

5.15. Состав 15. Водный раствор биомассы спор бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10642 с титром спор не менее 1·10⁶ КОЕ/г.

5.16. Состав 16. Водный раствор биомассы спор бактерий Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643 с титром спор не менее 1·10⁶ КОЕ/г.

Пример 6. Данные по хранению сухой формы препарата на основе штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-10641, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10642, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643.

Для установления срока годности и условий хранения препарата проведены соответствующие исследования.

В течение 96 месяцев хранения сухой формы препарата при температуре 30±0,5°С титр и антагонистическая активность препарата не изменились, что подтверждает высокую термостабильность препаратов в споровой форме, обеспечивающую значительное упрощение технологии их применения в медицине, ветеринарии и растениеводстве.

Пример 7. Данные по ингибирующей активности штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10642, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643 в отношении фитопатогенов.

Для испытания штаммов Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens в отношении способности ингибировать фитопатогенов использовали метод агаровых блоков. Суспензию препарата с титром 1×10⁸ КОЕ/см³ вносили в мясопептонный агар, остуженный до температуры 36±1°С. Для выращивания фитопатогенов использовали картофельно-глюкозный агар.

Инокулированную штаммами (каждым в отдельности) среду разливали в чашки Петри и на застывшую поверхность, в центр помещали блок диаметром 10 мм, вырезанный из колонии фитопатогена.

Учет результатов проводили с периодичностью в 3 дня. Активность штамма учитывали по изменению диаметра колонии гриба в сравнении с контролем (среда без внесения штаммов). На основании полученных данных определяли ингибирующую активность, которую рассчитывали по формуле:

ИА=[(Д_к-Д_о)/Д_к]×100,

где Д_к - диаметр колонии в контрольном варианте;

Д_о - диаметр колонии в опытном варианте.

В таблице 4 приведены значения показателей ингибирующей активности в отношении грибных фитопатогенов испытуемых штаммов бактерий, полученные в эксперименте.

Таким образом, заявляемые штаммы бактерий Bacillus subtilis и Bacillus amyloliquefaciens проявляет антагонистическую активность по отношению к обозначенным в таблице 4 грибным фитопатогенам.

Пример 8. Данные полевых испытаний по изучению влияния препаратов на основе штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-10641, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10642, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10643 на пораженность малины пурпуровой пятнистостью и на поражение смородины септориозом.

Для испытания штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-10641, Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10642 в отношении болезней малины и смородины в открытом грунте использовали промышленные посадки малины сорта Зоренька Алтая и смородины сорта Софья. В качестве химического эталона использовали Топаз в концентрации 0,1%. Обработку проводили суспензией препаратов с титром 10⁶ спор/мл.

Обработку посадок проводили в июле и июне согласно схеме опыта:

- штаммы Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 и Bacillus amyloliquefaciens ВКПМВ-10642;

- Топаз 0,1%;

- контроль.

Повторность опыта четырехкратная, площадь делянки 10 м², расход рабочей жидкости - 4 дм³ на вариант. Схемы на малине и смородине аналогичны.

Поражение листьев смородины септориозом учитывали по следующей шкале:

- 0 - баллов - здоровые листья;

- 1 балл - слабое развитие заболевания (занято пятнами от 0 до 10% поверхности листовой пластинки);

- 2 балла - средние развитие заболевания (занято пятнами от 11 до 25% поверхности листовой пластинки);

- 3 балла - сильное развитие заболевания (занято пятнами от 26 до 50% поверхности листовой пластинки);

- 4 балла - очень сильное развитие заболевания (занято пятнами более 50% поверхности листовой пластинки).

Степень повреждения побегов малины оценивали по специальной 4-бальной шкале для пурпуровой пятнистости малины:

- 0 баллов - здоровый стебель;

- 1 балл - поверхность пораженного участка гладкая, возможны утолщения коры, участок расположен по одну сторону стебля;

- 2 балла - поверхность пораженного участка гладкая, возможны трещины коры, участок расположен по обе стороны стебля;

- 3 балла - поверхность пораженного участка деформирована, участок расположен по обе стороны стебля;

- 4 балла - поверхность пораженного участка деформирована, участок окольцовывает стебель.

Развитие болезни определяли по следующей формуле:

,

где R - индекс развития болезни, %;

а - количество растений соответствующего балла, шт;

b - балл шкалы;

N - общее количество растений, шт;

К - высший балл используемой шкалы.

Распространенность рассчитывали по формуле:

,

где R - индекс распространенности болезни, %;

а - количество растений в контроле, шт;

b - количество растений в опыте, шт.

Биологическую эффективность биопрепаратов определяли по формуле:

,

где а - показатель средней пораженности в контроле, %;

b - показатель средней пораженности на обработанном участке, %.

Результаты полевых опытов представлены в таблицах 5 и 6.

Таким образом, обработка насаждений малины препаратами на основе штаммов Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 и Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10642 в полевом опыте снижала: развитие болезни почти в 3 раза; распространенность - больше, чем в 2 раза.

Таблица 5.
Влияние заявляемых препаратов на основе штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-10641 и Bacillus amyloliquefaciens ВКПМ В-10642 на поражение малины пурпуровой пятнистостью (СХА «Сады Сибири», 2009 год).
Вариант	Распространенность, %	Развитие, %	Биологическая эффектив