Полипептиды е2 папилломавируса, применяемые для вакцинации

Полипептиды е2 папилломавируса, применяемые для вакцинации

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к применению молекулы нуклеиновой кислоты, либо вектора, либо инфекционной вирусной частицы, кодирующих по меньшей мере один полипептид Е2 папилломавируса, для изготовления лекарства, предназначенного для лечения папилломавирусных инфекций. Изобретение представляет весьма специальный интерес в области иммунотерапии, и более конкретно для лечения пациента, страдающего персистентной папилломавирусной инфекцией.

Папилломавирусы выделены в ряде высших организмов, где они инфицируют эпителиальные ткани кожи и слизистых оболочек. В настоящее время у людей идентифицировано более 100 генотипов папилломавируса человека (HPV) (Stoler, 2000, Int. J. Gynecol. Path 19, 16-28), которые можно классифицировать как генотипы "низкого риска", обычно связанные с доброкачественными опухолями (например, HPV-6 и HPV-11), и генотипы "высокого риска", которые связаны с повреждениями с потенциалом прогрессирования до предраковых повреждений (например, интраэпителиальная цервикальная неоплазия, ИЦН) и, в конечном счете, до злокачественных опухолей. Например, более 99% раков шейки матки содержат ДНК HPV, и пять генотипов "высокого риска" HPV (HR-HPV) распознаны как основной причинный фактор, причем HPV-16 и HPV-18 обнаруживают примерно в 70% инвазивных раков шейки матки, диагностированных во всем мире (Clifford et al., 2003, Br J Cancer 88, 63-73), a HPV-31, HPV-33 и HPV-45 ответственны за дополнительные 10% (Cohen et al., 2005, Science 308, 618-621).

Папилломавирусы представляют собой мелкие ДНК-вирусы, окруженные белковым капсидом (см., например, Pfister, 1987, в The papovaviridae: The Papillomaviruses, Saizman and Howley edition, Plenum Press, New York, p.1-38). Геном представляет собой двунитевую кольцевую ДНК примерно 7900 пар оснований, которая состоит из трех функциональных областей, ранней (Е), поздней (L) и длинной регуляторной области (LCR). Области LCR содержат транскрипционные регуляторные последовательности, такие как энхансеры и промоторы. Поздняя область кодирует структурные белки L1 и L2, соответственно, главный и малый капсидные белки, где ранняя область кодирует регуляторные белки (Е1-Е7), обнаруженные преимущественно в ядре, которые регулируют вирусную репликацию, транскрипцию и клеточную трансформацию.

Белок Е1 является самым большим (длина HPV-16 Е1 составляет 649 аминокислот) и наиболее консервативным белком, кодируемым геномом папилломавируса. Е1 представляет собой ДНК-связывающий фосфопротеин с АТФ-зависимой геликазной активностью, которая требует димеризации и взаимодействия с Е2 для стимуляции вирусной репликации (Desaintes and Demeret, 1996, Semin. Cancer Biol. 7, 339-347; Wilson et a/, 2002, Virus Gene 24, 275-290). Геликазная активность локализована в С-концевом домене Е1, а ДНК-связывающий домен в центральном домене. Белок Е2 (длина HPV-16 Е2 составляет 365 аминокислот) представляет собой многофункциональный ДНК-связывающий фосфопротеин, который регулирует транскрипцию вирусных генов и контролирует репликацию ДНК (Bechtold et al., 2003, J. Virol. 77, 2021-2028). Регуляция вирусной транскрипции требует димеризации и связывания димеров Е2 с Е2-связывающим сайтом (консенсус-последовательностью ACCN6GGT), окружение которого определяет, имеет ли место трансактивация или репрессия вирусной транскрипции (Ham et al., 1991, Trends Biochem. Sci. 16, 440-444; Me Bride et al., 1991, J. Biol. Chem. 266, 18411-18444). Е2 также обеспечивает репрессию промотора HPV-16 р97, который контролирует экспрессию онкобелков Е6 и Е7. Наконец, Е2 вовлечен в деление вирусного генома в дочерних клетках. N-концевой домен HPV-16 Е2 ответственен за трансактивацию, взаимодействие с Е1 и стимуляцию репликации, тогда как С-концевой домен вовлечен в связывание ДНК и димеризацию (McBride et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 510-514). Белок, кодируемый Е4, связывает и прерывает цитоплазматическую кератиновую сеть и играет роль в созревании вируса. Функция белка Е5 все еще является спорной. Белки Е6 и Е7 вовлечены в онкогенную трансформацию клеток, инфицированных HR-HPV (Kanda et al., 1988, J. Virol. 62, 610-613; Vousden et al., 1988, Oncogene Res. 3, 1-9; Bedell et al., 1987, J. Virol. 61, 3635-3640), посредством связывания этих вирусных белков с продуктами клеточного гена опухолевого супрессора р53 и ретинобластомы (Rb), соответственно (обзор в Howley, 1996, Papillomaviruses and their replication, p.2045-2076, в B.N. Fields, D.M. Knipe and P.M. Howley (ed), Virology, 3^rd ed. Lippincott-Raven Press, New York, N.Y.).

Инфекция HPV является одной из наиболее частых инфекций, передающихся половым путем, и примерно 25% взрослых людей, живущих половой жизнью, инфицировано HPV (Woodman et al., 2001, The Lancet 357, 1831-1836). Примерно у 80% субъектов достигается спонтанная эрадикация вируса в течение 6-12 месяцев (Но et al., 1998, N EngI J Med 338, 423-428). Однако у остальных 20% инфекция HPV прогрессирует до предраковых повреждений ИЦН, которые, если они не диагностированы, могут привести к инвазивным ракам (O'Shaughnessy et al., 2002, Clinical cancer Research 2, 314-346). Оказалось, что в механизм, вызывающий неоплазию, вовлечена интеграция генома HPV в клеточные хромосомы (Cullen et al., 1991, J. Virol. 65, 606-612). В большинстве случаев это приводит к прерыванию геномной ДНК HPV в области Е1/Е2, высвобождению промотора Е6/Е7 от репрессорного эффекта Е2 и, следовательно, к повышенной регуляции экспрессии Е6 и Е7 и клеточной трансформации.

Профилактические вакцины, направленные на предупреждение инфекции HPV, в настоящее время близки к достижению рынка. Они направлены на капсидные белки, экспрессируемые на поверхности вируса, с целью блокирования вируса прежде, чем он проникнет в клетки-хозяева, главным образом, посредством индукции нейтрализующих антител. Они в целом основаны на белках L1, продуцируемых рекомбинантным путем, которые спонтанно претерпевают повторную сборку в ВПЧ (вирусоподобные частицы). Две вакцины HPV, изготавливаемые фирмами Merck и GlaxoSmithKline (GSK), успешно прошли завершение клинических испытаний фазы III, показав почти 100% эффективность при предупреждении типоспецифичных инфекций шейки матки. Вакцина GSK содержит смесь ВПЧ HPV-16 и HPV-18, тогда как в вакцину Merck также включены ВПЧ от HPV-6 и HPV-11, которые вызывают остроконечные кондиломы.

Однако субъекты, уже инфицированные HPV, непригодны для профилактической вакцинации, и терапевтические вакцины представляют интерес для лечения инфицированных пациентов, имеющих риск развития повреждений с онкогенным потенциалом. Поскольку онкогенная активность свойственна экспрессии генов HPV E6 и Е7 в инфицированных клетках, огромные усилия направлены на блокирование их экспрессии или на индукцию клеточного иммунного ответа против этих трансформирующих генных продуктов. В литературе описаны различные подходы, например, основанные на применении антисенс-РНК (Steele et al., 1993, Cancer Res 53, 2330-2337; He et al., 1997, Cancer Res. 57, 3993-3999; Choo et al., 2000, Gynecol. Oncol. 78, 293-301), рибозимов (Chen et al., 1996, Cancer gen Ther. 3, 18-23; Pan et al., 2004, Mol. Ther. 9, 596-606), миРНК (малых интерферирующих РНК) (Butz et al., 2003, Oncogene 22, 5938-5945; Koivusalo et al., 2005, Mol. Pharmacol. 68, 372-382), иммуногенных пептидов (Feltkamp et al., 1993, Eur. J. Immunol. 23, 2242-2249), плазмид, кодирующих E6 и/или Е7 (Peng et al., 2004, J. Virol. 78, 8468-8476), и вирусных векторов (W090/10459; W099/03885; Kaufmann et al., 2002, Clinical Cancer Res. 8, 3676-3685).

Поскольку белок Е2 экспрессируется на ранней стадии инфекции HPV, он представляет вторую потенциальную мишень для терапевтической вакцинации. Доклинические исследования, проведенные на кроликах, инфицированных папилломавирусом американского кролика (CRPV), показали защиту против внедренных повреждений, обусловленных папилломавирусом, вследствие экспрессии Е2. Например, введение рекомбинантного аденовирусного вектора, экспрессирующего белок CRPV E2, привело в результате к клиренсу CRPV-индуцированной папилломы и инфекции, вероятно, посредством клеточно-опосредованного иммунитета (Brandsma et al, 2004, J. Virol. 78, 116-123). Введение ДНК, кодирующей белки CRPV E1 и E2, было также эффективным для предупреждения или по меньшей мере замедления развития карциномы CRPV-индуцированных кожных папиллом (Нап et al., 2000, J. Virol. 74, 9712-9716), хотя было показано, что защитный иммунитет зависит от пути введения (Нап et al., 2000, Vaccine 18, 2937-2944). Терапевтический потенциал E2 для лечения повреждений, обусловленных папилломавирусом, был также подтвержден у субъекта человека, который был подвергнут воздействию HPV. Анти-Е2 специфичный Т-хелперный иммунитет часто обнаруживали у здоровых субъектов (De Jong et al., 2002, Cancer Res. 62, 472-479), тогда как нарушенный CD4+Т-клеточный иммунитет против E2 и Е6 наблюдали у женщин, страдающих раками шейки матки, обусловленными HPV-16 (De Jong et al., 2004, Cancer Res. 64, 5449-5455).

Клинические испытания фазы II проходят у пациентов с обусловленной HPV ИЦН высокой степени 2 и 3, применяющих рекомбинантный вектор MVA (модифицированный вирус Анкара), кодирующий белок E2 бычьего папилломавируса (BPV). Вирусные частицы инъецируют непосредственно в повреждения ИЦН и ожидают, что продуцирование E2 в клетках, экспрессирующих Е6 и Е7, приводит к апоптозу. Регрессию повреждений ИЦН действительно наблюдали у большинства пролеченных пациентов. Однако в некоторых случаях вирусная ДНК не элиминировалась, и рецидив повреждений был обнаружен спустя 1 год (Garcia-Hernandez et al., 2006, Cancer Gene Ther. 13, 592-597).

Можно ожидать, что HPV будет продолжать представлять серьезную глобальную угрозу для здоровья в течение многих лет вследствие персистентной природы инфекции, ее высокой распространенностью и значительной заболеваемостью HPV-индуцированными раками. Действительно, продемонстрировано, что женщины с персистентной инфекцией HR-HPV обладают значительно более высоким риском, вплоть до 200-кратного, развития повреждений ИЦН по сравнению с неинфицированными женщинами или женщинами, у которых достигнут спонтанный клиренс вируса (Bory et al., 2002, Int J Cancer 102, 519-525).

Инфекцию HPV, как правило, обнаруживают, осуществляя скрининг на патологии (например, пап-тест мазка со слизистой шейки матки). В настоящее время единственным медицинским достижением диагностики инфекции HPV является применение более частого обследования с целью обнаружения повреждений (например, ИЦН 2/3 высокой степени), как только они возникают, которые затем могут быть удалены с помощью абляционных процедур, таких как электрохирургическая эксцизия петлей (ЭЭП) и клиновидная биопсия (конизация) шейки матки. Такие процедуры в глобальном масштабе эффективны на 90%, однако, вызывают риск акушерских осложнений (например, которые могут влиять на возможность вынашивания ребенка женщинами в репродуктивном возрасте). Эта ситуация, кроме того, что она не является полностью удовлетворительной с медицинской точки зрения, также приводит к дискомфорту (тревоге) для пациента.

Следовательно, существует необходимость в разработке вакцины для лечения пациентов с персистентной инфекцией HPV, особенно в свете высокого риска у данного населения прогрессирования до предраковых повреждений и впоследствии до рака.

Таким образом, в этой связи настоящее изобретение представляет значительное преимущество. В настоящем изобретении предложен неинвазивный и безопасный способ, который дает возможность более ранней защиты против инфекций, вызванных генотипами HR-HPV. Оно обладает преимуществом обеспечения лечения инфицированных пациентов до появления повреждений, обусловленных папилломавирусом, и, следовательно, снижения риска развития предраковых и раковых опухолей. Настоящее изобретение успешно дает возможность снизить риск, связанный с общепринятыми абляционными процедурами (например, акушерские осложнения), в то же время, улучшая комфорт для пациентов (например, уменьшение тревоги, связанной с обследованием на повреждения). Важно, что настоящее изобретение может также дать возможность уменьшить риск будущих рецидивов вследствие повторной инфекции HPV посредством уничтожения инфекционного папилломавируса и его родственных изолятов.

Данная техническая задача решена путем разработки воплощений, которые определены в формуле изобретения.

Другие и дополнительные аспекты, признаки и преимущества настоящего изобретения станут очевидными на основании последующего описания предпочтительных в настоящий момент воплощений изобретения. Эти воплощения приведены в целях описания.

Соответственно, в первом аспекте в настоящем изобретении предложено применение молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один полипептид Е2 папилломавируса, либо вектора, либо инфекционной вирусной частицы, содержащих указанную молекулу нуклеиновой кислоты, для изготовления лекарства, предназначенного для лечения организма-хозяина, страдающего персистентной папилломавирусной инфекцией, вызванной по меньшей мере одним папилломавирусом. Настоящее изобретение также относится к указанной молекуле нуклеиновой кислоты, вектору или инфекционной вирусной частице для применения при лечении персистентной папилломавирусной инфекции у организма-хозяина. Согласно одному воплощению указанную молекулу нуклеиновой кислоты, вектор или инфекционную вирусную частицу вводят после воздействия на организм-хозяин по меньшей мере одного папилломавируса и до обнаружения/выявления повреждения, обусловленного папилломавирусом.

На протяжении всей заявки, когда употребляют единственное число, подразумевают "по меньшей мере один", "по меньшей мере первый", "один или более чем один" или "множество" упоминаемых соединений или стадий, если контекстом не продиктовано иное. Например, термин "полипептид Е2 папилломавируса" охватывает уникальный тип полипептида Е2 папилломавируса а также множество полипептидов Е2 папилломавируса, включая их смесь.

Термин "и/или" при использовании здесь включает значение "и", "или" и "все или любая другая комбинация элементов, объединенных указанным термином".

Термин "примерно" или "приблизительно", как используют здесь, означает в пределах 20%, предпочтительно в пределах 10% и более предпочтительно в пределах 5% данного значения или интервала.

Термины "аминокислоты" и "остатки" являются синонимами и охватывают как природные аминокислоты, так и аналоги аминокислот (например, неприродные, синтетические и модифицированные аминокислоты, включая D или L оптические изомеры).

Термины "полипептид", "пептид" и "белок" используют здесь взаимозаменяемо как относящиеся к полимерам аминокислотных остатков, которые включают девять или более чем девять аминокислот, связанных пептидными связями. Этот полимер может быть нормальным, разветвленным или циклическим и может включать встречающиеся в природе аминокислоты и/или аналоги аминокислот, а также может быть прерван не аминокислотами. В качестве общего указания, если аминокислотный полимер является длинным (например, более чем 50 аминокислотных остатков), на него предпочтительно ссылаются как на полипептид или белок, тогда как, если он имеет длину 50 аминокислот или менее, на него ссылаются как на "пептид".

В контексте настоящего изобретения термины "нуклеиновая кислота", "молекула нуклеиновой кислоты", "полинуклеотид" и "нуклеотидная последовательность" используют взаимозаменяемо, и они определяют полимер любой длины, либо молекулы полидезоксирибонуклеотидов (ДНК) (например, кДНК, геномную ДНК, плазмиды, векторы, вирусные геномы, изолированную ДНК, зонды, праймеры и любую их смесь), либо полирибонуклеотидов (РНК) (например, мРНК, антисенс-РНК), либо смешанных полирибо-полидезоксирибонуклеотидов. Они охватывают одно- или двунитевые, линейные или циклические, природные или синтетические полинуклеотиды. Кроме того, полинуклеотид может включать не встречающиеся в природе нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и нуклеотидные аналоги (см. US 5525711, US 4711955 или ЕРА 302175 как примеры модификаций), а также может быть прерван не нуклеотидными компонентами. Модификации нуклеотида, если они присутствуют, могут быть приданы до или после полимеризации.

Как используют здесь, при использовании для определения продуктов, композиций и способов под термином "включающий" следует подразумевать, что продукты, композиции и способы включают упоминаемые компоненты или стадии, но не исключают другие. Под "состоящим по существу из" следует подразумевать исключающий другие компоненты или стадии какой-либо существенной значимости. Таким образом, композиция, состоящая по существу из перечисленных компонентов, не должна исключать следовые примеси и фармацевтически приемлемые носители. Под "состоящим из" следует подразумевать исключающий более чем следовые элементы других компонентов или стадий. Например, полипептид, "состоит из" аминокислотной последовательности, когда этот полипептид не содержит какие-либо другие аминокислоты, кроме перечисленной аминокислотной последовательности. Полипептид "состоит по существу из" аминокислотной последовательности, когда такая аминокислотная последовательность присутствует вместе только с несколькими дополнительными аминокислотными остатками, типично от примерно 1 до примерно 50 дополнительных остатков или около того. Полипептид "включает" аминокислотную последовательность, когда эта аминокислотная последовательность составляет по меньшей мере часть конечной аминокислотной последовательности полипептида. Такой полипептид может иметь от нескольких вплоть до нескольких сотен дополнительных аминокислотных остатков. Такие дополнительные аминокислотные остатки могут играть роль, среди прочего, в переносе полипептида, облегчении продуцирования или очистки полипептида;

продлении времени полужизни. То же можно применить к нуклеотидным последовательностям.

Термин "клетка-хозяин" следует понимать в широком смысле как охватывающий изолированные клетки, группу клеток, а также особую организацию клеток, например, в ткани или органе. Такие клетки могут представлять собой первичные, трансформированные или культивируемые клетки. Они могут быть прокариотическими (например, Escherichia coli), дрожжевыми (например, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces pombe или Pichia pastoris), эукариотическими (например, клетками насекомых, растений и млекопитающих, включая человеческие клетки). Термин "клетка-хозяин" включает клетки, которые могут быть или являются реципиентом молекулы нуклеиновой кислоты, вектора или инфекционной вирусной частицы при применении в данном изобретении, и потомство таких клеток.

Термин "организм-хозяин" относится к позвоночному, в частности, к члену вида млекопитающих, и особенно к домашним животным, сельскохозяйственным животным, спортивным животным и приматам, включая людей. Предпочтительно организм-хозяин представляет собой пациента, страдающего персистентной папилломавирусной инфекцией, вызванной по меньшей мере одним папилломавирусом.

"Папилломавирус" относится к вирусу, который принадлежит к подсемейству Papillomavirinae. Это определение охватывает папилломавирус как животных происхождения от видов, отличных от человека, включающих, но не ограниченных ими, крупный рогатый скот, лошадей, кроликов, овец, собак, приматов, отличных от человека, и грызунов, так и человеческий папилломавирус (HPV).

"HPV" относится более конкретно к папилломавирусу происхождения от вида человек и/или способному инфицировать человека. К настоящему времени идентифицировано более чем 100 генотипов HPV, и они пронумерованы в хронологическом порядке их выделения. По договоренности классификация HPV основана на степени родства их геномов. Филогенетическое древо было сконструировано на основании выравнивания доступных нуклеотидных последовательностей (Van Ranst et al., 1992, J. Gen. Virol. 73, 2653; De Villiers et al., 2004, Virology 324, 17-27). HPV можно подразделить как "высокого риска" (HR-HPV) и "низкого риска" (LR-HPV). HR-HPV относится к HPV, который имеет сильную связь с клеточной трансформацией, которая может привести к повреждениям с потенциалом прогрессирования до злокачественных повреждений. Типы HR-HPV включают без ограничения HPV-16, HPV-18, HPV-30, HPV-31, HPV-33, HPV-35, HPV-39, HPV-45, HPV-51, HPV-52, HPV-56, HPV-58, HPV-59, HPV-66, HPV-68, HPV-70 и HPV-85. LR-HPV относится к HPV, который имеет слабый потенциал клеточной трансформации, которая может привести к доброкачественным повреждениям, таким как папилломы, с низким потенциалом прогрессирования до злокачественных повреждений. Типы LR-HPV включают без ограничения HPV-6 и HPV-11.

Папилломавирус может быть изолирован, клонирован или выделен из любого источника в природе. Такие источники включают биологические образцы, культивируемые клетки, а также рекомбинантные материалы. Как используют здесь, "биологический образец" охватывает разнообразие образцов, собранных из организма-хозяина, подвергнутого воздействию папилломавируса, которые можно использовать в качестве источника папилломавируса, либо при диагностическом или мониторинговом анализе. В контексте изобретения с биологическим образцом можно манипулировать любым путем после его сбора, как, например, путем обработки реагентами, солюбилизации или обогащения определенными компонентами (например, полипептидами или молекулами нуклеиновых кислот). Это определение охватывает биологические жидкости (например, кровь, плазму, сыворотку), жидкие образцы (например, вагинальные, цервикальные жидкости, цитологические образцы), твердые тканевые образцы (например, тканевые срезы, пробу биопсии) и тканевые культуры. Термин "культивируемые клетки' охватывает клетки в культуре (например, клетки CaSki, имеющиеся в АТСС), надосадочные жидкости клеток и клеточные лизаты. Рекомбинантные материалы включают без ограничения папилломавирус (например, имеющийся в депозитных учреждениях), папилломавирусный геном, геномные или кДНК библиотеки, плазмиды, содержащие фрагмент(ы) папилломавирусного генома или любой вектор предшествующего уровня техники, известный как включающий такие элементы.

В качестве общей информации нуклеотидные последовательности ряда папилломавирусных геномов и аминокислотные последовательности кодируемых полипептидов описаны в литературе и доступны в специализированных базах данных, например, Genbank, номера по каталогу МС_01526 и К02718 в связи с HPV-16; NCJ501357 и Х05015 в связи с HPV-18; J04353 в связи с HPV-31; М12732 в связи с HPV-33; МС_001529 в связи с HPV-35; NC_001535 в связи с HPV-39; Х74479 в связи с HPV-45; МС_001533 в связи с HPV-51; МС_001592 в связи с HPV-52; Х74483 в связи с HPV-56; D90400 в связи с HPV-58; NC 001635 в связи с HPV-59; Х67160 и М73258 в связи с HPV-68; U21941 в связи с HPV-70 и AF131950 в связи с HPV-85.

Как используют здесь, термин "полипептид Е2 папилломавируса" охватывает нативные полипептиды Е2 (то есть такие, которые экспрессируются с ОРС Е2 в источнике папилломавируса в природе), модифицированные полипептиды Е2 и их иммуногенные пептиды.

Иммуногенный пептид Е2 имеет по меньшей мере 9 аминокислот, и данный термин включает эпитопы Е2 (например, специфичные аминокислотные мотивы, которые способны индуцировать или активировать иммунный ответ посредством биохимического пути, опосредованного ГКГ класса I и/или класса II, такие как описаны в ЕР 523395), конструкцию из множества эпитопов (например, как описано в WO 2005/089164) и укороченные полипептиды Е2. Укорочение может варьировать от 1 до 300 аминокислотных остатков, которые могут быть непрерывными или нет и локализованы в N-конце и/или С-конце и/или внутренней части.

Полипептид Е2, кодируемый молекулой нуклеиновой кислоты, при применении в изобретении может иметь происхождение из любого папилломавирусного генотипа при особом предпочтении для генотипа HR-HPV, такого как генотип, выбранный из группы, состоящей из вышеперечисленных, и более конкретно HPV-16, HPV-18, HPV-33 или HPV-52, или любой их комбинации (например, обоих генотипов HPV-16 и HPV-18). Большое число нативных полипептидов Е2 описано в литературе, например, HPV-18 Е2 в Cole et al. (1987, J. Mol. Biol. 193, 599-608); HPV-16 Е2 в Seedorf et al. (1985, Virology. 145, 181-185) и Kennedy et al., (1991, J. Virol.,,65, 2093-2097), HPV-31 Е2 в Goldsborough et al. (1989, Virology 171, 306-311), HPV-33 Е2 в Cole et al. (1986, J. Virol., 58,991-995) и Е2 бычьего папилломавируса BPV-1 в Chen et al. (1982, Nature 299, 529-534) и в Danos et al. (1983, J. Virol. 46, 557-566). В целях иллюстрации аминокислотная последовательность полипептида Е2 HPV-16 приведена в SEQ ID NO: 1.

Однако настоящее изобретение не ограничено этими примерными последовательностями. В действительности нуклеотидные и аминокислотные последовательности могут варьировать между различными изолятами папилломавируса, и эта природная генетическая вариация включена в объем изобретения как и неприродная модификация(и), как описано ниже. Термин "модификация" включает делецию, замену или добавление одного или более чем одного нуклеотидного остатка или любую комбинацию этих возможностей. Когда рассматривают несколько модификаций, они могут касаться последовательных остатков и/или не последовательных остатков. Модификация(и) может быть получена в молекуле нуклеиновой кислоты при применении в изобретении с помощью ряда путей, известных специалистам в данной области техники, таких как сайт-направленный мутагенез (например, с использованием системы мутагенеза Sculptor^TM in vitro формы Amersham, Les Ullis, France), ПЦР мутагенез, перестройки ДНК, а также с помощью методик химического синтеза (например, приводящего в результате к синтетической молекуле нуклеиновой кислоты).

Модификация(и), рассматриваемая настоящим изобретением, охватывает как молчащие модификации, которые не изменяют аминокислотную последовательность кодируемого Е2 папилломавируса, так и модификации, которые транслируются в кодируемый полипептид Е2, приводя в результате к модифицированной аминокислотной последовательности по сравнению с соответствующей нативной последовательностью.

Модификации, которые являются молчащими на уровне кодируемого полипептида Е2, типично осуществляют путем замены одного или более чем одного кодона кодирующей последовательности Е2 одним или более чем одним кодоном, кодирующим ту же аминокислоту. Если остаток Met или Тrр кодирует уникальный кодон, в данной области техники хорошо известно, что 6 различных кодонов могут быть использованы для кодирования аргинина, лейцина или серина, и четыре различных кодона для кодирования аланина, глицина, пролина, треонина и валина. Поэтому возможно изменить Е2-кодирующую нуклеотидную последовательность без изменения аминокислотной последовательности. Желательно целью таких модификаций является улучшение экспрессии полипептида Е2 папилломавируса в данной клетке-хозяине или в данном организме-хозяине, например, у млекопитающего, включая человеческие клетки-хозяева. Репрезентативные примеры таких модификаций включают без ограничения супрессию редко используемого кодона(ов) за счет оптимизации кодонов, супрессию негативных элементов последовательности, для которых ожидают отрицательное влияние на уровень экспрессии, и/или супрессию гомологичных последовательностей, для которых ожидают отрицательное влияние на стабильность молекулы нуклеиновой кислоты или вектора, применяемых в настоящем изобретении.

Типично оптимизацию кодонов осуществляют путем замены одного или более чем одного "нативного" (например, HPV) кодона, соответствующего кодону, редко используемому в интересующей клетке-хозяине, одним или более чем одним кодоном, кодирующим ту же аминокислоту, которые используется чаще. Нет необходимости заменять все нативные кодоны, соответствующие редко используемым кодонам, поскольку повышенная экспрессия может быть достигнута даже при частичной замене. Кроме того, можно провести некоторые отклонения от строгого соблюдения оптимизированного использования кодонов для приспособления к введению сайта(ов) рестрикции в полученную в результате молекулу нуклеиновой кислоты. Такие молекулы нуклеиновой кислоты с оптимизированными кодонами описаны в литературе, например, в WO 01/14416, WO 02/08435 и WO 03/018055.

Репрезентативные примеры негативных элементов последовательности, которые пригодны для супрессии в контексте изобретения, включают без ограничения области, имеющие очень высокое (>80%) или очень низкое (<30%) содержание GC; области, имеющие очень высокое содержание AT; нестабильные прямые или инвертированные повторяющиеся последовательности; вторичные структуры РНК и/или внутренние криптические регуляторные элементы, такие как внутренние ТАТА-боксы, Хи-сайты, сайты присоединения рибосомы и/или донорные/акцепторные сайты сплайсинга.

Присутствие гомологичных последовательностей в молекуле нуклеиновой кислоты или векторе, применяемых в изобретении, как ожидают, оказывает отрицательное влияние на их стабильность, в частности, на стадии продуцирования вектора. Между гомологичными последовательностями может происходить рекомбинация, возможно, приводящая к потере участка, содержащегося между двумя гомологичными последовательностями. Как используют здесь, термин "гомологичные последовательности" обозначает нуклеотидные последовательности, которые сохраняют высокую степень идентичности друг другу, выше, чем по меньшей мере для 40, преимущественно по меньшей мере 45, предпочтительно по меньшей мере 50, более предпочтительно по меньшей мере 55 или даже более предпочтительно по меньшей мере 59 последовательных нуклеотидов. Высокая степень идентичности составляет 75% или более чем 75%, преимущественно 80% или более чем 80%, желательно 85% или более чем 85%, предпочтительно 90% или более чем 90%, более предпочтительно 95% или более чем 95%, еще более предпочтительно 97% или более чем 97% (например, 100% идентичности последовательности). Процент идентичности между двумя нуклеотидными последовательностями является функцией числа идентичных положений, общих для последовательностей, с учетом числа гэпов, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания, и длины каждого гэпа. Различные компьютерные программы и математические алгоритмы доступны в данной области техники для определения идентичностей в процентах между нукпеотидными последовательностями, такие как пакет программ GCG Wisconsin.

Гомологию между двумя различными нуклеотидными последовательностями предпочтительно супрессируют путем вырожденности использования кодонов по меньшей мере в одной из нуклеотидных последовательностей, так что процент идентичности между ранее гомологичными последовательностями снижается менее чем до 75%. Это можно осуществить путем замены одного или более чем одного "нативного" (например, HPV) кодона, присутствующего в гомологичном участке, одним или более чем одним кодоном, кодирующим ту же аминокислоту. Нет необходимости в вырожденности всех нативных кодонов, поскольку гомологию можно достаточно снизить при частичной замене. Такие модификации особенно полезны, когда молекула нуклеиновой кислоты или вектор, применяемые в изобретении, кодируют два полипептида папилломавируса, нуклеотидные и аминокислотные последовательности которых относительно консервативны (например, последовательности, кодирующие два или более чем два полипептида Е2, такие как полипептиды Е2 HPV-16 и HPV-18), либо которые содержат общий участок (например, HPV-16 Е1 и Е2-кодирующие последовательности, которые имеют 59 общих нуклеотидов). Репрезентативный пример такого воплощения приведен в SEQ ID NO: 6, обеспечивающей пример вырожденных последовательностей, соответствующих участку из 59 нуклеотидов, присутствующему в обеих кодирующих последовательностях, Е1 и Е2.

Модификации, которые транслируются на уровне кодируемого полипептида Е2, приводят в результате к мутации одного или более чем одного аминокислотного остатка полипептида Е2. Преимущественно модифицированный полипептид Е2 сохраняет высокую степень идентичности аминокислотной последовательности с соответствующим нативным полипептидом по всей длине аминокислотной последовательности или ее фрагмента (например, по меньшей мере 9, 20, 50, 100, 200, 300 аминокислот в длину), которая составляет 75% или более чем 75%, преимущественно более чем 80%, желательно более чем 85%, предпочтительно более чем 90%, более предпочтительно более чем 95%, еще более предпочтительно более чем 97% (например, 100% идентичности последовательности). Процент идентичности между двумя полипептидами является функцией числа идентичных положений, общих для последовательностей, с учетом числа гэпов, которые необходимо ввести для оптимального выравнивания, и длины каждого гэпа. Различные компьютерные программы и математические алгоритмы доступны в данной области техники для определения идентичностей в процентах между аминокислотными последовательностями, такие как, например, программа W2H HUSAR и программа Blast (например, Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402; Altschul et al., 2005, FEBS J. 272, 5101-5109), доступные в NCBI.

В одном воплощении молекула нуклеиновой кислоты, применяемая в изобретении, модифицирована таким образом, что она кодирует полипептид Е2, дефектный по меньшей мере по одной из биологических активностей нативного полипептида Е2, и более конкретно дефектный по активации вирусной репликации и/или транскрипции. Аминокислоты, которые являются принципиальными для этих биологических активностей, можно идентифицировать рутинными способами, как, например, путем структурного и функционального анализа, и специалист в данной области техники может легко определить тип мутации(й), которая способна снизить или запретить данную биологическую активность. В данной области техники хорошо известно, что остатки, вовлеченные в активности транскрипционной активации и репликации Е2, локализованы внутри М-концевого участка, тогда как С-концевой участок ответственен за распознавание сайтов связывания Е2 на вирусной ДНК и за димеризацию. Как используют здесь, М-концевой участок Е2 включает первые 220 аминокислотных остатков, начиная с инициатора Met. Например, можно действовать путем сайт-направленного мутагенеза или методов ПЦР в целях делеции или замены одного или более чем одного из аминокислотных остатков в пределах N-концевого участка Е2, регулирующего вирусную репликацию, таким образом, чтобы значительно снизить или запретить функцию репликации Е2 и создать полипептид Е2, дефектный по репликации папилломавирусного генома. Альтернативно или в сочетании с этим можно делетировать или заменить один или более чем один из аминокислотных остатков в пределах М-концевого участка Е2, ответственного за транскрипционную активацию, таким образом, чтобы значительно снизить или запретить способность Е2 к активации транскрипции с папилломавирусных промоторов. Репрезентативные примеры пригодных дефектных полипептидов Е2 описаны в литературе, доступной специалистам в данной области техники, например, в Demeret et al. (1995, Nucleic Acids Res. 23, 4777-4784), Sakai et al. (1996, J. Virol. 70, 1602-1611), Brokaw et al. (1996, J. Virology 70, 23-29) и Ferguson et al. (1996, J. Virology 70, 4193-4199). Снижение или отсутствие активностей репликации и транскрипционной активации Е2 может быть легко определено в соответствующих анализах с использованием стандартных способов, известных специалистам в данной области техники (Sakai et al., 1996, J. Virol. 70, 1602-1611).

Предпочтительный дефектный по репликации полипептид Е2, кодируемый нуклеиновой кислотой, применяемой в изобретении, имеет происхождение от HPV-16 и включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID N0: 1, за исключением того, что по меньшей мере остаток Glu в положении 39 (Е39) модифицирован, например, заменен любым аминокислотным остатком, иным, чем Glu. Другой предпочтительный полипептид Е2, дефектный по транскрипционной активации, имеет происхождение от HPV-16 и включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, за исключением того, что по меньшей мере остаток Не в положении 73 (173) модифицирован, например, заменен любым аминокислотным остатком, иным, чем Не. Даже более предпочтительный полипептид Е2, дефектный и по репликации, и по транскрипционной активации, имеет происхождение от HPV-16 и включает аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 1, за исключением того, что по меньшей мере остаток Glu (E39) в положении 39 и остаток Не в положении 73 (173) модифицированы, например, заменены любым аминокислотным остатком, иным, чем Glu и Не, в соответствующих положениях 39 и 73. Более предпочтительно остаток Glu в положении 39 и/или остаток Не в положении 73 заменены остатком Ala (E39A и/или 173А). В контексте изобретения такой дефектный полипептид Е2 может иметь происхождение от любого папилломавируса, и в пределах компетенции специалистов в данной области техники находится адаптация модификаций, описанных в связи с HPV-16 Е2, к полипептиду Е2, имеющему происхождение от другого генотипа папилломавируса (например, аминокислотные остатки, локализованные в положении, эквивалентном положению 39 и/или положению 73 HPV-16 Е2, могут быть идентифицированы путем сравнения последовательностей и модифицированы с помощью стандартных методик). Для целей изобретения такие остатки соответствуют, соответственно, Glu в положении 43 и Не в положении 77 в HPV-18 Е2, Glu в положении 39 и Не в положении 73 в HPV-33 и HPV-52.

В другом воплощении молекулу нуклеиновой кислоты, применяемую в изобретении, модифицируют таким образом, что она кодирует гибрид полипептида Е2 папилло