Катализатор биологического происхождения для задержки процессов развития растений

Катализатор биологического происхождения для задержки процессов развития растений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к способам задержки развития растений, включающим воздействие на растение или часть растения одной или более бактерий или ферментов. Дополнительно предусмотрены устройства задержки процесса развития растений.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Образование этилена в растениях и частях растений вызвано многообразием внешних факторов и стрессоров, включая повреждения, применение гормонов (например, ауксина), анаэробные условия, охлаждение, нагрев, засушливость и заражение патогенами. Повышенное образование этилена также наблюдается во многих процессах развития растений, включая созревание плодов или овощей, прорастание семян, опадание листьев и увядание цветков.

Биосинтез этилена в растениях традиционно изображают в виде биокаталитической схемы, включающей три фермента, обычно называемой “цикл Янга”, в которой синтаза S-аденозил-L-метионина (SAM) катализирует превращение метионина в S-аденозил-L-метионин (AdoMet); синтаза 1-аминоциклопропан-1-карбоксильной кислоты (ACC) катализирует превращение AdoMet в ACC; и ACC-оксидаза катализирует превращение ACC в этилен и побочные продукты диоксид углерода и цианистый водород. Общее описание биосинтеза этилена в растениях и процессов развития растений, регулируемых этиленом, можно найти, например, в Srivastava (2001) Plant Growth and Development: Hormones and Environment (Academic Press, New York).

Ранее проведенные исследования показали, что созревание климактерических плодов вызывается, по меньшей мере частично, внезапным и значительным усилением биосинтеза этилена. Хотя резкое увеличение образования этилена участвует в процессе созревания климактерических плодов, точный механизм этого процесса, особенно для неклимактерических плодов, до конца не понят. Хотя в неклимактерическом плоде отсутствует внезапный рост продукции этилена, неклимактерический плод также реагирует на этилен. Более того, плоды, овощи и другие продукты растительного происхождения отличаются по количеству синтезируемого этилена, а также по чувствительности определенного продукта к этилену. Например, для яблок характерен высокий уровень синтеза этилена и чувствительности к этилену, тогда как у артишоков обнаружен низкий уровень биосинтеза этилена и чувствительности к этилену. См., например, Cantwell (2001) “Properties and Recommended Conditions for Storage of Fresh Fruit and Vegetables” на сайте postharvest.ucdavis.edu/Produce/Storage/index.shtml (дата последнего обращения: 6 марта, 2007 г.), которая полностью включена в данную заявку посредством ссылки. Созревание плода обычно приводит к изменению цвета, размягчению околоплодника и изменению содержания сахара и вкуса плода. Тогда как созревание в начальной стадии делает плод более съедобным и привлекательным для употребления в пищу, этот процесс в конечном счете приводит к деградации и ухудшению качества плода, делая его неприемлемым для употребления и приводя к значительному коммерческому убытку в стоимостном выражении. Контроль процесса созревания желателен для улучшения срока хранения и увеличения времени, доступного для транспортировки, хранения и продажи плода и других сельскохозяйственных продуктов, подлежащих созреванию.

Помимо резкого увеличения биосинтеза этилена в климактерических плодах, изменения при созревании также связаны с повышением интенсивности дыхания. В результате дыхания плодов, овощей и других продуктов растительного происхождения образуется теплота и, следовательно, она оказывает влияние на срок хранения и требуемые условия хранения (например, хранение в холодильнике) этих продуктов. Продукты растительного происхождения с более интенсивным дыханием (например, артишоки, срезанные цветы, спаржа, брокколи, шпинат, и т.д.) имеют более короткие сроки хранения, чем продукты с менее интенсивным дыханием (например, орехи, финики, яблоки, цитрусовые, виноград, и т.д.). На дыхание оказывает влияние ряд факторов окружающей среды, включая температуру, состав атмосферы, физический стресс, дневной свет, химический стресс, радиацию, стресс, вызванный недостатком воды, регуляторы роста и поражение патогенами. В частности, температура играет значительную роль в интенсивности дыхания. Для общего обзора дыхательного газообмена и рекомендованных контролируемых атмосферных условий для плодов, овощей и других продуктов растительного происхождения см., например, Kader (2001) Postharvest Horticulture Series No. 22A:29-70 (Калифорнийский университет в Дейвисе); Saltveit (Калифорнийский университет в Дейвисе) “Respiratory metabolism” на usna.usda.gov/hb66/019respiration.pdf (дата последнего обращения: 6 марта, 2007 г.); и Cantwell (2001) “Properties and Recommended Conditions for Storage of Fresh Fruit and Vegetables” на postharvest.ucdavis.edu/Produce/Storage/index.shtml (дата последнего обращения: 6 марта, 2007 г.), каждая из которых полностью включена в данную заявку посредством ссылки.

Способы и композиции для задержки процесса созревания плода включают, например, применение солей серебра (например, тиосульфата серебра), 2,5-норборнадиена, перманганата калия, 1-метилциклопропена (1-MCP), циклопропена (CP) и их производных. Эти соединения имеют значительные недостатки, как, например присутствие тяжелых металлов, дурных запахов и взрывоопасных свойств при сжатии, что делает их неприемлемыми или ограничивает их применимость для использования в пищевой промышленности. Трансгенные способы контроля образования этилена для задержки процессов развития растений (например, созревания плода) путем введения последовательностей нуклеиновых кислот, которые ограничивают образование этилена, особенно путем уменьшения экспрессии ферментов ACC синтазы или ACC оксидазы, также находятся в стадии исследования. Общественная реакция на генетически модифицированные сельскохозяйственные продукты тем не менее неблагосклонна.

Соответственно, в данной отрасли сохраняется существенная необходимость в безопасных способах и устройствах для задержки процессов развития растений. Такие способы и устройства могли бы обеспечить лучший контроль за созреванием плодов, созреванием овощей, увяданием цветов, опадением листьев и прорастанием семян, и продлить срок хранения различных сельскохозяйственных продуктов (например, плодов, овощей и срезанных цветов), тем самым позволяя транспортировку этих продуктов на более дальние расстояния без необходимости охлаждения, повышая привлекательность продукта для потребителей и уменьшая денежные расходы, связанные с потерей продукта вследствие преждевременного созревания и увядания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предусмотрены способы задержки процесса развития растений, включающие, но не ограниченные перечисленными: созревание плодов, созревание овощей, увядание цветов и опадание листьев. Способы согласно настоящему изобретению, как правило, включают воздействие на растение или часть растения одной или более бактерий в количестве, достаточном для задержки процесса развития интересующих растений. В некоторых аспектах настоящего изобретения, бактерии выбраны из группы, состоящей из: видов Rhodococcus, Pseudomonas chloroaphis, Brevibacterium ketoglutamicum, и их смесей. Бактерии, используемые для применения на практике способов согласно настоящему изобретению, могут быть дополнительно обработаны стимулирующим агентом, включая, например, аспарагин, глутамин, кобальт, мочевину, и их смеси, чтобы индуцировать способность бактерий задерживать процесс развития интересующих растений.

Настоящее изобретение дополнительно обеспечивает устройства задержки процесса развития растений, включающие катализатор, содержащий одну или более бактерий, особенно видов Rhodococcus, Pseudomonas chloroaphis, Brevibacterium ketoglutamicum, или их смесь. Любое устройство, которое позволяет осуществлять воздействие катализатора на растение или часть растения и задерживает процесс развития интересующих растений, входит в объем настоящего изобретения. Типичные устройства включают такие, в которых катализатор иммобилизован на матрице и помещен внутри, помещен сверху или другим способом прикреплен к любой физической структуре. Различные конфигурации описанных устройств предусмотрены и подробнее описаны ниже в данной заявке. Способы и устройства согласно настоящему изобретению для задержки процесса развития растений могут найти применение, в частности, для увеличения срока хранения и облегчения транспортировки на дальние расстояния продуктов растительного происхождения, таких как, например, плоды, овощи и цветы, улучшения удовлетворенности потребителя в продукте и уменьшения потери продукта в результате преждевременного созревания или увядания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Таким образом, после того, как изобретение описано в общих чертах, в данном разделе представлены сопроводительные фигуры, которые не обязательно выполнены в масштабе, и на которых:

На ФИГ. 1 представлено неограничивающее объем изобретения изображение трехслойного устройства для задержки созревания плодов. Наружные слои (обозначенные A и B) обеспечивают структурную целостность устройства. Каталитический слой, определенный ниже в данной заявке, включает один или более ферментов согласно настоящему изобретению, и он расположен между наружными слоями.

На ФИГ. 2A-C представлены неограничивающие объем изобретения изображения различных устройств для задержки созревания плодов. Эти устройства включают каталитический слой, один или более слоев, предназначенных для обеспечения структурной целостности, и один или более слоев, которые должны быть удалены перед применением устройства. Удаление одного или более из этих слоев может, например, открыть клейкое вещество для прикрепления устройства к другой физической структуре.

На ФИГУРАХ 3A-3B представлено неограничивающее объем изобретения изображение устройства для задержки созревания плодов. Устройство включает катализатор, иммобилизованный на слое пленки и закрепленный на физической структуре (например, ящике, подходящем для хранения/транспортировки плодов).

На ФИГ. 4 представлено неограничивающее объем изобретения изображение устройства для задержки созревания плодов. Устройство включает сегментированную полостную структуру, которая позволяет осуществлять вставку и замену одной или более каталитических модульных секций, как описано ниже. Наружные слои физической структуры могут состоять из материала, который позволяет воздуху проникать в катализатор.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящие изобретения будут описаны далее более подробно со ссылкой на конкретные варианты реализации настоящего изобретения и, в частности, на различные фигуры, представленные в приложении. В действительности, настоящее изобретение может быть реализовано во многих различных формах и объем изобретения не ограничивается вариантами реализации, описанными в данной заявке; скорее, эти варианты реализации представлены с тем, чтобы настоящее описание изобретения удовлетворяло соответствующим законодательным требованиям. В настоящем описании, и в прилагаемой формуле изобретения, единственное число включает ссылку на множественное, если в контексте четко не указано иное.

Везде в настоящем описании слово “включающий”, или его грамматические формы, следует понимать в значении, которое подразумевает включение указанного элемента, числа или этапа, или группы элементов, чисел или этапов, но не исключение возможности присутствия любого другого элемента, числа или этапа, или группы элементов, чисел или этапов.

Настоящее изобретение обеспечивает способы задержки интересующего процесса развития растений, включающие воздействие на растение или часть растения одной или более бактерий. В конкретных вариантах реализации описаны способы задержки процесса развития растений, включающие воздействие на растение или часть растения одной или более бактерий, выбранных из группы, состоящей из видов Rhodococcus, Pseudomonas chloroaphis, Brevibacterium ketoglutamicum, и их смесей, при этом указанные одна или более бактерий воздействуют на растение или часть растения в количестве, достаточном для задержки процесса развития растений. Дополнительно предусмотрены устройства для задержки интересующего процесса развития растений и для осуществления способов, описанных в данной заявке. Способы и устройства согласно настоящему изобретению можно применять, например, для задержки процесса созревания плодов/овощей или процесса увядания цветов и для повышения срока хранения плодов, овощей или цветов, что таким образом облегчает транспортировку, дистрибуцию и продажу таких продуктов растительного происхождения.

В данной заявке термин “растение” или “часть растения” широко определен и включает целые растения и любую часть растения, включая, но не ограничиваясь перечисленными: плоды, овощи, цветы, семена, листья, орехи, зародыши, пыльцу, семяпочки, ветки, косточки, колосья, початки, кожуру, стебли, корни, кончики корней, пыльники, и тому подобное. В конкретных вариантах реализации, часть растения представляет собой плод, овощ или цветок. В некоторых вариантах настоящего изобретения, часть растения представляет собой плод, конкретнее климактерический плод, описанный более подробно ниже.

Способы и устройства согласно настоящему изобретению направлены на задержку процесса развития растений, например, процесса развития растений, как правило, связанного с повышенным биосинтезом этилена. Термин “процесс развития растений” подразумевает любой процесс роста или развития растения или части растения, включая, но не ограничиваясь перечисленными: созревание плодов, созревание овощей, увядание цветов, опадание листьев, прорастание семян, и тому подобное. В конкретных вариантах реализации, интересующий процесс развития растений представляет собой созревание плодов или овощей, увядание цветов или опадение листьев, в частности созревание плодов или овощей. Определенный в данной заявке термин “задержка процесса развития растений”, и его грамматические формы, относится к любому замедлению, прерыванию, подавлению или ингибированию процесса развития интересующих растений или фенотипических или генотипических изменений растения или части растения, обычно связанных с конкретным процессом развития растения. Например, когда интересующий процесс развития растения представляет собой созревание плодов, задержка созревания плодов может включать ингибирование изменений, как, правило связанных с процессом созревания (например, с изменением цвета, размягчением околоплодника (т.е. стенки завязи), повышением содержания сахара, изменением вкуса, общим разрушением/ухудшением плода и потенциальным уменьшением привлекательности плода для потребителей, как описано выше). Для специалиста в данной области очевидно, что период времени, требуемый для созревания плодов, будет изменяться, например, в зависимости от типа плода и конкретных применяемых условий хранения (например, температуры, влажности, вентиляции, и т.д.). Соответственно, “задержка созревания плодов” может составлять от 1 до 90 дней, конкретнее от 1 до 30 дней, конкретнее от 5 до 30 дней. Способы оценки задержки процесса развития растений, такого как созревание плодов, созревание овощей, увядание цветов и опадание листьев, известны специалистам в данной области и могут быть основаны, например, на сравнении с процессами развития растений для необработанных растений или частей растений. В некоторых аспектах настоящего изобретения, задержки в процессе развития растений, обусловленные применением на практике способов согласно настоящему изобретению, можно оценить по сравнению с необработанными растениями или частями растений, или с растениями или частями растений, которые были обработаны одним или более агентами, задерживающими интересующий процесс развития растений. Например, задержку в созревании плодов, обусловленную осуществлением способа согласно настоящему изобретению, можно сравнить со временем созревания плодов для необработанного плода или плода, который был обработан агентом против созревания, таким как описанные выше в данной заявке.

Способы задержки процесса развития растений согласно настоящему изобретению обычно включают осуществление воздействия на растение или часть растения одной или более из следующих бактерий: виды Rhodococcus, Pseudomonas chloroaphis, Brevibacterium ketoglutamicum, или смесью, содержащей любую комбинацию этих бактерий. В некоторых вариантах реализации, одна или более бактерий включают виды Rhodococcus, в частности штамм DAP 96253 Rhodococcus rhodochrous, штамм DAP 96622 вида Rhodococcus, Rhodococcus erythropolis, или их смеси. В данной заявке, воздействие на растение или часть растения одной или более из вышеупомянутых бактерий включает, например, воздействие интактных бактериальных клеток, лизатов бактериальных клеток и бактериальных экстрактов, которые обладают ферментной активностью (т.е. “ферментных экстрактов”). Способы получения лизатов и ферментных экстрактов из клеток, включая бактериальные клетки, являются общеизвестными в данной области. Одна или более бактерий, используемых в способах и устройствах согласно настоящему изобретению, может иногда в более общем смысле упоминаться в данной заявке как “катализатор”.

В соответствии со способами согласно настоящему изобретению, осуществляют воздействие на растение или часть растения одной или более бактериями, в количестве, достаточном для задержки процесса развития растения. Осуществление “воздействия” на растение или часть растения одной или более бактериями согласно настоящему изобретению включает любой способ воздействия бактерией на растение или часть растения. Непрямые способы воздействия включают, например, помещение бактерии или смеси бактерий на произвольное расстояние от растения или части растения (т.е. непрямое воздействие). В других вариантах реализации, бактерии могут воздействовать на растение или часть растения посредством близкого или непосредственного контакта. Более того, используемый в данной заявке термин “достаточное” количество одной или более бактерий согласно настоящему изобретению зависит от множества факторов, включая, но не ограничиваясь перечисленными: конкретные используемые в способе бактерии, форму, в которой бактерии воздействуют на растение или часть растения (например, в виде интактных бактериальных клеток, клеточных лизатов или ферментных экстрактов, как описано выше), способы воздействия бактерии на растение или часть растения, и период времени воздействия. Специалист в данной области при помощи обычных экспериментов сможет определить “достаточное” количество одной или более бактерий, необходимых для задержки процесса развития интересующих растений.

Хотя в конкретных вариантах реализации настоящего изобретения одна или более бактерий выбраны из группы, состоящей из: видов Rhodococcus, Pseudomonas chloroaphis, Brevibacterium ketoglutamicum, любую бактерию, которая задерживает процесс развития растения при ее воздействии на растение или часть растения, можно применять в способах и устройствах согласно настоящему изобретению. Например, бактерии, принадлежащие к роду Nocardia [см. заявку на патент Японии номер 54-129190], Rhodococcus [см. заявку на патент Японии номер 2-470], Rhizobium [см. заявку на патент Японии номер 5-236977], Klebsiella [заявка на патент Японии номер 5-30982], Aeromonas [заявка на патент Японии номер 5-30983], Agrobacterium [заявка на патент Японии номер 8-154691], Bacillus [заявка на патент Японии номер 8-187092], Pseudonocardia [заявка на патент Японии номер 8-56684], Pseudomonas и Mycobacterium, представляют собой неограничивающие примеры микроорганизмов, которые можно применять согласно настоящему изобретению. Не все виды, принадлежащие к данному роду, могут проявлять одинаковые свойства. Таким образом, возможно, что род, о котором известно, что он включает штаммы, способные проявлять желаемую активность (например, способность задерживать определенный процесс развития растений, такой как созревание плодов), может также включать один или более видов, которые обычно не проявляют желаемой активности. В свете описания настоящего изобретения, приведенного в данной заявке, и известного уровня техники в данной области тем не менее специалисту в данной области потребуются рутинные эксперименты, чтобы провести анализ и определить, обладают ли определенные виды одной или более из желаемых активностей.

Кроме того, конкретные примеры бактерий, используемых согласно настоящему изобретению, включают, но не ограничены перечисленными: вид Nocardia, вид Rhodococcus, Rhodococcus rhodochrous, вид Klebsiella, вид Aeromonas, Citrobacter freundii, Agrobacterium rhizogenes, Agrobacterium tumefaciens, Xanthobacter flavas, Erwinia nigrifluens, вид Enterobacter, вид Streptomyces, вид Rhizobium, Rhizobium loti, Rhizobium legminosarum, Rhizobium merioti, Candida guilliermondii, Pantoea agglomerans, Klebsiella pneumoniae подвида pneumoniae, Agrobacterium radiobacter, Bacillus smithii, Pseudonocardia thermophila, Pseudomonas chloroaphis, Pseudomonas erythropolis, Brevibacterium ketoglutamicum, Rhodococcus erythropolis, Nocardia farcinica, Pseudomonas aeruginosa и Heliobacter pylori. В конкретных вариантах реализации, бактерии из рода Rhodococcus, а именно штамм DAP 96253 Rhodococcus rhodochrous (номер депонирования в ATCC 55899; депонированный в ATCC 11 декабря, 1996 г.), штамм DAP 96622 вида Rhodococcus (номер депонирования в ATCC 55898; депонированный в ATCC 11 декабря, 1996 г.), Rhodococcus erythropolis, или их смеси, применяют в способах и устройствах согласно настоящему изобретению.

В некоторых вариантах настоящего изобретения, указанная одна или более бактерий “стимулированы”, с тем чтобы придать им желаемые свойства (например, способность задерживать процесс развития растений, такой как созревание плодов), путем воздействия на них или обработкой подходящим стимулирующим агентом. Стимулирующие агенты включают, но не ограничены перечисленными: аспарагин, глутамин, кобальт, мочевину или любую их смесь. В конкретных вариантах реализации, бактерии подвергают воздействию, или обрабатывают стимулирующим агентом аспарагином, в частности, смесью стимулирующих агентов, включающей аспарагин, кобальт и мочевину. Стимулирующий агент можно добавить в любой момент культивирования заданных клеток. Например, что касается бактерий, в культуральную среду можно внести стимулирующий агент перед началом культивирования бактерий. В качестве альтернативы, бактерии можно культивировать в среде в течение заранее определенного количества времени, чтобы вырастить бактерии, и стимулирующий агент можно добавить в один или более заранее определенных моментов времени, чтобы индуцировать желаемую ферментную активность бактерий. Более того, стимулирующий агент можно добавить в питательную среду (или в отдельную смесь, включающую ранее выращенные бактерии), чтобы индуцировать желаемую активность бактерий по завершении роста бактерий.

Не ограничиваясь определенным механизмом, “стимулирование” бактерий согласно настоящему изобретению может привести к образованию (или к усиленному образованию) одного или более ферментов, таких как нитрилгидратаза, амидаза и/или аспарагиназа, и стимулирование одного или более из этих ферментов может играть роль в задержке процесса развития интересующих растений. “Нитрилгидратазы”, “амидазы” и “аспарагиназы” включают семейства ферментов, присутствующих в клетках различных организмов, включая, но не ограничиваясь перечисленными: бактерии, грибы, растения и животные. Такие ферменты хорошо известны специалистам в данной области, и каждый класс ферментов обладает хорошо известными ферментативными активностями. “Ферментная активность” в данной заявке, как правило, относится к способности фермента выполнять функцию катализатора в процессе, таком как превращение одного соединения в другое. В частности, нитрилгидратаза катализирует гидролиз нитрила (или циангидрина) в соответствующий амид (или оксикислоту). Амидаза катализирует гидролиз амида в соответствующую кислоту или гидроксикислоту. Аналогично, фермент аспарагиназы, такой как аспарагиназа I, катализирует гидролиз аспарагина в аспарагиновую кислоту.

В некоторых вариантах настоящего изобретения, ферментвная активность может быть указана в “единицах” на массу фермента или клеток (обычно на основании сухого веса клеток, например, единицы/мг свк). “Единица”, как правило, относится к способности преобразовывать определенное количество соединения в другое соединение при определенных условиях, как функция от времени. В определенных вариантах реализации, одна “единица” активности нитрилгидратазы может относиться к способности преобразовывать один мкмоль акрилонитрила в соответствующий амид в минуту, на миллиграмм клеток (сухой вес) при pH 7,0 и температуре, равной 30ºC. Аналогично, одна единица активности амидазы может относиться к способности преобразовывать один мкмоль акриламида в соответствующую кислоту в минуту, на миллиграмм клеток (сухой вес) при pH 7,0 и температуре, равной 30ºC. Дополнительно, одна единица активности аспарагиназы может относиться к способности преобразовывать один мкмоль аспарагина в соответствующую кислоту в минуту, на миллиграмм клеток (сухой вес) при pH 7,0 и температуре, равной 30ºC. Тесты для измерения активности нитрилгидратазы, амидазы, или активности аспарагиназы известны в данной области и включают, например, детектирование свободного аммиака. См. Fawcett и Scott (1960) J. Clin. Pathol. 13:156-159, которая полностью включена в данную заявку посредством ссылки.

Способы задержки процесса развития растения, включающие воздействие на растение или часть растения одним или более ферментов, выбранных из группы, состоящей из нитрилгидратазы, амидазы, аспарагиназы, или их смеси, при этом один или более ферментов воздействуют на растение или часть растения в количестве или при уровне ферментной активности, достаточном для задержки процесса развития растения, дополнительно входят в объем настоящего изобретения. Например, целые клетки, которые производят, стимулированы для производства, или генетически модифицированы для производства одного или более из вышеупомянутых ферментов (т.е. нитрилгидратазы, амидазы и/или аспарагиназы), можно применять в способах задержки процесса развития растения. В качестве альтернативы, нитрилгидратазу, амидазу и/или аспарагиназу можно выделить, очистить или частично очистить из любых из вышеупомянутых клеток и подвергнуть их действию растение или часть растения в более изолированной форме. См., например, Goda и др. (2001) J. Biol. Chem. 276:23480-23485; Nagasawa и др. (2000) Eur. J. Biochem. 267:138-144; Soong и др. (2000) Appl. Environ. Microbiol. 66:1947-1952; Kato и др. (1999) Eur. J. Biochem. 263:662-670, каждая из которых полностью включена в данную заявку посредством ссылки. Кроме того, для специалиста в данной области очевидно, что один тип клеток может быть способен производить (или его можно стимулировать, или генетически модифицировать для производства) более чем одного из ферментов согласно настоящему изобретению. Такие клетки являются подходящими для применения в описанных способах и устройствах.

Последовательности нуклеотидов и аминокислот для нескольких нитрилгидратаз, амидаз и аспарагиназ из различных организмов описаны в открытых для доступа базах данных последовательностей. Неограничивающий список типичных нитрилгидратаз и алифатических амидаз, известных в данной области, приведен в Таблицах 1 и 2 и в списке последовательностей. “Белковый показтель”, упоминаемый в Таблицах 1 и 2, обеспечивает общее представление о процентных интервалах достоверности (% инт. достовер.) идентификации выделенных белков на основании результатов масс-спектроскопии.

Таблица 1Информация о последовательности аминокислот для типичных нитрилгидратаз
Организм-источник	Номер доступа	Идентификатор последовательности	Белковый индекс(% инт. достовер.)
Вид Rhodococcus	806580	SEQ ID NO:1	100%
Вид Nocardia	27261874	SEQ ID NO:2	100%
Rhodococcus rhodochrous	49058	SEQ ID NO:3	100%
Некультивированная бактерия (BD2); бета-субъединица нитрилгидратазы	27657379	SEQ ID NO:4	100%
Вид Rhodococcus	806581	SEQ ID NO:5	100%
Rhodococcus rhodochrous	581528	SEQ ID NO:6	100%
Некультивированная бактерия (SP1); альфа-субъединица нитрилгидратазы	7657369	SEQ ID NO:7	100%

Таблица 2Информация о последовательности аминокислот для типичных алифатических амидаз
Организм-источник	Номер доступа	Идентификатор последовательности	Белковый скор(% инт. достовер.)
Rhodococcus rhodochrous	62461692	SEQ ID NO:8	100%
Nocardia farcinica IFM 10152	54022723	SEQ ID NO:9	100%
Pseudomonas aeruginosa PAO1	15598562	SEQ ID NO:10	98,3%
Helicobacter pylori J99	15611349	SEQ ID NO:11	99,6%
Helicobacter pylori 26695	2313392	SEQ ID NO:12	97,7%
Pseudomonas aeruginosa	150980	SEQ ID NO:13	94%

Как правило, любую бактериальную, грибковую, растительную или животную клетку, способную производить или которую можно стимулировать для производства нитрилгидратазы, амидазы, аспарагиназы, или любой их комбинации, можно использовать в реализации настоящего изобретения. Нитрилгидратаза, амидаза и/или аспарагиназа могут образовываться конститутивно в клетке, взятой из определенного организма (например, в клетке бактерии, грибка, растения или животного) или, в качестве альтернативы, клетка может производить желаемый фермент или ферменты только после “индукции” подходящим стимулирующим агентом. Термин “конститутивно” предназначен для обозначения того, что по меньшей мере один фермент согласно настоящему изобретению непрерывно образуется или экспрессируется в определенном типе клеток. Другие типы клеток тем не менее могут нуждаться в “стимулировании”, как описано выше, чтобы экспрессировать нитрилгидратазу, амидазу и/или аспарагиназу в достаточном количестве или с достаточным уровнем ферментной активности для задержки процесса развития интересующих растений. То есть фермент согласно настоящему изобретению может продуцироваться (или продуцироваться на достаточном уровне) только после воздействия или обработки подходящим стимулирующим агентом. Такие стимулирующие агенты известны в данной области и приведены выше. Например, в некоторых вариантах настоящего изобретения, одну или более бактерий обрабатывают стимулирующим агентом, таким как аспарагин, глутамин, кобальт, мочевина, или любой их смесью, конкретнее, смесью аспарагина, кобальта и мочевины. Более того, как описано в заявке на патент США, находящейся на рассмотрении, номер 11/669,011, под названием “Induction and Stabilization of Enzymatic Activity in Microorganisms”, поданной 30 января, 2007 г., активность аспарагиназы I можно индуцировать в DAP 96622 Rhodococcus rhodochrous (грамположительный) или в DAP 96253 вида Rhodococcus (грамположительный), в среде, дополненной амидсодержащими аминокислотами, или их производными. Другие штаммы Rhodococcus также можно предпочтительно аналогично индуцировать, чтобы они проявляли ферментную активность аспарагиназы I, применяя амидсодержащие аминокислоты, или их производные.

В других вариантах настоящего изобретения, P. chloroaphis (номер депонирования в ATCC 43051), которая производит активную аспарагиназу I в присутствии аспарагина, и B. kletoglutamicum (номер депонирования в ATCC 21533), грамположительная бактерия, для которой также известно, что она продуцирует активную аспарагиназу, применяются в описанных способах. Грибковые клетки, такие как клетки рода Fusarium, клетки растений и клетки животных, которые экспрессируют нитрилгидратазу, амидазу и/или аспарагиназу, можно также применять в способах и устройствах, описанных в данной заявке, либо в виде целых клеток, либо в виде источника, из которого можно выделить один или более из вышеупомянутых ферментов.

В дополнительных вариантах реализации, клетки-хозяева, которые были изменены методами генетической инженерии, для экспрессирования нитрилгидратазы, амидазы и/или аспарагиназы, можно применять, подвергая их действию растение или часть растения, в соответствии со способами согласно настоящему изобретению и устройствами для задержки процесса развития растений. В частности, полинуклеотид, который кодирует нитрилгидратазу, амидазу или аспарагиназу (или множество полинуклеотидов, каждый из которых кодирует нитрилгидратазу, амидазу или аспарагиназу), можно ввести с помощью стандартных методик молекулярной биологии в клетку-хозяина, чтобы получить трансгенную клетку, которая экспрессирует один или более ферментов согласно настоящему изобретению. Использование терминов “полинуклеотид”, “полинуклеотидная структура”, “нуклеотид” или “нуклеотидная структура” не подразумевается ограничивающим настоящее изобретение полинуклеотидами или нуклеотидами, включающими ДНК. Для средних специалистов в данной области будет очевидно, что полинуклеотиды и нуклеотиды могут включать рибонуклеотиды и комбинации рибонуклеотидов и дезоксирибонуклеотидов. Такие дезоксирибонуклеотиды и рибонуклеотиды включают как встречающиеся в природе молекулы, так и синтетические аналоги. В полинуклеотиды согласно настоящему изобретению также входят все формы последовательностей, включая, но не ограничиваясь, перечисленными: одноцепочечные формы, двухцепочечные формы, и тому подобное.

Варианты и фрагменты полинуклеотидов, которые кодируют полипептиды, которые сохраняют желаемую ферментную активность (т.е. нитрилгидратазную, амидазную или аспарагиназную активность), можно также использовать в реализации настоящего изобретения. Под термином “фрагмент” подразумевается часть полинуклеотида и, следовательно, он также кодирует часть соответствующего белка. Полинуклеотиды, которые представляют собой фрагменты нуклеотидной последовательности фермента, как правило, включают по меньшей мере 10, 15, 20, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 800, 900, 1,000, 1,100, 1,200, 1,300, или 1,400 последовательных нуклеотидов, или вплоть до количества нуклеотидов, присутствующих в полноразмерной полинуклеотидной последовательности фермента. Фрагмент полинуклеотида кодирует полипептид с желаемой ферментной активностью и, как правило, кодирует по меньшей мере 15, 25, 30, 50, 100, 150, 200 или 250 последовательных аминокислот, или вплоть до общего количества аминокислот, присутствующих в полноразмерной последовательности аминокислот фермента согласно настоящему изобретению. Термин “вариант” предназначен для обозначения по существу сходных последовательностей. Как правило, варианты определенной последовательности фермента согласно настоящему изобретению по меньшей мере приблизительно на 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или более идентичны с эталонной последовательностью фермента, что можно определить с помощью стандартных программ выравнивания последовательностей. Варианты полинуклеотидов, входящие в объем настоящего изобретения, кодируют полипептиды с желаемой ферментной активностью.

В контексте получения трансгенных клеток, термин “введение” предназначен для обозначения обеспечения клетки-хозяина, конкретнее, микроорганизма, такого как Escherichia coli, полинуклеотидом, который кодирует нитрилгидратазу, амидазу и/или аспарагиназу. В некоторых вариантах реализации, полинуклеотид обеспечивается таким образом, что последовательность получает доступ к внутреннему пространству клетки-хозяина, включая его возможное встраивание в геном клетки-хозяина. Способы согласно настоящему изобретению не зависят от конкретного способа введения последовательности в клетку-хозяина, за исключением того, что полинуклеотид получает доступ к внутреннему пространству по меньшей мере одной клетки-хозяина. Способы введения полинуклеотидов в клетки-хозяева хорошо известны в данной области, включая, но не ограничиваясь перечисленными: способы стабильной трансфекции, способы временной трансфекции и способы, опосредованные вирусом. Термин “стабильная трансфекция” означает, что полинуклеотидная структура, введенная в клетку-хозяина, встраивается в геном хозяина и может наследоваться ее потомством. Термин “временная трансфекция” или “временная экспрессия” означает, что полинуклеотид введен в клетку-хозяина, но не встраивается в геном хозяина.

Более того, последовательность нуклеотидов нитрилгидратазы, амидазы или аспарагиназы может содержаться, например, в плазмиде для введения в клетку-хозяина. Типичные интересующие плазмиды включают векторы, имеющие определенные сайты клонирования, точки начала репликации и селектируемые маркеры. Плазмида может дополнительно включать последовательности инициации транскрипции и трансляции и терминаторы транскрипции и трансляции. Плазмиды могут также включать типичные кассеты экспрес