Способ прогнозирования риска раннего развития ишемической болезни сердца у пациентов с клиническим диагнозом семейная гиперхолестеринемия
Патент 2483116
Авторы
Правообладатели
Классы МПК
Способ прогнозирования риска раннего развития ишемической болезни сердца у пациентов с клиническим диагнозом семейная гиперхолестеринемия
Изобретение относится к области медицины, а именно кардиологии. Предложен способ прогнозирования риска раннего развития ишемической болезни сердца у пациентов с семейной гиперхолестеринемией по одной любой мутации из списка 5 мутации гена LDLR: 478T>G (C139G), 1252G>T (Е397Х), 1696А>Т (I545F), 2389+5G>A или 2389+5G>C. Использование предлагаемого способа позволяет прогнозировать риск раннего развития ИБС у пациентов с клиническим диагнозом семейная гиперхолестеринемия, гетерозиготная форма. 5 табл.
Реферат
Изобретение относится к области медицины, а именно кардиологии, и может быть использовано при определении риска раннего развития ишемической болезни сердца (ИБС) у пациентов с клиническим диагнозом семейная гиперхолестеринемия, гетерозиготная форма (СГХС).
СГХС - моногенное аутосомно-доминантное заболевание, характеризующееся высокой концентрацией холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС-ЛПНП), сухожильными ксантомами и повышенным риском раннего возникновения ИБС [Civeira F., 2004]. СГХС является одним из наиболее частых моногенных заболеваний. Гетерозиготная форма СГХС в большинстве стран встречается с частотой 1 на 500 в общей популяции. СГХС может быть обусловлена мутациями нескольких генов: гена рецептора ЛПНП - LDLR, гена аполипопротеина В 100 - АРОВ, гена PCSK9 кодирующего конвертазу. Наиболее часто встречаются мутации генов LDLR и АРОВ, мутации гена PCSK9 встречаются только в 1-2% случаев. В настоящее время в мире известно более 1000 разных мутаций в гене LDLR, приводящих к развитию СГХС и три патогенные мутации в гене АРОВ: R3500Q, R3500W, R3531C [Soutar AK, 2007].
СГХС характеризуется высокой частотой раннего развития ИБС (в возрасте <55 лет у мужчин и <60 лет у женщин), что во многих семьях приводит к уменьшению продолжительности жизни. При этом заболевании клинически распознаваемая ИБС обычно отмечается в возрасте 45-48 лет у пациентов мужского пола и 55-58 лет - женского. Приблизительно у 85% мужчин и 50% женщин с не леченной СГХС развивается какое-либо сердечно-сосудистое осложнение до 65 лет. Длительные наблюдения показали, что ИБС является основной причиной смерти пациентов с СГХС [DeMott К, 2008; Civeira F, 2004; Sijbrands EJ, 2000]. В некоторых семьях отмечается особенно тяжёлое течение СГХС с ранними фатальными исходами у многих членов одной семьи, особенно при отсутствии адекватной терапии или при несвоевременном ее начале. Нередки случаи, когда ИБС появляется у мужчин-гетерозигот в 3-й декаде жизни, а у пациенток - до наступления менопаузы. Ежегодно в мире погибает около 200 тыс больных с СГХС вследствие потенциально предотвратимых сердечных приступов, а при длительной адекватной медикаментозной терапии, существенно снижающей уровень ХС ЛПНП, можно увеличить продолжительность жизни многих пациентов на 10-30 лет [Civeira F, 2004]. Вместе с тем ранний атеросклероз развивается далеко не у всех больных с СГХС, и нередко эти пациенты имеют нормальную продолжительность жизни даже без лечения, направленного на снижение уровня ХС [Jansen AC, 2005; Sijbrands EJ, 2000].
Понимание причин фенотипической разнородности СГХС необходимо для оценки индивидуального риска развития ИБС и подбора адекватной гиполипидемической терапии, в том числе с применением ЛПНП-афереза, в связи с чем в последнее время проводится активное изучение факторов риска развития ИБС у этих больных. Все факторы, так или иначе влияющие на сердечно-сосудистый риск при СГХС, можно разделить на 3 основные группы: 1) связанные с характером основного генетического дефекта (наличие мутации в одном из трех генов LDLR АРОВ PCSK9), 2) классические и 3) другие генетические-полигенные.
В заявляемом техническом решении разработан метод определения риска развития ранней ИБС, основанный на характеристике основного генетического дефекта.
Риск ИБС у больных СГХС в 20 раз выше, чем в общей популяции [Hopkins PN, 2011]. Согласно данным Slack и др. у больных СГХС мужчин ИБС развивалась к 30 годам у 5,4%, к 50 годам - 51,4%, к 60 годам - 85,4%, а у женщин к 50 годам - 12,2% и к 60 годам - 53,3% [Slack J., 1969]. По данным регистра Саймона Брума при исследовании 282 мужчин и 244 женщин больных СГХС смертность от ИБС самой высокой была в возрасте 20-39 лет и достоверно уменьшалась с возрастом [Betteridge DJ, 1991]. При исследовании больных СГХС из российской популяции у 61,5% больных была диагностирована ИБС, и у 31% - инфаркт миокарда [Мешков А.Н., 2009].
На клинический фенотип заболевания может оказывать влияние функциональный класс мутации, приводящей к дефектному рецептору. В одном из наиболее крупных исследований в неотобранной группе пациентов с СГХС [Defesche et al. 2003] показано, что риск ССЗ значительно различается в зависимости от типа мутации гена LDLR; у носителей мутации 1359-1 отмечался наибольший сердечно-сосудистый риск по сравнению со здоровыми родственниками, а у носителей мутации V408M наименьший (таблица 1).
| Таблица 1. | |||
| Риск ИБС у пациентов с семейной гиперхолестеринемией относительно здоровых родственников соответственно возрасту, полу и родству [Defesche et al. 2003] | |||
| Мутации | N | OP | Риск ИБС |
| (носители/здоровые) | 95%-ный ИД | ||
| N543H/2393del9bp | 241/401 | 7,83 | 3,11-19,67 |
| V408M | 77/181 | 7,01 | 2,18-22,59 |
| 1359-1 | 102/176 | 15,95 | 5,52-46,14 |
| 313+1/2 | 83/151 | 11,14 | 4,67-26,57 |
| ОР - относительный риск, ИД - интервал доверия |
Следует отметить, что вышеуказанная работа имела ряд недостатков, затрудняющих применение результатов в клинической практике: в работе сравнивались носители мутаций гена LDLR только со здоровыми родственниками и не проводилось сравнение с больными СГХС, у которых мутации в генах LDLR и АРОВ отсутствовали, некоторые пациенты до включения в исследования ранее принимали гиполипидемические препараты, что искажало естественную картину заболевания, мутации, которые описаны в работе, не встречаются в России. Работы других авторов также показали, что риск ССЗ значительно различается в зависимости от типа мутации гена LDLR, и для каждой новой описанной мутации гена LDLR требуется проведение исследований подтверждающих и уточняющих степень сердечно-сосудистого риска [Gudnason V, 1994; Gudnason V, 1995; Bertolini S,
2000; Dedoussis G.V.Z., 2004].
С учетом этих фактов были проведены исследования по поиску таких мутаций гена LDLR, по которым можно было бы делать более достоверный прогноз о крайне высоком риске раннего развития ИБС. В исследовании была проведена выборка пациентов с СГХС, ранее не получавших гиполипидемическую терапию, и сравнение с пациентами у которых при генетическом анализе мутации в генах LDLR и АРОВ отсутствовали. В результате исследований были выявлены 5 мутаций гена LDLR: 478T>G (C139G), 1252GТ (Е397Х), 1696А>Т (I545F), 2389+5G>A, 2389+5G>C, являющихся индикаторами крайне высокого риска раннего развития ИБС. Полученные результаты не известны из уровня техники, каждая мутация встречается у 2 и более неродственных пациентов.
Задачей изобретения является создание более достоверного способа прогнозирования риска раннего развития ишемической болезни сердца у пациентов с клиническим диагнозом семейная гиперхолестеринемия.
Достигаемым техническим результатом является определение риска раннего развития ишемической болезни сердца у пациентов с клиническим диагнозом семейная гиперхолестеринемия.
Поставленная задача решается тем, что в способе прогнозирования риска раннего развития ишемической болезни сердца у пациентов с семейной гиперхолестеринемией по мутации гена LDLR вывод о крайне-высоком риске раннего развития ИБС делают при наличии одной любой мутации из списка 5 мутации гена LDLR: 478T>G (C139G), 1252G>T (Е397Х), 1696А>Т (I545F), 2389+5G>A или 2389+5G>C.
В основе предлагаемого способа прогнозирования риска раннего развития ишемической болезни сердца (у мужчин до 55 лет, у женщин до 60 лет) лежит определение мутаций в генах АРОВ и LDLR. При выявлении любой мутации гена LDLR из списка (478T>G (C139G), 1252GТ (Е397Х), 1696А>Т (I545F), 2389+5G>A или 2389+5G>С) прогнозируют крайне-высокий риск раннего развития ИБС (абсолютный риск развития ИБС у мужчин до 55 лет и у женщин до 60 лет составляет более 50%); при отсутствии мутаций генов АРОВ или LDLR прогнозируют средний риск
раннего развития ИБС (абсолютный риск около 30%).
Выявленные прогностические признаки были получены в результате
проведения следующего исследования:
1. Критерии отбора больных для исследования
В исследование включались пациенты с клиническим диагнозом СГХС, гетерозиготная форма установленным на основании диагностической системы The Dutch Lipid Clinic Network (Таблица 2) - с количеством баллов 6 и более, обоих полов, ранее не получавшие гиполипидемическую терапию [DeMott К, 2008]. В исследование включались как пробанды, так и их больные родственники 1 и 2 степени родства. Пациентам проводилось обследование на наличие ИБС и наличие мутаций генов LDLR и АРОВ. Мутации в генах определяли методом анализа кривых плавления высокого разрешения (АКП) с последующим секвенированием фрагментов с аномальной кривой плавления.
| Таблица 2. Диагностические баллы, используемые при постановке диагноза семейной гиперхолестеринемии | |
| ПоказателиСемейный анамнез | Баллы |
| а Родственник 1-й степени родства с ранней (мужчины <55 лет, женщины <60 | |
| лет) ИБС или другим сосудистым поражением | |
| б Родственник 1-й степени родства с ХС ЛПНП >95-й персентили и/или | 1 |
| а Родственник 1-й степени родства с ксантомами сухожилий и/или дугой роговицы |
| б Дети моложе 18 лет с ХС ЛПНП >95-й персентили | 2 |
| История заболевания | |
| а У пациента ранняя ИБС | 2 |
| б У пациента раннее церебро-васкулярное или поражение периферических сосудов | 1 |
| Физикальное обследование | |
| а Ксантомы сухожилий | 6 |
| б Дуга роговицы в возрасте моложе 45 лет | 4 |
| Лабораторный анализ | |
| а ХС ЛПНП >8,5 ммоль/л | 8 |
| б ХС ЛПНП 6,5-8,4 ммоль/л | 5 |
| в ХС ЛПНП 5-6,4 ммоль/л | 3 |
| г ХС ЛПНП 4-4,9 ммоль/л | 1 |
| (ХС ЛПВП и ТГ - в норме) |
2. Диагностика ИБС
Диагноз ИБС устанавливали, когда: 1) отмечалась типичная ангинозная боль, а ЭКГ-проба с нагрузкой не проводилась, 2) отмечались стенокардия и положительный ЭКГ-тест с нагрузкой (когда такая проба проводилась), 3) пациент перенёс документированный инфаркт миокарда (ИМ) (см. ниже), 4) при проведении коронарографии выявлялось гемодинамически значимое поражение коронарного русла - более 50% для ствола левой коронарной артерии или более 70% при иной локализации, 5) проводились эндоваскулярные коронарные вмешательства или операция коронарного шунтирования.
3. Выделение геномной ДНК
Выделение ДНК из исследуемых образцов крови проводилось с помощью стандартной методики, селективным осаждением ДНК из лизата при помощи детергентов, с использованием коммерческих наборов фирмы «Синтол».
4. Выполнение метода анализа кривых плавления высокого разрешения
ПЦР проводилась в термоциклере «ABI 7500 fast» фирмы "Applied Biosystems". Использовалась смесь, содержащая 10 мкл ×2 MeltDoctor™ HRM master mix(Applied Biosystems), смысловой и антисмысловой праймеры к соответствующим участкам исследуемых генов, MgCl2, геномную ДНК (200 нг/мкл), H2O. Последовательность праймеров для амплификации фрагментов генов LDLR, АРОВ, используемых в тест системе на основе метода анализа кривых плавления высокого разрешения, представлены в Таблице 3. Анализ кривых высокого разрешения проводился с помощью пакета программ High Resolution Melting (HRM) Software, фирмы Applied Biosystems.
| Таблица 3 | |||
| Последовательность праймеров для амплификации фрагментов генов LDLR, АРОВ, используемых в тест системе на основе метода анализа кривых плавления высокого разрешения | |||
| Ген | Экзон | Праймер S | Праймер AS |
| LDLr | Prom | CAGCTCTTCACCGGAGACCC | ACCTGCTGTGTCCTAGCTGG |
| LDLr | 1 | ACTCCTCCCCCTGCTAGAAACCTCA | CTATTCTGGCGCCTGGAGCAAGCC |
| LDLr | 2 | TTGAGAGACCCTTTCTCCTTTTCC | GCATATCATGCCCAAAGGGG |
| LDLr | 3 | TCAGTGGGTCTTTCCTTTGAG | CAGGACCCCGTAGAGACAAA |
| LDLr | 4(1) | TGGTGTTGGGAGACTTCACA | CACTCATCCGAGCCATCTTC |
| LDLr | 4(2) | AAGTG CATCTCTCGGCAGIT | CCCCTTGGAACACGTAAAGA |
| LDLr | 4(3) | AGCTTCCAGTGCAACAGCTC | CATACCGCAGTTTTCCTCGT |
| LDLr | 4(4) | TGTTCCAAGGGGACAGTAGC | AAATCACTGCATGTCCCACA |
| LDLr | 5 | AGAAAATCAACACACTCTGTCCTG | GGAAAACCAGATGGCCAGCG |
| LDLr | 6 | TCCTCCTTCCTCTCTCTGGC | TCTGCAAGCCGCCTGCACCG |
| LDLr | 7 | GGCGAAGGGATGGGTAGGGG | GTTGCCATGTCAGGAAGCGC |
| LDLr | 8 | CATTGGGGAAGAGCCTCCCC | GCCTGCAAGGGGTGAGGCCG |
| LDLr | 9 | TCCATCGACGGGTCCCCTCTGACCC | AGCCCTCATCTCACCTGCGGGCCAA |
| LDLr | 10 | AGATGAGGGCTCCTGGTGCGATGCC | GCCCTTGGTATCCGCAACAGAGACA |
| LDLr | 10 | GATCCACAGCAACATCTACTGGACC | AGCCCTCAGCGTCGTGGATA |
| LDLr | 11 | TCCTCCCCCGCCCTCCAGCC | GCTGGGACGGCTGTCCTGCG |
| LDLr | 12 | GCACGTGACCTCTCCTTATCCACTT | CACCTAAGTGCTTCGATCTCGTACG |
| LDLr | 13 | GTCATCTTCCITGCTGCCTG | GTTTCCACAAGGAGGITTCAAGGTT |
| LDLr | 14 | GAATCTTCTGGTATAGCTGAT | GCAGAGAGAGGCTCAGGAGG |
| LDLr | 15 | GAAGGGCCTGCAGGCACGTGGCACT | GTGTGGTGGCGGGCCCAGTCTTT |
| LDLr | 16 | CCTTCCTTTAGACCTGGGCC | CATAGCGGGAGGCTGTGACC |
| LDLr | 17 | GGGTCTCTGGTCTCGGGCGC | GGCTCTGGCTTTCTAGAGAGGG |
| LDLr | 18 | GCCTGTTTCCTGAGTGCTGG | TCTCAGGAAGGGTTCTGGGC |
| АРОВ | 26 | TGTCAAGGGTTCGGTTCTTT | GGGTGGCTTTGCTTGTATGT |
5. Секвенирование фрагментов с аномальной температурой плавления ПЦР-амплификация фрагментов генов для ссквенирования: ПЦР проводилась в термоциклере «Mastercycler Gradien» фирмы "Eppendorf". Использовалась смесь, содержащая 2 мкл ×10 ПЦР-буфера с 15 мМ MgCl2 (MBI Fermentas), смысловой и антисмысловой праймеры к соответствующим участкам исследуемых генов, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов, геномную ДНК (200 нг/мкл), 2-3 ед рекомбинантной термостабильной Taq-полимеразы (MBI Fermentas) и деионизированную воду до конечного объема. Последовательность праймеров для амплификации фрагментов генов LDLR, АРОВ, используемых в тест-системе на основе метода прямого секвенирования, представлены в Таблице 4.
| Таблица 4. | ||
| Последовательность праймеров для амплификации фрагментов генов LDLR, АРОВ, используемых в тест системе на основе метода прямого секвенирования | ||
| Ген и экзон | Прямой праймер (5'-3') | Обратный праймер (5'-3') |
| LDLR 1 | TCCTCCCCCTGCTAGAAACC | CCAGCCGTTTGGGAAGG |
| 2 | TTTTCCCATACCCCAGAGAGTC | ТСАТТСТСТССССАССТССТААТ |
| 3 | TCAGTGGGTCTTTCCTTTGAGTG | AGCGGCTTGCCAGTGTGT |
| 4 | CGAGAGGGCAGTGGTTCAGAGTC | TCCACTTCGGCACCTAAATCA |
| 5 | GCAAAAGGCCCTGCTTCTTT | GCAAGCAGCAAGGCACAGA |
| 6 | TTTGCATGCGTTCTTATGTGAAT | TCTGCAAGCCGCCTGC |
| 7 | CCGGGAGGTGGAGGTTGTAA | GAGGCATGAGGGGTTTGGTT |
| 8 | GGTTCCCGTGGTGAATGATG | GAGCCCTCAGGAGCAAACAG |
| 9-10 | GGTGCCTCCTCTGGCTCAG | TTCCTGCTCCCTCCATTCC |
| 11 | CCTGAGCCTGGCTGTTTCTTC | GCTTGTCCCAGAGCCACCT |
| 12 | TGGAGAGGGCGTCACAGG | TGCGTTCATCTTGGCTTGAGT |
| 13-14 | TGGCCTGTGTCTCATCCCA | CAAGCCCGGTGCTGATGT |
| 15 | CTTTCGTCATTAGGCGCACA | TTGCAAAGAGGGCAAGAACTG |
| 16 | CCGGAATTGAGTCCTACAACCT | GAGGCTATTCCACAGCACGG |
| 17 | CGCAAGGCGATCTCTAAACAA | CCGCTGACATTCTGAATGAGC |
| 18 | GCAGGAGGCTACCAGGCAG | CATTGCATGGGCACTGTCC |
| АРОВ 26 | CCAACACTTACTTGAATTCCAAGAGCAC | AAGGATCCTGCAATGTCAAGGTGTGCCTTT |
Перед секвенированием исследуемый фрагмент ДНК очищался от неспецифических продуктов ПЦР с использованием коммерческого реактива ExoSAP-ITR по протоколу фирмы ABI[Applied Biosystems Chemistry Guide]. Нуклеотидная последовательность продуктов ПЦР определялась методом циклического секвенирования с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems.
При выявлении нуклеотидной замены в последовательности гена АРОВ или LDLR, описанной в базе мутаций как вызывающей развитие СГХС, пациенту выставляется генетически подтвержденный диагноз СГХС. База мутаций доступна по адресу (http://www.ucl.ac.uk/ldlr/Current/) и насчитывает более 1000 патогенных мутаций гена LDLR. Для гена АРОВ известны три патогенные мутации, вызывающие развитие СГХС: R3500Q, R3500W, R3531C. В анализ включались пациенты с мутациями гена LDLR (478T>G (C139G), 1252G>T (E397X), 1696А>Т (I545F), 2389+5G>A, 2389+5G>C), в сравнении с пациентами у которых при генетическом анализе мутации в генах LDLR и АРОВ отсутствовали.
Статистическая обработка результатов
Статистический анализ был выполнен с помощью статистической программы Statistica 6.0. Для проведения сравнения при нормальном распределении переменных применяли параметрический метод (непарный t-тест), при отклонении от нормального - непараметрический (тест Манна-Уитни); величины выражали как среднее ± стандартное отклонение. Частоту ИБС в группах сравнивали с помощью χ2-теста.
Таким образом, в исследование было включено 294 пациента с клиническим диагнозом СГХС гетерозиготная форма. 158 мужчин и 136 женщин в возрасте от 25 до 55 лет у мужчин и от 30 до 60 лет у женщин. У 37 пациентов была выявлена одна из 5 мутаций гена LDLR: (478T>G (C139G), 1252G>T (E397X), 1696А>Т (I545F), 2389+5G>A, 2389+5G>C). У 124 пациентов были выявлены другие мутации гена LDLR или мутации гена АРОВ. У 133 пациентов мутаций генов LDLR и АРОВ не было выявлено.
| Таблица 5 | |||
| Сравнение частоты развития ранней ИБС | |||
| Показатели | Больные СГ с одной из 5 мутаций гена LDLR: (478T>G(C139G), 1252G>T(E397X), 1696A>T(I545F), 2389+5G>A, 2389+5G>C) (N=37) | Больные СГ без мутаций (N=133) | Р |
| LDLR vs | |||
| Без мутации | |||
| % мужчин | 49 | 55 | NS |
| % курящих | 35 | 29 | NS |
| % АГ | 38 | 46 | NS |
| (%) больных с ИБС | 57 | 31 | <0,05 |
| Средний возраст (лет) | 46,4±9,3 | 43±13,4 | NS |
| н.д. - различия не достоверны (p>0,05) |
Частота ИБС была достоверно выше в группе больных с мутацией в гене LDLR, чем у больных с СГХС без выявленной мутацией (табл.5). По частоте классических факторов риска ИБС (мужской пол, факт курения, наличие артериальной гипертензии (АГ), возраст) группы статистически не отличались. В связи с этим можно сделать вывод, что риск ИБС зависит от типа основного генетического дефекта (наличие мутации гена LDLR или иного дефекта).
Использование предлагаемого способа позволяет прогнозировать риск раннего развития ИБС у пациента с СГХС. Что способствует выбору правильной тактики лечения данных пациентов: проведению более агрессивной терапии пациентам с СГХС с крайне-высоким риском ранней ИБС с помощью комбинированной гиполипидемической терапии или проведением процедур ЛПНП-афереза.
Способ апробирован в отделе возрастных проблем сердечно-сосудистых заболеваний НИИ кардиологии им. А.Л.Мясникова ФГУ «РКНПК МЗ и СР РФ». Он дал достоверно положительные результаты и найдет широкое применение в медицинской практике.
Способ прогнозирования риска раннего развития ишемической болезни сердца у пациентов с семейной гиперхолестеринемией по мутации гена LDLR, характеризующийся тем, что определяют наличие мутации гена LDLR и при выявлении хотя бы одной мутации из 478T>G (C139G), 1252G>Т (E397Х), 1696А>Т (I545F), 2389+5G>А или 2389+5G>С прогнозируют крайне высокий риск раннего развития ИБС.