Функциональные вирусоподобные частицы гриппа (vlps)

Функциональные вирусоподобные частицы гриппа (vlps)

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки 60/727513, зарегистрированной 18 октября 2005 г., предварительной заявки 60/780847, зарегистрированной 10 марта 2006 г., предварительной заявки 60/800006, зарегистрированной 15 мая 2006 г., предварительной заявки 60/831196, зарегистрированной 17 июля 2006 г., предварительной заявки 60/832116, зарегистрированной 21 июля 2006 г., и предварительной заявки 60/845495, зарегистрированной 19 сентября 2006 г., все из которых включены здесь в качестве ссылки во всей своей полноте для всех целей.

Известный уровень техники

Вирус гриппа является членом семейства Orthomyxoviridae (в качестве обзора см. Murphy and Webster, 1996). Существует три подтипа вирусов гриппа, обозначаемых A, B и C. Вирион гриппа содержит сегментированный негативно-смысловой геном РНК. Вирион гриппа включает следующие белки: гемагглютинин (HA), нейраминидазу (NA), матрикс (Ml), белок-ионный канал протонов (M2), нуклеопротеин (NP), основной белок 1 полимеразы (PBl), основной белок 2 полимеразы (PB2), кислый белок полимеразы (PA) и неструктурный белок 2 (NS2). HA, NA, M1 и M2 связаны с мембраной, тогда как NP, PBl, PB2, PA и NS2 являются белками, связанными с нуклеокапсидом. NSl является единственным неструктурным белком, не связанным с вирионными частицами, но специфичным для инфицированных вирусом гриппа клеток. Белок Ml представляет собой наиболее представленный белок в частицах вируса гриппа. Белки HA и NA представляют собой гликопротеины оболочки, ответственные за прикрепление вируса и проникновение вирусных частиц в клетку, и являются источниками главных иммунодоминантных эпитопов для нейтрализации вирусов и защитного иммунитета. Как белок HA, так и NA рассматриваются в качестве наиболее важных компонентов для профилактических противогриппозных вакцин.

Инфицирование вирусом гриппа инициируется путем прикрепления поверхностного белка HA вириона к клеточному рецептору, содержащему сиаловую кислоту (гликопротеинам и гликолипидам). Белок NA опосредует процессинг рецептора с сиаловой кислотой, и проникновение вируса в клетку зависит от зависимого от HA, опосредуемого рецептором эндоцитоза. В кислых границах интернализованных эндосом, содержащих вирион гриппа, белок HA подвергается конформационным изменениям, которые ведут к слиянию мембран вируса и клетки-хозяина с последующей декапсидацией вируса и опосредуемым M2 высвобождением белков M1 из связанных с нуклеокапсидом рибонуклеобелков (RNPs), которые поступают в клеточное ядро для синтеза вирусной РНК. Антитела к молекуле HA могут предотвращать инфицирование вирусом путем нейтрализации вирусной инфекционности, тогда как антитела к белкам NA опосредуют их эффект на ранних стадиях репликации вирусов.

Вакцины с инактивированными вирусами гриппа A и B в настоящее время лицензированы в виде трехвалентных вакцин для парентерального введения. Эти трехвалентные вакцины получают как одновалентную массу в аллантоисной полости яиц эмбрионов цыплят, очищают с помощью скоростного зонального центрифугирования или колоночной хроматографии, инактивируют формалином или β-пропиолактоном и составляют в виде смеси двух штаммов, штамма типа A и типа B вирусов гриппа, циркулирующих в популяции людей в данном году. Доступные коммерческие вакцины против гриппа представляют собой вирусные вакцины с полным вирусом (WV) или субвирионные (SV; разложенные на компоненты или с очищенным антигеном поверхности). Вакцина WV содержит интактные инактивированные вирионы. Вакцины SV, обработанные растворителями, такими как три-н-бутилфосфат (Flu-Shield, Wyeth-Lederle), содержат примерно все вирусные структурные белки и некоторые из вирусных оболочек. Вакцины SV, солюбилизированные тритоном X-100 (Fluzone, Sanofi-Aventis; Fluvirin, Novartis), содержат главным образом агрегаты мономеров HA, NA и NP, хотя присутствуют остаточные количества других вирусных структурных белков. Живая, ослабленная, адаптированная к холоду вирусная вакцина (FluMist, Medlmmune) была недавно допущена на рынок FDA для коммерческого применения в качестве вакцины с интраназальной доставкой, показанной для активной иммунизации и профилактики заболевания, вызываемого вирусами гриппа A и B у здоровых детей и подростков 5-17 лет и здоровых взрослых 18-49 лет.

Несколько рекомбинантных продуктов было разработано в качестве кандидатов для рекомбинантной вакцины против гриппа. Эти подходы были сфокусированы на экспрессии, продукции и очистке белков HA и NA вируса гриппа типа A, включая экспрессию этих белков с применением инфицированных бакуловирусом клеток насекомого (Crawford et al., 1999; Johansson, 1999; Treanor et al., 1996), вирусных векторов (Pushko et al., 1997; Berglund et al., 1999) и вакцин с конструктами ДНК (Olsen et al., 1997).

Crawford et al. (1999) показал, что HA вируса гриппа, экспрессируемый в клетках насекомого, инфицированных бакуловирусом, способен предотвращать летальное заболевание гриппом, вызванное подтипами вируса H5 и H7 птичьего гриппа. В то же время другая группа показала, что бакуловирусная экспрессия белков вируса гриппа HA и NA индуцирует иммунные ответы у животных, более высокие по сравнению с индуцируемыми общепринятой вакциной (Johansson et al., 1999). Иммуногенность и эффективность экспрессирующегося в бакуловирусной системе гемагглютинина вируса гриппа лошадей сравнивали с кандидатной вакциной гомологичной ДНК (Olsen et al., 1997). Взятые вместе данные продемонстрировали, что высокая степень защиты против нагрузки вирусом гриппа может быть индуцирована рекомбинантными белками HA или NA с применением различных экспериментальных подходов и в различных животных моделях.

Lakey et al. (1996) показали, что происходящая из бакуловирусной системы HA вакцина против гриппа хорошо переносилась и была иммуногенной у группы людей-добровольцев при фазе I исследования безопасности при росте дозы. Однако результаты исследований фазы II, проведенные в нескольких клинических точках на людях-добровольцах, вакцинированных несколькими дозами вакцин против гриппа, включающих белки HA и/или NA, показали, что вакцины с рекомбинантной субъединицей белка не вызывают защитного иммунитета [G. Smith, Protein Sciences; M. Perdue, USDA, Personal Communications]. Эти результаты показали, что конформационные эпитопы, расположенные на поверхности пепломеров инфекционных вирионов HA и NA, важны для выработки нейтрализующих антител и защитного иммунитета.

В отношении включения других белков вируса гриппа в кандидатные рекомбинантные гриппозные вакцины был осуществлен ряд исследований, включая эксперименты с привлечением нуклеобелка, NP, одного или в сочетании с белком M1 (Ulmer et al., 1993; Ulmer et al., 1998; Zhou et al., 1995; Tsui et al., 1998). Эти кандидатные вакцины, которые состояли из квазиинвариантных внутренних белков вириона, вызывали широкий спектр иммунных ответов, которые были в первую очередь клеточными (как CD4⁺, так и CD8⁺ T-клетки памяти). Эти эксперименты включали использование ДНК или вирусных генных векторов. Были необходимы относительно большие количества вводимой ДНК, так как результаты экспериментов с более низкими дозами ДНК показали отсутствие или низкую защиту (Chen et al., 1998). Следовательно, дополнительные доклинические и клинические исследования могут потребоваться для оценки таких подходов на основе ДНК, включая безопасность, эффективность и устойчивость NP и M1 вируса гриппа.

Недавно при попытке разработать более эффективные вакцины против гриппа в качестве носителей эпитопов белка M2 вируса гриппа применены белки частиц. Логика разработки вакцины на основе M2 заключалась в том, что в исследованиях на животных защитный иммунитет против гриппа вызывался белками M2 (Slepushkin et al., 1995). Neirynck et al. (1999) применяли трансмембранный домен M2 из 23 аминокислот в качестве аминоконцевого гибридного партнера с основой антигена вируса гепатита B (HBcAg) для экспонирования эпитопа(ов) M2 на поверхности капсидоподобных частиц HBcAg. Однако несмотря на тот факт, что как полноразмерный белок M2, так и M2-HBcAg VLP индуцировали определяемые антитела и защиту у мышей, маловероятно, что будущие вакцины против гриппа будут основываться исключительно на белке M2, так как белок M2 присутствовал в низком количестве копий на вирион, был слабо антигенным, неспособным вызывать выработку антител, которые связывают свободные вирионы гриппа, и был не способен блокировать присоединение вируса к клеточным рецепторам (т.е. нейтрализовать вирус).

Так как предшествующие исследования показали, что поверхностные гликопротеины вируса гриппа, HA и NA, являются главными мишенями для индукции защитного иммунитета против вируса гриппа и что M1 обеспечивает консервативную мишень для клеточного иммунитета в отношении вируса гриппа, новая кандидатная вакцина может включать эти вирусные антигены в качестве белковой макромолекулярной частицы, такой как вирусоподобные частицы (VLPs). Кроме того, частица с этими антигенами вируса гриппа может экспонировать конформационные эпитопы, которые вызывают выработку нейтрализующих антител ко многим штаммам вирусов гриппа.

Несколько исследований показали, что рекомбинантные белки вируса гриппа могут самособираться в VLPs в клеточной культуре с применением экспрессионных плазмид для млекопитающих или бакуловирусных векторов (Gomez-Puertas et al., 1999; Neumann et al., 2000; Latham and Galarza, 2001). Gomez-Puertas et al. (1999) показали, что эффективное образование VLP зависит от уровней экспрессии вирусных белков. Neumann et al. (2000) создали систему экспрессионных плазмид для млекопитающих для формирования инфекционных вирусоподобных частиц гриппа полностью из клонированных кДНК. Latham and Galarza (2001) сообщали об образовании VLPs гриппа в клетках насекомого, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, коэкспрессирующим гены HA, NA, M1 и M2. Эти исследования показали, что белки вириона гриппа могут самособираться при коэкспрессии в клетках эукариот.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем изобретении предлагается вирусоподобная частица (VLP), включающая белок M1 вируса гриппа и белки H5 и N1, гемагглютинин и нейраминидаза. В одном осуществлении белок M1 происходит от штамма вируса гриппа, отличного при сравнении с белками H5 и N1. В другом осуществлении указанные H5 или N1 происходят от клада 1 H5N1 вируса гриппа.

В настоящем изобретении предлагается также VLP, экспрессируемая в эукариотной клетке, включающая одну или более нуклеиновых кислот, кодирующих белки H5 и N1, и белок вируса гриппа M1, в условиях, которые позволяют образовываться VLPs. В одном осуществлении указанная эукариотная клетка выбрана из группы, состоящей из клеток дрожжей, насекомых, амфибий, птиц и млекопитающих. В другом осуществлении указанная эукариотная клетка представляет собой клетку насекомого.

В настоящем изобретении предлагается также VLP, которая вызывает образование нейтрализующих антител у человека или животного, которые являются защитными в отношении инфицирования вирусом гриппа при введении указанному человеку или животному.

В настоящем изобретении предлагается также иммуногенная композиция, включающая эффективную дозу VLP изобретения. В одном осуществлении указанная композиция включает адъювант.

В настоящем изобретении предлагается также вакцина, включающая эффективную дозу VLP изобретения. В одном осуществлении указанная вакцина включает, по меньшей мере, вторую VLP, которая включает HA и NA из различных штаммов вируса гриппа. В другом осуществлении указанная вакцина включает адъювант.

В настоящем изобретении предлагается также способ индукции прочного иммунитета к инфицированию вирусом гриппа у животного, включающий введение, по меньшей мере, одной эффективной дозы вакцины, включающей VLP изобретения. В одном осуществлении указанная вакцина вводится животному перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.

В настоящем изобретении предлагается также применение VLP изобретения для получения вакцины для животного, где вакцина индуцирует прочный иммунитет к инфицированию вирусом гриппа у указанного животного.

В настоящем изобретении предлагается также способ получения VLP изобретения, включающий экспрессию белков M1, HA и NA в эукариотной клетке.

В настоящем изобретении предлагается вакцина, включающая VLP гриппа, где указанная VLP включает белки M1, HA и NA вируса гриппа, где указанная вакцина индуцирует прочный иммунитет к инфицированию вирусом гриппа у человека. В одном осуществлении указанная вакцина включает VLP гриппа, где указанная VLP состоит по существу из белков M1, HA и NA вируса гриппа, где указанная вакцина индуцирует прочный иммунитет к инфицированию вирусом гриппа у человека. В другом осуществлении указанная вакцина включает VLP гриппа, где указанная VLP состоит из белков вируса гриппа, выбранных из группы, состоящей из белков M1, HA и NA вируса гриппа, где указанная вакцина индуцирует прочный иммунитет к инфицированию вирусом гриппа у человека.

В настоящем изобретении предлагается также применение VLP гриппа, где указанная VLP включает белки M1, HA и NA вируса гриппа, для получения вакцины, где вакцина индуцирует прочный иммунитет к инфицированию вирусом гриппа у человека.

Таким образом, в изобретении предлагается макромолекулярная белковая структура, содержащая (a) первый белок M1 вируса гриппа и (b) дополнительный структурный белок, который может включать второй или более белок M1 вируса гриппа; первый, второй или более белок HA вируса гриппа; первый, второй или более белок NA вируса гриппа; и первый, второй или более белок M2 вируса гриппа. Если дополнительный структурный белок происходит не из второго или более белка M1 вируса гриппа, то включаются оба или все члены группы, например первый и второй белки M2 вируса гриппа. Как таковые предлагаются функциональная структура из белков вируса гриппа, включающая субвиральную частицу, VLP, или капсомерную структуру или ее часть, вакцина, мультивалентная вакцина и их смеси, состоящие по существу из структурных белков вируса гриппа, получаемых с помощью способа изобретения. В особенно предпочтительном осуществлении макромолекулярная белковая структура вируса гриппа включает белки HA, NA и M1 вируса гриппа, которые представляют собой продукты экспрессии генов вируса гриппа, клонированные в виде синтетических фрагментов из вируса дикого типа.

Макромолекулярная белковая структура может также включать дополнительный структурный белок, например нуклеопротеин (NP), мембранные белки из видов, отличных от вирусов не гриппа и мембранный белок из источника, не являющегося вирусом гриппа, которые происходят от птиц или млекопитающих и различных подтипов вируса гриппа, включая подтип A и B вирусов гриппа. Изобретение может включать гибридную макромолекулярную белковую структуру, которая включает часть из, по меньшей мере, одного белка, обладающего частью, не продуцируемой вирусом гриппа.

Профилактика гриппа может быть осуществлена с помощью предложения макромолекулярной белковой структуры, которая может самособираться в клетке-хозяине из рекомбинантного конструкта. Макромолекулярная белковая структура изобретения обладает способностью к самосборке в гомотипические или гетеротипические вирусоподобные частицы (VLPs), которые экспонируют конформационные эпитопы на белках HA и NA, что вызывает выработку нейтрализующих антител, которые являются защитными. Композиция может представлять собой вакцинную композицию, которая также содержит носитель или разбавитель и/или адъювант. Функциональные VLPs гриппа вызывают выработку нейтрализующих антител против одного или более штаммов или типов вируса гриппа в зависимости от того, содержат ли VLPs гриппа белки HA и/или NA от одного или более штаммов или типов вируса. Вакцина может включать белки вируса гриппа, которые представляют собой белки вируса гриппа дикого типа. Предпочтительно, чтобы структурные белки, содержащие VLP гриппа или ее часть, могли происходить из различных штаммов вирусов гриппа дикого типа. Вакцины против гриппа можно вводить человеку или животным для индукции защитного иммунитета против одного или более штаммов или типов вируса гриппа.

Макромолекулярные белковые структуры изобретения могут проявлять гемагглютининовую активность и/или нейраминидазную активность.

В изобретении предлагается способ получения VLP, происходящей от вируса гриппа, с помощью создания рекомбинантного конструкта, который кодирует структурные гены вируса гриппа, включая M1, HA, и, по меньшей мере, один структурный белок, происходящий от вируса гриппа. Рекомбинантный конструкт применяют для трансфекции, инфицирования или трансформации подходящей клетки-хозяина рекомбинантным бакуловирусом. Клетку-хозяин культивируют в условиях, которые позволяют экспрессироваться M1, HA и, по меньшей мере, одному структурному белку, происходящему от вируса гриппа, и VLP образуется в клетке-хозяине. Инфицированные культуральные среды, содержащие функциональную VLP гриппа, собирают и VLP очищают. Изобретение характеризуется также дополнительной стадией котрансфекции, коинфицирования или котрансформации клетки-хозяина вторым рекомбинантным конструктом, который кодирует второй белок вируса гриппа, тем самым включая второй белок вируса гриппа в VLP. Такие структурные белки могут происходить от вируса гриппа, включая NA, M2 и NP, и, по меньшей мере, один структурный белок происходит от птиц или млекопитающих. Структурный белок может быть от подтипа A и B вирусов гриппа. В соответствии с изобретением клетка-хозяин может представлять собой эукариотную клетку. Кроме того, VLP может представлять собой гибридную VLP.

В изобретении характеризуется также способ составления лекарственного вещества, содержащего VLP вируса гриппа, с помощью введения рекомбинантных конструктов, кодирующих гены вируса гриппа в клетки-хозяева, и позволения самосборки рекомбинантных белков вируса гриппа в функциональную гомотипическую или гетеротипическую VLP в клетках. VLP гриппа выделяют и очищают и лекарственное вещество составляют как содержащее VLP гриппа. Лекарственное вещество может дополнительно содержать адъювант. Кроме того, в изобретении предлагается способ составления лекарственного продукта с помощью смешивания такого лекарственного вещества, содержащего VLP гриппа, с липидным пузырьком, т.е. неионным липидным пузырьком. Таким образом, функциональные гомотипические или гетеротипические VLPs могут созревать как покрытые частицы из инфицированных клеток. Зрелые VLPs гриппа могут быть выделены и очищены с помощью ультрацентрифугирования или колоночной хроматографии в виде лекарственных веществ и составлены одни или с адъювантами, такими как Novasomes®, продукт Novavax, Inc., в качестве лекарственных продуктов, таких как вакцины. Novasomes®, который обеспечивает усиленный иммунный ответ, дополнительно описывается в патенте США № 4911928, который включен здесь в качестве ссылки.

В изобретении предлагается способ определения гуморального иммунитета в отношении инфицирования вирусом гриппа у позвоночного с помощью предложения тест-реагента, включающего эффективное количество детектирующего антитела белка вируса гриппа, обладающего, по меньшей мере, одним конформационным эпитопом макромолекулярной структуры вируса гриппа. Тест-реагент вводится в контакт с образцом жидкости организма от позвоночного, проверяемого на инфицирование вирусом гриппа. Антителам, специфичным для вируса гриппа, содержащимся в образце, дают связаться с конформационным эпитопом макромолекулярной структуры вируса гриппа с образованием комплексов антиген-антитело. Комплексы отделяют от несвязанных комплексов и вводят в контакт с определяемым меченым связывающим иммуноглобулины агентом. Оценивают количество определяемого меченого связывающего иммуноглобулины агента, которое связалось с комплексами.

Вирус гриппа может быть определен в образце от животного или человека, подозреваемого на инфицирование или инфицированного вирусом, с помощью обеспечения антителами, которые имеют определяемую метку, продуцирующую сигнал, или присоединены к определяемому меченому реагенту, обладающему специфичностью, по меньшей мере, к одному конформационному эпитопу частицы вируса гриппа. Образец вводят в контакт с антителами и антителам позволяют связаться с вирусом гриппа. Присутствие вируса гриппа в образце определяют с помощью определяемой метки.

В изобретении предлагаются способы лечения, профилактики и выработки защитного иммунного ответа с помощью введения позвоночному эффективного количества композиции изобретения.

Альтернативно, лекарственное вещество, VLP гриппа, может быть составлено в виде лабораторных реагентов, применяемых для исследований структуры вируса гриппа и клинических диагностических тестов. В изобретении предлагается также набор для лечения вируса гриппа с помощью введения эффективного количества композиции изобретения и инструкции для применения.

В изобретении предлагается также VLP, включающая белки HA, NA и M1, происходящие от вируса птичьего гриппа, который может вызывать заболеваемость или смертность у позвоночных. В одном осуществлении указанные белки HA, NA и M1 происходят от вируса птичьего гриппа типа A. В другом осуществлении HA выбран из группы, состоящей из H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 и H16, а NA выбран из группы, состоящей из N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 и N9. В другом осуществлении указанные белки HA и NA представляют собой H5 и N1 соответственно. В другом осуществлении указанные белки HA и NA представляют собой H9 и N2 соответственно. В другом осуществлении указанный HA и/или NA проявляют гемагглютининовую активность и/или нейраминидазную активность предпочтительно. В одном осуществлении VLP состоит по существу из белков HA, NA и M1, т.е. в VLP присутствуют по существу только белки вируса гриппа.

В изобретении предлагается также способ получения VLP, включающий трансфецирование векторов, кодирующих белки вируса птичьего гриппа, в подходящую клетку-хозяина и экспрессию указанных белков вируса птичьего гриппа в условиях, которые позволяют образовываться VLPs. В одном осуществлении этот способ включает трансфекцию клетки-хозяина рекомбинантными молекулами ДНК, которые кодируют белки вируса гриппа HA, NA и M1.

Изобретение также включает антигенный состав, включающий VLP, включающую белки HA, NA и M1, происходящие от вируса птичьего гриппа, который может вызывать заболеваемость или смертность у позвоночного. В другом осуществлении HA выбран из группы, состоящей из H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 и H16, а NA выбран из группы, состоящей из N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 и N9. В другом осуществлении указанные белки HA и NA представляют собой H5 и N1 соответственно. В другом осуществлении указанные белки HA и NA представляют собой H9 и N2 соответственно. В другом осуществлении указанный антигенный состав вводят субъекту перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.

В изобретении дополнительно предлагается способ вакцинации позвоночного против вируса птичьего гриппа, включающий введение указанному позвоночному индуцирующего защитную реакцию количества VLP, включающей белки HA, NA и M1, происходящие от вируса птичьего гриппа.

Данное изобретение также включает способ индукции стойкого иммунитета в отношении инфицирования вирусом гриппа или, по меньшей мере, одного его симптома у субъекта, включающий введение, по меньшей мере, одной эффективной дозы VLP вируса гриппа. В одном осуществлении указанная VLP состоит по существу из HA, NA и M1. В другом осуществлении указанная VLP включает белки вируса гриппа, где указанные белки вируса гриппа состоят из HA, NA и M1. В другом осуществлении указанные HA и/или NA проявляют гемагглютининовую активность и/или нейраминидазную активность предпочтительно.

Данное изобретение также включает способ индукции стойкого иммунитета в отношении инфицирования вирусом гриппа или, по меньшей мере, одного его симптома у субъекта, включающий введение, по меньшей мере, одной эффективной дозы VLP вируса птичьего гриппа. В одном осуществлении указанная VLP гриппа состоит по существу из HA, NA и M1 птиц. В другом осуществлении указанная VLP гриппа включает белки вируса гриппа, где указанные белки вируса гриппа состоят из HA, NA и M1 птиц.

Данное изобретение дополнительно включает способ индукции стойкого иммунитета в отношении инфицирования вирусом гриппа или, по меньшей мере, одного его симптома у субъекта, включающий введение, по меньшей мере, одной эффективной дозы VLP вируса сезонного гриппа. В одном осуществлении указанная VLP гриппа состоит по существу из HA, NA и M1 вируса сезонного гриппа. В другом осуществлении указанная VLP гриппа включает белки вируса гриппа, где указанные белки вируса гриппа состоят из HA, NA и M1 вируса сезонного гриппа.

Данное изобретение дополнительно включает способ индукции стойкого иммунитета в отношении инфицирования вирусом гриппа или, по меньшей мере, одного его симптома у субъекта, включающий введение, по меньшей мере, одной эффективной дозы, по меньшей мере, VLP одного вируса сезонного гриппа. В одном осуществлении указанная VLP гриппа состоит из HA, NA и M1 вируса сезонного гриппа. В другом осуществлении указанная VLP гриппа состоит по существу из HA, NA и M1 вируса сезонного гриппа.

Данное изобретение дополнительно включает способ индукции стойкого защитного ответа антител на инфицирование вирусом гриппа или, по меньшей мере, на один его симптом у субъекта, включающий введение, по меньшей мере, одной эффективной дозы VLP гриппа.

Данное изобретение включает способ индукции стойкого защитного клеточного иммунного ответа на инфицирование вирусом гриппа или, по меньшей мере, на один его симптом у субъекта, включающий введение, по меньшей мере, одной эффективной дозы VLP гриппа.

Данное изобретение дополнительно включает способ составления вакцины, которая индуцирует стойкий иммунитет в отношении инфицирования вирусом гриппа или, по меньшей мере, одного его симптома у субъекта, включающий добавление к указанному составу эффективной дозы VLP гриппа. В одном осуществлении указанный стойкий иммунитет в отношении инфицирования вирусом гриппа или, по меньшей мере, одного его симптома возникает от одной дозы. В другом осуществлении указанный стойкий иммунитет в отношении инфицирования вирусом гриппа или, по меньшей мере, одного его симптома возникает от многократных доз.

Данное изобретение дополнительно включает вакцину, включающую VLP гриппа, где указанная вакцина индуцирует стойкий иммунитет в отношении инфицирования вирусом гриппа или, по меньшей мере, одного его симптома при введении субъекту. В одном осуществлении указанная VLP гриппа представляет собой VLP вируса птичьего гриппа. В другом осуществлении указанная VLP гриппа представляет собой VLP вируса сезонного гриппа.

Данное изобретение дополнительно включает антигенный состав, включающий VLP гриппа, где указанная вакцина индуцирует стойкий иммунитет в отношении инфицирования вирусом гриппа или, по меньшей мере, одного его симптома при введении субъекту. В одном осуществлении указанная VLP гриппа представляет собой VLP вируса птичьего гриппа. В другом осуществлении указанная VLP гриппа представляет собой VLP вируса сезонного гриппа.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 представлена нуклеотидная последовательность гена нейраминидазы (NA) вируса птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (SEQ ID NO:1).

На фиг. 2 представлена нуклеотидная последовательность гена гемагглютинина (HA) вируса птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (SEQ ID NO:2).

На фиг. 3 представлена нуклеотидная последовательность гена белка матрикса M1 (M1) вируса птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) (SEQ ID NO:3).

На фиг. 4 представлены векторы для переноса для конструирования рекомбинантных бакуловирусов для экспрессии белков HA, NA и M1 вируса птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2). На фиг. 4A представлен вектор для переноса для экспрессии индивидуальных генов, а на фиг. 4B представлен вектор для переноса для множественной экспрессии генов.

На фиг. 5 представлена экспрессия белков HA, NA и M1 вируса птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) в клетках Sf-9S.

На фиг. 6 представлена очистка VLPs птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) методом градиента плотности сахарозы.

На фиг. 7 представлено определение белка вируса гриппа с помощью гель-фильтрационной хроматографии. Антитела, применяемые при анализе Вестерн-блоттингом, представляют собой следующее: (A) кроличье анти-H9N2; (b) мышиное анти-M1 mAb; и (C) мышиное анти-BACgp64.

На фиг. 8 представлено определение белков вируса птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2), включая субвиральные частицы, VLP и комплексы VLP с помощью электронной микроскопии.

На фиг. 9 представлена гемагглютининовая активность очищенных VLPs вируса птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2).

На фиг. 10 представлена нейраминидазная активность очищенных VLPs вируса птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2).

На фиг. 11 представлена иммунизация и схема взятия крови для изучения иммуногенности рекомбинантного вируса гриппа с помощью очищенных VLPs вируса птичьего гриппа A/Hong Kong/1073/99 (H9N2).

На фиг. 12 представлены результаты исследования иммуногенности у мышей, иммунизированных рекомбинантными VLPs гриппа H9N2. На фиг. 12A представлены сыворотки от мышей BALB/c, иммунизированных рекомбинантными VLPs, включающими белки HA, NA и M1 из вируса птичьего гриппа типа A/H9N2/Hong Kong/1073/99. На фиг. 12B представлены сыворотки от новозеландских белых кроликов, иммунизированных инактивированным вирусом птичьего гриппа типа A H9N2, при взаимодействии в Вестерн-блоттах, содержащих инактивированный вирус птичьего гриппа типа A H9N2 (дорожки 1 и 3) или адаптированного к холоду вируса птичьего гриппа типа A H9N2 (дорожки 2 и 4).

На фиг. 13 представлено среднее геометрическое антительных ответов у мышей BALB/c после первичной и вторичной иммунизации.

На фиг. 14 представлены ответы ингибирования гемагглютинина (HI) сыворотки у мышей BALB/c.

На фиг. 15 представлена потеря массы (%) мышей BALB/c, нагруженных H9N2 гриппа.

На фиг. 16 представлены титры вируса в легких на 3 и 5 день после нагрузки H9N2.

На фиг. 17A, 17B и 17C представлен антительный ответ на A/Fujian/411/2002 при иммунизации VLP H3N2.

На фиг. 18A и B представлены изотипы антител IgG мыши.

На фиг. 19 представлены ответы ингибирования гемагглютинина (HI) антителами у мышей SD, иммунизированных вакциной с H9N2 VLP.

На фиг. 20A и 20B представлены ответы ингибирования гемагглютинина (HI) антителами при различных дозах H9N2 VLPs с и без адъюванта у мышей BALB/c.

На фиг. 21 представлены ответы ингибирования гемагглютинина сыворотки (HI) антителами у мышей BALB/c при различных дозах VLPs.

На фиг. 22 представлены ответы ингибирования гемагглютинина (HI) сыворотки у хорьков.

На фиг. 23 представлены ответы ингибирования гемагглютинина (HI) сыворотки хорьков из пулов сыворотки на 21 и 42 дни после введения различных штаммов H3N2 VLPs.

На фиг. 24 представлено антитело против HA (конечная точка титра разведения) мышей, инокулированных внутримышечно H5N1 (Vietnam/1203/2003) VLPs при низких дозах.

На фиг. 25 представлено антитело против HA (конечная точка титра разведения) мышей, инокулированных интраназально H5N1 (Vietnam/1203/2003) VLPs при низких дозах.

На фиг. 26 представлен пример получения, выделения и очистки VLPs изобретения.

На фиг. 27 представлены мыши, инокулированные H3N2 VLPs, введенными внутримышечно, и затем нагруженные интраназально вирусом A/Aichi/2/68x31 (H3N2).

На фиг. 28 представлены мыши, инокулированные H3N2 VLPs, введенными интраназально, и затем нагруженные интраназально вирусом A/Aichi/2/68x31 (H3N2).

На фиг. 29 представлено сбрасывание вируса в смывы носовой полости хорька, инокулированного H9N2 VLP вакциной и затем нагруженного интраназально вирусом H9N2.

На фиг. 30A, 30B, 30C, 30D, 30E, 30F, 30G, 30H представлены антительные ответы ингибирования гемагглютинина (HI) у мышей после инокуляции различными дозами A/Fujian/411/2002 (H3N2) VLPs внутримышечно или интраназально при тестировании против различных штаммов H3N2 вирусов гриппа.

Подробное описание изобретения

Применяемый здесь термин «бакуловирус», также известный как baculoviridae, относится к семейству оболочечных ДНК вирусов артропод, члены которого могут быть использованы в качестве экспрессионных векторов для получения рекомбинантных белков в клеточных культурах со вставкой. Вирион содержит один или более палочковидных нуклеокапсидов, содержащих молекулу кольцевой, гиперспирализованной двухцепочечной ДНК (отн. М.м. 54×10⁶-154×10⁶). Вирус, используемый в качестве вектора, представляет собой обычно вирус ядерного полиэдроза (NVP) Autographa californica. Экспрессия введенных генов находится под контролем сильного промотора, который в норме регулирует экспрессию белкового компонента полиэдроза, большого ядерного включения, в которое вирусы вставляются в инфицированных клетках.

Применяемый здесь термин «происходящий от» относится к происхождению или источнику и может включать существующие в природе, рекомбинантные, неочищенные или очищенные молекулы. Белки и молекулы настоящего изобретения могут происходить от молекул вируса гриппа или быть не вирусными.

Применяемый здесь термин «первый» белок вируса гриппа, т.е. первый белок M1 вируса гриппа, относится к белку, такому как M1, HA, NA и M2, который происходит от конкретного штамма вируса гриппа. Штамм или тип первого вируса гриппа отличается от штамма или типа второго белка вируса гриппа. Таким образом, «второй» белок вируса гриппа, т.е. второй белок M1 вируса гриппа, относится к белку, такому как M1, HA, NA и M2, который происходит от второго штамма вируса гриппа, который представляет собой штамм или тип, отличный от первого белка вируса гриппа.

Применяемый здесь термин «гемагглютининовая активность» относится к способности HA-содержащих белков, VLPs, или их частей связываться с красными клетками крови (эритроцитами) и агглютинировать их.

Применяемый здесь термин «нейраминидазная активность» относится к ферментативной активности NA-содержащих белков, VLPs, или их частей отщепляющей остатки сиаловой кислоты от субстратов, включая белки, такие как фетуин.

Применяемый здесь термин «гетеротипический» относится к одному или более различным типам или штаммам вируса.

Применяемый здесь термин «гомотипический» относится к одному типу или штамму вируса.

Применяемый здесь термин «макромолекулярная белковая структура» относится к конструкции или организации одного или более белков.

Применяемый здесь термин «мультивалентная» вакцина относится к вакцине против множества типов или штаммов вируса гриппа.

Применяемый здесь термин «не относящийся к вирусу гриппа» относится к белку или молекуле, которые не происходят от вируса гриппа.

Применяемый здесь термин «вакцина» относится к препарату убитых или ослабленных патогенов или происходящих от них антигенных детерминант, который применяется для индукции образования антител или иммунитета против патогена. Вакцина дается для обеспечения иммунитета в отношении заболевания, например гриппа, которое вызывается вирусами гриппа. В настоящем изобретении предлагаются композиции вакцин, которые являются иммуногенными и обеспечивают защиту. Кроме того, термин «вакцина» также относится к суспензии или раствору иммуногена (например, VLP), который вводится позвоночному для выработки защитного иммунитета, т.е. иммунитета, который снижает тяжесть заболевания, связанного с инфекцией.

Применяемый здесь термин «стойкий иммунитет» относится к иммунному ответу, при котором, когда VLPs изобретения вводят позвоночному, возникает индукция иммунной системы у указанного позвоночного, что ведет к предотвращению инфицирования вирусом гриппа, ослаблению инфицирования вирусом гриппа или снижению, по меньшей мере, одного симптома, относящегося к инфицированию вирусом гриппа у указанного позвоночного. Стойкий иммунитет может также относиться к титру ингибирования гемагглютинации (HI) ≥40 у млекопитающего, когда VLPs изобретения вводили и индуцировали иммунный ответ.

Применяемый здесь термин «адъювант» относится к соединению, которое при применении в сочетании со специфическим иммуногеном (например, VLP) в составе усиливает или другим образом изменяет или модифицирует конечный иммунный ответ. Модификация иммунного ответа включает интенсификацию или расширение специфичности только антительного или как антительного, так и клеточного иммунных ответов. Модификация иммунного ответа может также обозначать снижение или подавление определенных антиген-специфичных иммунных ответов.

Применяемый здесь термин «иммунный стимулятор» относится к соединению, которое увеличивает имму