Способ получения вируса гриппа

Способ получения вируса гриппа

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к способу получения вируса гриппа с использованием яиц, происходящих от кур, вакцинированных против гриппа, а также к применению такого способа для получения вакцины против гриппа.

В настоящее время известны три типа вируса гриппа (A, B и C), при этом вирус типа А является ответственным за расстройства у животных и человека, в то время как вирусы типа B и типа C являются особенно патогенными для человека. Вирусы типа А делятся на подтипы согласно антигенной структуре гемагглютинина (НА) и нейраминидазы (NA), которые являются основными гликопротеидами оболочки вируса. Выделяют шестнадцать подтипов НА (от H1 до H16) и 9 подтипов NA (от N1 до N9). Подтип вируса типа А определяют, таким образом, по подтипу НА и подтипу NA, которые присутствуют в оболочке вируса. Дикие птицы составляют резервуар всех подтипов гриппа А. Некоторые подтипы вируса гриппа типа А эндемически или эпидемически (ежегодные эпидемии) заражают домашних птиц (различные подтипы, включая H5N1 и H9N2), лошадей (преимущественно H3N8), свиней (преимущественно H1N1, H3N2 и H1N2), а также человека (преимущественно H1N1 и H3N2). Собаки, кошки и другие дикие виды могут также иногда инфицироваться некоторыми подтипами (H3N8 и H5N1 у собак; H5N1 у кошек).

В ветеринарной области птицефермы, и более конкретно, занимающиеся разведением цыплят, кур и петухов, представляют в количественном отношении наибольшую популяцию, которая может быть поражена вирусом гриппа. Штаммы птичьего гриппа подтипов H5 и H7 могут иметь два патотипа: патотип низкой патогенности (или LP) и патотип высокой патогенности (или HP). Штаммы HP ответственны за птичий грипп и происходят от штаммов LP H5 и H7 после мутаций/вставок в особенности в сайте расщепления гемагглютинина (наличие множества основных аминокислот). Вплоть до настоящего времени на птицефермах настоятельно рекомендуются строгие меры гигиены и регулярный контроль, чтобы предотвратить птичий грипп, в частности, инфекции подтипами H5 и H7.

У человека иммунизация рекомендуется против сезонных циркулирующих вирусных штаммов, ответственных за эпидемии, которые являются более или менее сильными в зависимости от года. Большинство имеющихся в настоящее время вакцин получают, используя куриные яйца с эмбрионами, причем эти яйца инфицируют тремя различными штаммами вируса гриппа (два штамма вируса гриппа типа А, имеющие подтип H3N2 и H1N1 и один штамм вируса типа B). Яйца с развивающимся куриным эмбрионом от кур, которые не были иммунизированы против гриппа, используют, чтобы предотвратить явление интерференции, которая может нарушать репликацию вируса. Действительно, известно, что материнские антитела передаются цыплятам после присутствия в яйце и защищают их против микробных инфекций в течение первых дней жизни, но зато при этом они ответственны за дефицит иммунитета, если цыплят преждевременно вакцинируют против микробного агента, пока сохраняются защитные материнские антитела против этого агента. H. Stone et al. (1992, Avian Dis. 36: 1048-1051) показали, что новорожденные цыплята могут быть пассивно иммунизированы против болезни Ньюкасла путем введения желтка от яиц, происходящих от кур, иммунизированных против вируса болезни Ньюкасла (NDV). Однако, если после введения яичных желтков, цыплят вакцинируют вирусом NDV, наблюдается уменьшение иммунного ответа на вакцину. Также из исследований Hamal et al. (2006, Poultry Science 65: 1364-1372) известно, что степень передачи защитных антител от матери к новорожденным цыплятам, в частности передачи антител, направленных к вирусу NDV или к вирусу инфекционного бронхита (IBV), составляет от 30% до 40% (процент от числа антител в плазме курицы, циркулирующий в крови трехдневного цыпленка), что указывает, что большое число материнских антител блокируются в яйце. Это подтверждено исследованиями J.R. Beck et al. (2003, Avian Dis. 47:1196-1199), которые показывают, что все яйца содержат антитела к НА спустя приблизительно 3 недели после вакцинации курицы штаммом инактивированного вируса гриппа. Наконец, из исследований Fontaine et al. (1963, Pathobiologie, 11/9: 611-613) известно, что, если яйца с развивающимся эмбрионом инокулируют сывороткой против гриппа, яйца оказываются защищены против инфекции вирусом гриппа. Все эти причины дают специалисту основание полагать, что, если используют яйца от кур, иммунизированных против гриппа, эти яйца, вследствие переноса в яйцо материнских антител, направленных к гриппу, становятся непригодны для получения вирусов гриппа.

С начала 2000-х, экономическое последствие птичьего гриппа в хозяйствах по разведению домашней птицы не перестает увеличиваться с появлением очень инфекционных и патогенных птичьих вирусных штаммов, которые опустошают все птицефермы или, в менее драматических случаях, приводят к тому, что инфицированные куры перестают нестись. Типирование НА высокопатогенного вируса показывает, что почти все они имеют подтип H5 или H7. В настоящее время имеется опасение, что вирусные штаммы, имеющие подтип H5 или H7, адаптируются к человеку и могут приводить к настоящим пандемиям человеческого гриппа; о серьезных случаях человеческого гриппа, конечно, изолированных, в которых были вовлечены эти подтипы, уже сообщалось.

Ввиду риска того, что использование яиц больше не может всегда гарантировать возможность получения вакцины против гриппа, новые способы создания вакцин против гриппа в настоящее время направлены на использование систем клеточных культур.

Сущность изобретения

Несмотря на новые способы получения вакцин против гриппа, однако все еще существует потребность в возможности получения, при любых обстоятельствах, за короткий промежуток времени и в очень большом количестве, вируса гриппа для того, чтобы получить вакцину против гриппа. Настоящее изобретение отвечает этой потребности, описывая способ получения вируса гриппа, основанный, вопреки всем ожиданиям, на использовании яиц, происходящих от кур, заранее иммунизированных против гриппа.

Объект изобретения фактически относится к:

Способу получения вируса гриппа, согласно которому:

a. курам вводят вакцину против гриппа,

b. от вакцинированных кур забирают яйца,

c. инициируют процесс эмбриогенеза,

d. яйца с развивающимся эмбрионом инфицируют, вводя вирус гриппа в аллантоисную полость,

e. инфицированные яйца с развивающимся эмбрионом инкубируют в условиях температуры и влажности, которые обеспечивают репликацию вируса, и

f. собирают аллантоисную жидкость, содержащую вирус.

Предпочтительно, вакцина защищает кур против птичьего гриппа.

Как правило, вакцина против гриппа включает, в своей композиции, гемагглютинин вируса гриппа в форме белка и/или гена, кодирующего этот белок.

Согласно одному аспекту композиция вакцины против гриппа содержит цельный инактивированный вирус гриппа.

Согласно другому аспекту композиция вакцины против гриппа содержит продукт, полученный из цельного вируса гриппа.

Согласно еще одному аспекту композиция вакцины также содержит адъювант.

В другом аспекте композиция вакцины против гриппа содержит аттенуированный вирус гриппа.

Согласно другому способу вакцина против гриппа включает вектор, включающий ген, кодирующий гемагглютинин вируса гриппа.

Предпочтительно вектор представляет собой поксвирус.

В частном аспекте вектор также включает ген, кодирующий нейраминидазу вируса гриппа.

Согласно другому аспекту композиция вакцины также содержит адъювант.

Согласно одному варианту осуществления способа согласно изобретению гемагглютинин вируса гриппа в форме белка и/или гена, кодирующего этот белок, содержащийся в композиции вакцины, которую вводят курам, и гемагглютинин вируса гриппа, который используется для инфекции аллантоисной полости яиц с развивающимся эмбрионом от иммунизированных кур, имеют разные подтипы.

Согласно другому варианту осуществления гемагглютинин вируса гриппа в форме белка и/или гена, кодирующего этот белок, содержащийся в композиции вакцины, которую вводят курам, и гемагглютинин вируса гриппа, который используется для инфекции аллантоисной полости яиц с развивающимся эмбрионом от иммунизированных кур, имеют один и тот же подтип.

Согласно еще одному варианту осуществления гемагглютинин вируса гриппа в форме белка и/или гена, кодирующего этот белок, содержащийся в композиции вакцины, которую вводят курам, и гемагглютинин вируса гриппа, который используется для инфекции аллантоисной полости яиц с развивающимся эмбрионом от иммунизированных кур, является идентичным.

Согласно еще одному варианту осуществления вирус гриппа, содержащийся в композиции вакцины, которую вводят курам, идентичен вирусу гриппа, который используется для инфекции аллантоисной полости яиц с развивающимся эмбрионом от вакцинированных кур.

В особенно предпочтительном варианте осуществления гемагглютинин вируса гриппа в форме белка и/или гена, кодирующего этот белок, содержащийся в композиции вакцины, которую вводят курам, и гемагглютинин вируса гриппа, который используется для инфекции аллантоисной полости яиц с развивающимся эмбрионом от иммунизированных кур, имеет подтип H5, H6, H7 или H9.

В другом особенно предпочтительном варианте осуществления гемагглютинин вируса гриппа в форме белка и/или гена, кодирующего этот белок, содержащийся в композиции вакцины, которую вводят курам, и гемагглютинин вируса гриппа, который используется для инфекции аллантоисной полости яиц с развивающимся эмбрионом от иммунизированных кур, имеет подтип H5 или H7.

В частном аспекте способ согласно изобретению включает дополнительную стадию очистки вируса.

В другом частном аспекте способ согласно изобретению включает дополнительную стадию инактивации вируса.

Изобретение также относится к вакцине против гриппа, полученной с использованием способа согласно изобретению.

Объектом изобретения также является применение способа согласно изобретению для получения вакцины для использования в профилактике гриппа.

В частном аспекте применение способа согласно изобретению служит для получения вакцины для использования в профилактике пандемий человеческого гриппа.

В другом частном аспекте применение способа согласно изобретению служит для получения вакцины для использования в профилактике эпидемий человеческого гриппа.

Оно также относится к способу профилактики инфекции эпидемическим штаммом вируса гриппа или пандемическим штаммом вируса гриппа у человека, причем указанный способ включает введение человеку эффективного количества вакцины против гриппа, полученной с использованием способа согласно изобретению.

В еще одном аспекте применение способа согласно изобретению служит для получения вакцины для использования в профилактике гриппа у лошадей, свиней, собачьих, кошачьих, куньих и птичьих видов.

Изобретение также относится к способу профилактики гриппа у животного, выбранного из группы лошадей, свиней, собачьих, кошачьих, куньих и птичьих видов, причем указанный способ включает введение животному эффективного количества вакцины против гриппа, полученной с использованием способа согласно изобретению.

Объектом изобретения также является применение яиц от кур, вакцинированных против гриппа, для получения вируса гриппа.

Согласно предпочтительному аспекту применение яиц от кур, вакцинированных против гриппа, служит для получения вакцины против гриппа.

Наконец, согласно последнему аспекту применение яиц от кур, вакцинированных против гриппа, служит для получения вируса гриппа или получения вакцины против гриппа, согласно которому яйца содержат антитела, направленные к гемагглютинину вируса гриппа, и в частности, яйца содержат антитела, направленные к гемагглютинину вируса гриппа, имеющему подтип H5, H6, H7 или H9.

Подробное описание изобретения

Под “вирусом гриппа” понимают как вирус гриппа, происходящий от штамма дикого типа, так и вирус гриппа, происходящий от штамма-реассортанта, который является результатом перегруппировки геномных сегментов одного или более штаммов дикого типа с «мастер»-штаммом, выбранным на основании его высокой способности к росту в яйце. Штамм-реассортант приобретает характеристики «мастер»-штамма, но сохраняет по меньшей мере характеристики HA и NA штамма дикого типа, что означает, что идентичность между последовательностью белка HA и NA штамма-реассортанта и последовательностью белка HA и NA штамма дикого типа, определенная посредством программы полного выравнивания, составляет по меньшей мере 95%, предпочтительно по меньшей мере 98%, более предпочтительно по меньшей мере 99% и еще более предпочтительно 100%. Штамм-реассортант может быть получен совместной инфекцией чувствительной клетки штаммом дикого типа и «мастер»-штаммом с последующими подходящими средствами селекции желаемого штамма-реассортанта. Он может также быть получен обратной генетикой из нуклеиновых кислот штамма дикого типа и «мастер»-штамма и экспрессией в мультиплазмидных системах экспрессии, как описано в WO 01/83794 и WO 03/091401 и в Proc. Nat. Acad. Sci. USA 96:9345-9350 (1999). В случае высокопатогенных штаммов, таких как штаммы H5 и H7, модификация сайта расщепления, включающего множество основных аминокислот, может быть осуществлена таким образом, чтобы сделать штамм-реассортант низкопатогенным.

Для простоты языка, термин “вакцинный штамм” или “вакцинный вирус” используется без различия для обозначения вируса гриппа, используемого для получения вакцины против гриппа; точно так же термин “инфицирующий штамм” или “инфицирующий вирус” используется для обозначения вируса гриппа, служащего для инфекции биологического материала (яиц, животных).

Кроме того, термин “яйца от вакцинированных кур” используется для обозначения оплодотворенных кур, происходящих от кур, которые были предварительно вакцинированы и сведены с петухами.

В общем, вакцина против гриппа, используемая для вакцинации кур, может быть получена из любого штамма вируса гриппа. Вакцинный штамм может быть вирусом типа А, но также и вирусом типа B или C. Когда он является штаммом вируса типа А, вирус может иметь любой подтип НА и/или любой подтип NA. Это могут, например, быть вирусные штаммы, имеющие подтип H1N1 или H3N2, в настоящее время ответственный за эпидемии человеческого гриппа типа А.

Вакцинация кур вирусом гриппа представляет большой интерес при условии, что вакцинация придает защиту против птичьего гриппа.

Птичий грипп может протекать незаметно или может быть характеризован рядом проявлений, часто респираторной и/или кишечной природы, большей или меньшей интенсивности, которые более или менее ослабляют общее состояние кур и которые могут привести к гибели животного, когда вирусный штамм является высокопатогенным. Птичий грипп обычно приводит к снижению или даже исчезновению яйцекладущей яйцо активности. Низкопатогенные штаммы вируса, принадлежащие к подтипам H6N2 или H9N2, или даже H5 или H7, обычно ответственны за легкие формы птичьего гриппа, обычно приводящие к снижению или исчезновению яйценоскости, но не к значительной летальности. С другой стороны, высокопатогенные штаммы вируса, принадлежащие к подтипам H5 и H7 (в особенности H5N1, H5N2, H5N9, H7N1, H7N4 или H7N7), являются очень вирулентными и вызывают очень высокую летальность в хозяйствах по разведению кур.

НА представляет собой антиген, который является существенным в развитии защитного иммунитета против гриппа. Вакцина, используемая в способе согласно изобретению, включает в своей композиции по меньшей мере НА одного из вирусов гриппа в форме белка и/или гена, кодирующего этот белок.

Термин "ген" означает нуклеотидную последовательность, соответствующую открытой рамке считывания и кодирующую белок. Ген под контролем регуляторных последовательностей экспрессии (промотор, энхансер, сигнал полиаденилирования, сайт терминации транскрипции и т.д.) встроен в нуклеиновую кислоту вектора, в частности плазмиды или вируса, причем эти регуляторные последовательности могут быть такими, которые обычно ассоциированы с открытой рамкой считывания (эндогенные последовательности) или могут иметь другое происхождение (экзогенные последовательности).

НА может включать НА человеческого штамма вируса гриппа, но который не является патогенным для кур. Предпочтительно он содержит представляющий интерес НА, то есть НА, который имеет тот же самый подтип, как и НА вирусного штамма, который является ответственным за птичий грипп и против которого требуется иммунизация и защита кур. Предпочтительно степень идентичности между последовательностью белка НА, присутствующего в вакцине, и последовательностью белка НА, против которого требуется защита кур, составляет по меньшей мере 80%, предпочтительно по меньшей мере 90% и еще более предпочтительно по меньшей мере 95%, определенных посредством программы полного выравнивания (такой как программа Blast).

Вакцина, включающая НА, обычно находится в форме композиции, содержащей цельный инактивированный вирус гриппа или продукт, полученный из цельного инактивированного вируса гриппа.

Под “продуктом, полученным из цельного инактивированного вируса”, понимают инактивированную (то есть неинфекционную) вакцинную композицию, которая получена из штамма вируса и которая включает по меньшей мере НА указанного штамма вируса. Продукт, полученный из штамма цельного вируса, может представлять собой фрагментированный (или расщепленный) вирус и, в этом случае, говорят о «расщепленной» вакцине. Другой продукт, полученный из штамма цельного вируса, представляет собой НА этого штамма как таковой или связанный с NA, который был получен с использованием способов экстракции и очистки и, в этом случае, говорят о «субъединичной» вакцине. НА может также быть вторично встроен в виросому. Вакцинная композиция, содержащая цельный инактивированный вирус гриппа или продукт, полученный из цельного инактивированного вируса, может также содержать один или более адъювантов или составов адъюванта. В качестве неограничивающего примера составов адъюванта можно назвать эмульсии типа «вода-в-масле» или эмульсии типа «масло-в-воде», такие как эмульсия MF59® (Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 page 183), составы на основе липосом и составы на основе MPL (Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 pages 1186-187), авридина (Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 page 148), диметилдиоктадециламмонийбромида (Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 page 157), Corynebacterium parvum, сапонина, лизолецитина, плюрониловых производных (Hunter H. et al. 1991, vaccine, 9: 250-256) (Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 page 200 and pages 297-311), солей алюминия или их комбинаций (Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 pages 249-276). Предпочтительно эмульсии типа «вода-в-масле» состоят из парафинового масла, из гидрофильного поверхностно-активного вещества, такого как полисорбат 80 или полисорбат 85, и липофильного поверхностно-активного вещества, такого как сорбитан олеат или сорбитан триолеат. Примеры эмульсий, используемых в случае кур, описаны в Stone et al. (1983, Avian Dis., 27: 688-697; 1993; Avian Dis., 37: 399-405; 1991, Avian Dis., 35: 8-16); в M. Brugh et al. (1983, Am. J; Vet. Res., 44: 72-75); в Woodward L. et al. (1985, Vaccine, 3: 137-144); в (Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach Edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995 page 219). Вакцинный штамм обычно происходит от штамма дикого типа, который был выделен у кур, индеек, уток, гусей или других видов птиц, причем этот штамм обычно является низкопатогенным для кур. В качестве примера изолятов (штаммов дикого типа), используемых для получения вакцин для защиты кур против птичьего гриппа подтипа H5 или H7, можно назвать изоляты A/turkey/Wisconsin/68 или A/chicken/Italy/22A/98, которые являются вирусными штаммами, имеющими подтип H5N9, изоляты A/turkey/England/N-28/73, A/chicken/Mexico/238/94/CPA, A/chicken/Mexico/232/94/CPA или A/duck/Potsdam/1402/86, которые являются вирусными штаммами, имеющими подтип H5N2, изолят A/goose/Guandong/1/1996, который является вирусным штаммом HP, имеющим подтип H5N1, изоляты A/chicken/Italy/AG-473/1999 или A/chicken/Italy/1067/1999, которые являются вирусными штаммами, имеющими подтип H7N1, изолят A/chicken/Pakistan/95, который является штаммом HP, имеющим подтип H7N3, и изолят A/duck/Potsdam/15/80, который является вирусным штаммом, имеющим подтип H7N7. В качестве примера вирусных штаммов H9N2, используемых для защиты домашней птицы против птичьего гриппа подтипа H9, можно назвать изоляты A/chicken/Iran/AV12221/98 и A/chicken/UAE/415/99. В качестве примера вирусного штамма H6N2, используемого для защиты кур против птичьего гриппа подтипа H6, можно назвать изолят A/turkey/Italy/90. Вакцинные штаммы, используемые для получения вакцин, могут также быть реассортантами штаммов дикого типа, полученными, в частности, обратной генетикой. Можно, в частности, назвать вакцинный штамм Re-1, который является штаммом-реассортантом, полученным обратной рекомбинацией штамма дикого типа H5N1 A/goose/Guandong/1/96 с «мастер»-штаммом A/PR/8/34, который очень хорошо размножается в яйцах (Tian et al., 2005, Virology, 341: 153-162). Другим примером штамма-реассортанта, полученного обратной генетикой, является штамм H5N3, полученный генетической перегруппировкой и содержащий гемагглютинин H5 штамма H5N1 A/chicken/Vietnam/C58/04, нейраминидазу штамма H2N3 A/duck/Germany/1215/73 и внутренние гены «мастер»-штамма A/PR/8/34 (Webster et al., 2006, Virology, 351: 301-311).

Вакцины против птичьего гриппа обычно содержат вирус единственного инактивированного штамма вируса гриппа (моновалентные вакцины), но, в некоторых случаях, может быть выгодно использовать поливалентные вакцины, содержащие несколько инактивированных штаммов вируса гриппа. В частности, это может быть вакцина, основанная на штаммах H7N1 и H5N9, которая является эмульсией типа «вода-в-масле», содержащей инактивированные вакцинные штаммы A/chicken/Italy/22A/98 (H5N9) и A/chicken/Italy/1067/1999 (H7N1). Инактивированные вакцины могут также содержать другие валентности, например, двухвалентная вакцина против птичьего гриппа H9N2 и болезни Ньюкасла. Инактивированные вакцины обычно вводят парентерально (внутримышечно или подкожно). Они могут также вводиться в форме спрея, как в случае вакцины Aerovac AI, выпускаемой Investigacion Aplicada, которая содержит инактивированный вакцинный штамм A/chicken/Mexico/232/94/CPA (H5N2). Схема иммунизации обычно включает одно или два введения с интервалом в 2-4 недели. Вводимая доза вакцины варьирует в зависимости от возраста животных, но обычно содержит эквивалент 10-200 мкл аллантоисной жидкости, имеющей титр 10⁸-10¹⁰  EID₅₀/мл перед инактивацией. Дозу вакцины обычно вводят в объеме в пределах от 0,05 до 1 мл. Получение инактивированных вакцин против птичьего гриппа описана H. Stone (1987, Avian Dis. 31: 483-490). Поскольку подтип НА вакцинного штамма является тем же самым, как НА штамма, ответственного за патогенный птичий грипп, и на основе степени идентичности между последовательностями белка этих двух НА порядка от 80% до 90%, определяемой посредством программы полного выравнивания, степень защиты, полученная против клинических симптомов птичьего гриппа (осложненное течение и летальность), обычно составляет более 80%, и предпочтительно более 90%. Это подтверждено исследованиями M. Bublot et al., 2007, Avian Dis. 51: 332-337, которые показывают, что степень идентичности порядка от 80% до 90% между последовательностью белка НА вакцинного штамма и последовательностью белка НА патогенного инфекционного штамма достаточна, чтобы получить эту степень защиты. Кроме того, для того чтобы получить эту степень защиты, не является необходимым, чтобы подтип NA вакцинного штамма был тем же самым, что и подтип NA патогенного инфекционного штамма. Кроме того, птичьи вакцины против гриппа значительно уменьшают экскрецию вируса у вакцинированных животных, привитых инфекционным вирусом, что демонстрируется явным снижением вирусной нагрузки, наблюдаемой в оральных и клоакальных пробах (M. Bublot et al., 2007, Avian Dis. 51: 332-337). Другое благоприятное воздействие вакцин против птичьего гриппа заключается в уменьшении диффузии вируса в хозяйствах по разведению кур.

Согласно другому варианту осуществления способа согласно изобретению, вакцина, используемая для иммунизации кур, находится в форме композиции, включающей аттенуированный штамм вируса гриппа. Вакцинный штамм находится обычно в форме реассортанта, который был отобран в результате генетической перегруппировки между штаммом дикого типа, экспрессирующим представляющий интерес НА, и, возможно, представляющую интерес NA, и «мастер»-штаммом, который был адаптирован к холоду и/или который является чувствительным к температуре. Реассортант представляет собой вирусный штамм, который экспрессирует на своей поверхности представляющие интерес НА и, возможно, NA, в то же самое время сохраняя фенотипические характеристики «мастер»-штамма, которые касаются его способности к репликации только в узких пределах температур, ниже внутренней температуры птиц. В результате вакцинный штамм, после его введения курам, реплицируется ограниченным образом и локально. Способы получения этих штаммов-реассортантов известны специалисту и описаны, в частности, в WO 03/091401 и WO 2006/063053 и Wareing M.D. et al., 2002, Vaccine 20: 2082-2090. Введение вакцины обычно осуществляют распылением. Другое средство получения аттенуированного штамма состоит в усечении гена, кодирующего белок NS1 (Richt J.A. et al., Vaccination of pigs against swine influenza viruses by using an NS1-truncated modified live-virus vaccine, 2006, J. Virol., 80: 11009-18; Quinlivan M. et al., Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein, 2005, J. Virol., 79: 8431-9).

Вакцинные штаммы могут быть получены любым способом с использованием методик культуры на клетках, таких как клетки Vero, клетки MDCK, клетки PER.C6 или клетки куриного эмбриона (CEK, PCJ) и/или с использованием обычных способов получения на яйцах с развивающимся эмбрионом. Способы сбора, очистки и, в случае необходимости, инактивации вируса также известны специалисту.

Согласно другому варианту осуществления способа согласно изобретению вакцина находится в форме белков, полученных в системе экспрессии in vitro. Например, НА может быть получен в системе экспрессии с использованием рекомбинантного бакуловируса в клетках насекомого (Crawford J. et al., Baculovirus-derived hemagglutinin vaccines protect against lethal influenza infections by avian H5 and H7 subtypes, 1999, Vaccine, 17: 2265-74). Гемагглютинин может также экспрессироваться in vitro в форме “вирусоподобных частиц” (VLP) (Prel A. et al., Assessment of the protection afforded by triple baculovirus recombinant coexpressing H5, N3, M1 proteins against a homologous H5N3 low-pathogenicity avian influenza virus challenge in Muscovy ducks, 2007, Avian Dis., 51: 484-9; Pushko P. et al., Influenza virus-like particles comprised of the HA, NA, и M1 proteins of H9N2 influenza virus induce protective immune responses in BALB/c mice, 2005, Vaccine, 23: 5751-9) или псевдотипа на основе ретровируса (Szecsi J. et al., 2006, Virol. J., 3: 70). Белки, полученные in vitro, или полученные вирусные частицы более или менее очищают и затем объединяют с различными адъювантами, такими как используемые в инактивированных вакцинах.

Согласно другому варианту осуществления способа согласно изобретению вакцина против гриппа включает вектор, включающий фрагмент нуклеиновой кислоты, кодирующий НА вируса гриппа.

Термин "вектор" относится к структурам нуклеиновой кислоты, которые могут быть распространены в и/или перенесены в организмы, клетки или компоненты клеток. Это включает, в частности, плазмиды, вирусы, бактериофаги, провирусы, фагмиды и искусственные хромосомы, которые являются способными к автономной репликации или которые могут интегрироваться в хромосому клетки-хозяина.

Под “вектором, включающим ген, кодирующий НА вируса гриппа” понимают вектор, включающий нуклеиновую кислоту, кодирующую представляющие интерес НА и/или NA, и который, после введения в птичью клетку, экспрессирует в этой клетке НА и/или NA. Это может быть плазмида, экспрессирующая представляющий интерес НА, но обычно вектор представляет собой вирусный вектор, содержащий в своем геноме нуклеиновую кислоту, кодирующую представляющий интерес НА, и экспрессирующий представляющий интерес НА в инфицированных клетках. Интеграцию нуклеиновой кислоты, кодирующей представляющий интерес НА, в геном вирусного вектора обычно осуществляют методиками молекулярной биологии, в частности, генетической рекомбинации, клонирования, обратной генетики и т.д. НА может экспрессироваться или не экспрессироваться на поверхности вирусного вектора. Предпочтительно, вирусный вектор аттенуируют обычным образом множественными пассажами in vitro или делецией некоторых генов таким образом, чтобы репликация векторного вируса в птичьих клетках была достаточно ограничена и не оказывала никакого эффекта на общее состояние кур, и таким образом, вирус считался бы непатогенным. В качестве примера вирусных векторов можно назвать птичьи парамиксовирусы (Ge J., et al., Newcastle disease virus-based live attenuated vaccine completely protects chickens and mice from lethal challenge of homologous and heterologous H5N1 avian influenza viruses, 2007, J Virol., 81: 150-8); вирус индюшачьего герпеса (HVT) или вирус болезни Марека (Sondermeijer et al., 1993, Vaccine, 11, 349-358); вирус инфекционного ларинготрахеита (ILTV) (Veits J., et al., Deletion of the non-essential UL0 gene of infectious laryngotracheitis (ILT) virus leads to attenuation in chickens, and UL0 mutants expressing influenza virus hemagglutinin (H7) protect against ILT and fowl plague, 2003, J Gen. Virol., 84: 3343-52; Luschow D. et al., Protection of chickens from lethal avian influenza A virus infection by live-virus vaccination with infectious laryngotracheitis virus recombinants expressing the hemagglutinin (H5) gene, 2001, Vaccine, 19: 4249-59); аденовирусы (Francois A. et al., Avian adenovirus CELO recombinants expressing VP2 of infectious bursal disease virus induce protection against bursal disease in chickens, 2004, Vaccine, 22: 2351-60; Gao W. et al., Protection of mice and poultry from lethal H5N1 avian influenza virus through adenovirus-based immunization, 2006, J Virol., 80: 1959-64; Toro H. et al., Protective avian influenza in ovo vaccination with non-replicating human adenovirus vector, 2007, Vaccine, 25: 2886-91); коронавирусы (Cavanagh, 2007, Vet Res. 38: 281-97; Eriksson, 2006, Clin. Dev. Immunol. 13: 353-60), но предпочтительно для вакцинации кур используют поксвирусы, в частности вирус осповакцины, NYVAC (делетированный вирус осповакцины), штамм MVA вируса осповакцины, в частности вирус оспы птиц, особенно вирус оспы канареек, ALVAC (аттенуированный вирус оспы канареек), вирус оспы голубей, вирус оспы перепелов, вирус оспы индеек, вирус оспы воробьев и наиболее предпочтительно вирус оспы домашней птицы, TROVAC (аттенуированный вирус оспы кур), которые описаны, в частности, в AU 701599B и AU 701781B и в US 5 756 103. В зависимости от случая аттенуированные вирусные векторы экспрессируют только представляющий интерес НА: в частности, это относится к вакцине, содержащей вектор на основе вируса оспы кур TROVAC, экспрессирующий НА штамма вируса гриппа H5N8 (A/turkey/Ireland/1378/83). В других случаях аттенуированный вирусный вектор экспрессирует представляющий интерес НА в комбинации с представляющим интерес NA, как рекомбинантный поксвирус, описанный в 2003, Avian Pathology, 32: 25-32, который экспрессирует как HA, так и NA, происходящие от штамма вируса гриппа H5N1. Представляющей интерес NA является NA, которая обычно имеет тот же самый подтип, как NA вирусного штамма, против которого требуется иммунизация и защита кур. В других случаях аттенуированные векторы экспрессируют несколько представляющих интерес НА, принадлежащих к различным подтипам, как в случае рекомбинантного поксвируса, описанного MingXiao M. et al., 2006, Vaccine, 24: 4304-4311, который экспрессирует подтипы как H5, так и H7. Иммуногенная способность этих векторов может быть дополнительно усилена введением в них генов, кодирующих цитокины и/или хемокины, которые оказывают иммуностимулирующее действие, такие как IL-1, IFN, CSF, GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-18 или TNF 5 (Vaccine, (2006), 24: 4304-4311). Вакцины на основе векторов, кодирующих НА вируса гриппа, могут также сочетаться с адъювантами для усиления их иммуногенности.

Вакцинные композиции, содержащие вирусные векторы, могут вводиться различными путями, которые зависят, в частности, от вектора: например, прокалыванием мембраны крыла (поксвирусный вектор), внутримышечным, подкожным или чрескожным путем с использованием или без использования иглы (любой вектор), путем in ovo (в 17-19-дневное яйцо с развивающимся эмбрионом; например, HVT/Marek и аденовирусный вектор), через глаз или носо-ротовым путем, в форме спрея или в питьевой воде (парамиксовирусный, коронавирусный, аденовирусный вектор), в одной или двух инъекциях с интервалом по меньшей мере в 15 дней. Вводимая доза вакцины составляет величину порядка от 1 до 7 log₁₀ 50% инфекционной единицы, предпочтительно от 2 до 4 log₁₀ для векторов на основе вируса оспы кур. Преимущество вакцинации, основанной на вирусном векторе, по сравнению с обычной вакцинацией с использованием инактивированного или аттенуированного цельного вируса гриппа заключается в том факте, что вакцинированных животных можно отличить от инфицированных животных. Кроме того, вакцинация вирусным вектором способствует развитию клеточного иммунитета, который может усилить защиту животных. Как показано в Avian Dis., (2007), 51: 325-331 and Avian Dis., (2007), 51: 498-500, степень защиты, полученной у кур, и уменьшение диффузии вируса на птицефермах имеет тот же самый порядок, как тот, который наблюдается с обычной вакциной, содержащей инактивированный вирус гриппа. Когда вакцинация кур включает несколько инъекций, вакцина, используемая в первом введении, может быть отличной от используемой во второй инъекции или последующих инъекциях. Могут использоваться два различных аттенуированных вирусных вектора, например рекомбинантный вектор ALVAC, экспрессирующий представляющий интерес НА, в первой иммунизации и рекомбинантный вектор TROVAC или NYVAC, экспрессирующий тот же самый представляющий интерес НА, в последующих иммунизациях, таким образом, что гуморальный иммунный ответ, направленный против вектора ALVAC, не препятствует инфекции клеток кур рекомбинантным вектором TROVAC или NYVAC и, следовательно, экспрессии НА в инфицированных клетках. Также возможно использовать так называемый способ “prime boost”, который состоит в использовании, в первой инъекции, аттенуированного вирусного вектора, экспрессирующего НА, и в использовании, в повторной(ых) инъекции(ях), вакцины, содержащей, например, один или более инактивированных вакцинных штаммов, принадлежащих тому же самому подтипу, что и НА, используемый в первой иммунизации, или, альтернативно, можно действовать в обратном порядке. Наконец, возможно осуществить вакцинацию ДНК в первой инъекции, используя плазмиду, экспрессирующую представляющий интерес НА, с последующими повторными инъекциями, используя вакцину, содержащую инактивированный вакцинный штамм и/или аттенуированный вирусный вектор, которые экспрессируют НА, принадлежащий к тому же самому подтипу, как и НА, используемый в первой иммунизации или который является идентичным НА, используемому в первой иммунизации.

Безотносительно типа вводимой вакцины или принятой схемы вакцинации, защита кур против птичьего гриппа обеспечивается весьма быстро, обычно в пределах периода от 7 до 18 дней после введения вакцинной дозы. Однако, чтобы гарантировать защиту кур против птичьего гриппа в течение их яйцекладущей активности, которая длится приблизительно один год, рекомендуются одна или две повторных вакцинации, которые выполняют в пределах периода от 3 до 16 недель после первого введения вакцины. Несколько схем вакцинации инактивированными вакцинами могут использоваться у кур-несушек: например, 2 инъекции, первая в возрасте от 3 до 6 недель и вторая в возрасте от 16 до 19 недель, как раз перед наступлением яйценосного возраста, или 3 инъекции, первая в возрасте приблизительно от 2 до 4 недель, вторая от 3 до 4 недель спустя и третья в возрасте от 16 до 19 недель, как раз перед наступлением яйценосного возраста. Повторная вакцинация может также осуществляться в течение яйценосного возраста. В схеме “prime-boost” с использованием 2 различных вакцин цыплята могут быть вакцинированы в возрасте 1 день вакциной на основе вектора, представляющего собой вирус оспы кур; они впоследствии получают одну (в возрасте от 16 до 19 недель, как раз перед наступлением яйценосного возраста) или две (в возрасте от 3 до 6 недель и в возрасте от 16 до 19 недель, как раз перед наступлением яйценосного возраста) иммунизации вакциной, содержащей инактивированный вирус гриппа.

В осуществлении способа согласно изобретению яйца предпочтительно забирают от кур, как только обеспечена защита кур против птичьего гриппа, что обычно происходит в пределах периода от 7 до 18 дней после введения вакцины (Bublot M. et al. (2006, Annals of the New York Academy of Sciences 1081: 193-201); Van der Goot et al. (2005, Proc. Natl. Acad. Sc., 102: 18141-6); Ellis et al. (Avian Pathol. 2004, 33, 405-412)).

Несмотря на наличие антител против гриппа в яйцах вакцинированных кур, особенно антител, направленных к НА, и в частности, антител, ингибирующих гемагглютинацию (IHA), которые блокируют проникновение вируса гриппа в чувствительные клетки, обычным является способ, используемый для получения вируса гриппа из яиц с развивающимся эмбрионом, происходящих от кур, в