Применение белковых гидролизатов для стабилизации детергентных составов металлопротеазы

Применение белковых гидролизатов для стабилизации детергентных составов металлопротеазы

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

По данной заявке испрашивается приоритет на основании предварительной заявки США №60/914965, поданной 30 апреля 2007 г., которая включена в данное описание посредством ссылки во всей полноте.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к применению ингибиторных белковых гидролизатов для стабилизации содержащих металлопротеазу детергентных составов в условиях хранения.

Предшествующий уровень техники

Ферменты являются ключевыми активными ингредиентами многих детергентных составов. Вследствие каталитической активности ферменты способны разрушать пятна с высокой эффективностью. Однако поскольку ферменты представляют собой биологические продукты, они входят в число наиболее дорогих ингредиентов. Следовательно, поддержание высокой ферментативной активности на протяжении срока службы детергентного состава является критическим условием для успешного применения продуктов, полученных на основе таких детергентных составов.

Ферменты, используемые в таких составах, включают протеазы, липазы, амилазы, целлюлазы, маннозидазы, а также другие ферменты или их смеси.

Хорошо известны проблемы, связанные с поддержанием стабильности фермента при хранении (т.е. до использования) в жидком виде. Как правило, применение протеаз создает большие проблемы со стабильностью, поскольку их каталитическая активность направлена на разрушение других белков в составе, а также самих протеаз в результате автолиза (т.е. саморазрушения). Однако вследствие относительной простоты, с которой можно стабилизировать серинпротеазы (например, субтилизин), а также разработки рекомбинантных мутантов, обладающих повышенной стабильностью, этот класс протеаз широко используют в детергентных составах. Фактически субтилизины относятся к наиболее коммерчески важным протеазным ферментам вследствие их использования в детергентах.

Металлопротеазы, напротив, редко используются или совсем не используются в промышленных продуктах, таких как детергентные составы. Металлопротеазы представляют собой более сложные белковые системы, для стабильности и функционирования которых абсолютно необходимы кальций и ионы металлов, соответственно. Детергентные составы и другие чистящие композиции обычно содержат сложную комбинацию активных ингредиентов, которая сильно осложняет поддержание стабильности и активности металлопротеазы. В частности, детергентные составы зачастую содержат соединения, образующие хелатные комплексы с кальцием и/или необходимыми ионами металлов, что приводит к уменьшению потерь стабильности или каталитической активности.

В патентной заявке США №11/581102, поданной 12 октября 2006 г. (которая включена в данное описание посредством ссылки), раскрыты нейтральные металлопротеазы, которые позволяют преодолеть трудности, связанные с использованием металлопротеаз в детергентных составах. В частности, обнаружено, что нейтральные металлопротеазы из Bacillus sp. NprE и PMN устойчивы к условиям детергентных составов и являются стабильными в течение примерно 4 недель при концентрации ионов цинка ниже 15 мМ. Кроме того, указанные нейтральные металлопротеазы обладают хорошими очищающими свойствами даже при низких температурах. В частности, показано, что рекомбинантная нейтральная металлопротеаза из Bacillus amyloliquefaciens, NprE, обладает лучшими чистящими характеристиками применительно к Equest Grass (Warwick), чем другие детергентные составы. Таким образом, нейтральные металлопротеазы при достаточной стабилизации можно использовать для создания усовершенствованных, коммерчески рентабельных промышленных детергентов.

Применение нейтральных металлопротеаз все еще связано с характерной для протеаз проблемой, заключающейся в автолитической деградации, которая приводит к быстрому уменьшению их активности и, следовательно, стабильности детергентных составов при хранении. Относительно высокая стоимость металлопротеаз (или любого фермента) требует перед применением минимизировать потери активности, чтобы сделать их коммерчески рентабельными в качестве ингредиентов детергента. Безусловно, никакие композиции и/или способы, используемые для минимизации автолитической деградации металлопротеаз, не должны слишком сильно увеличивать стоимость, которая может повыситься в результате ингибирования желаемой ферментативной активности (например, обеспечивающей деградацию белковых компонентов пятен и др.) при применении. Следовательно, нужно достичь тонкого баланса с тем, чтобы минимизировать автолитическую активность при хранении детергента без уменьшения желаемой активности при применении. Таким образом, остается потребность в способах, соединениях, составах и композициях, предотвращающих деградацию металлопротеаз, в частности, входящих в состав детергентных составов и других очищающих композиций.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к композициям и детергентным составам, которые содержат фермент металлопротеазу и ингибитор металлопротеазы и, как следствие, обладают повышенной стабильностью против деградации. Данное изобретение также относится к способам получения таких стабилизированных ингибитором композиций и детергентных составов, содержащих металлопротеазу.

Все раскрытые в данном описании композиции и детергентные составы содержат металлопротеазу и обладают повышенной стабильностью вследствие включения в их состав ингибитора металлопротеазы, который связывается с ферментом и предотвращает автолитическую деградацию фермента. Важно, что указанные стабилизированные ингибитором композиции и детергентные составы получают таким образом, что при хранении ингибитор связывается с металлопротеазой и эффективно уменьшает ее деградацию, но после разбавления композиции или детергента при его применении, ингибитор отделяется, высвобождая активный фермент. Настоящее изобретение раскрывает белковые гидролизаты в качестве особенно эффективных ингибиторов металлопротеазы для стабилизации ее против деградации. В особенно предпочтительном варианте осуществления ингибиторный белковый гидролизат получают путем расщепления (гидролиза) белкового субстрата непосредственно самим ферментом металлопротеазы. Полученный продукт гидролиза может быть выделен и является особенно эффективным конкурентным ингибитором металлопротеазы, под действием которой он образуется.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретение относится к детергентным составам (а также способам их получения), где ингибиторы металлопротеазы представляют собой белковые гидролизаты. Белковые гидролизаты по настоящему изобретению состоят из пептидных фрагментов, образующихся в результате гидролиза (или ферментативного, или неферментативного) ряда белков (например, казеина). Белковые гидролизаты, используемые в настоящем изобретении в качестве ингибиторов, включают, но без ограничения: гидролизат пшеничной клейковины (например, HyPep 4601™), кислый гидролизат соевого белка (например, Amisoy), кислый гидролизат казеина коровьего молока (например, Amicase) и ферментативный гидролизат растительного белка (например, протеозопептон). Кроме того, данное изобретение описывает применение ингибиторного белкового гидролизата, полученного путем гидролиза/гидролитического расщепления под действием одного или нескольких металлопротеазных ферментов, например, представляющего интерес фермента металлопротеазы.

В ряде предпочтительных вариантов осуществления изобретение относится к жидким детергентным составам, содержащим нейтральные металлопротеазы, выделенные из Bacillus sp, и в частности, рекомбинантную нейтральную металлопротеазу из Bacillus amyloliquifaciens, NprE.

В одном варианте осуществления изобретение относится к жидкому детергентному составу, который содержит: (a) от примерно 1% до примерно 75% по массе поверхностно-активного вещества; (b) от примерно 10% до примерно 95% по массе воды; (c) от примерно 0,01% до примерно 5% по массе нейтральной металлопротеазы; и (d) количество ингибитора нейтральной металлопротеазы, такое, что ингибитор связывается с по меньшей мере 90% молекул нейтральной металлопротеазы, а именно, связывается с активным центром или с участком, отличным от активного центра, и предотвращает или ингибирует каталитическое взаимодействие субстрата с активным центром перед применением, и где соответствующее разбавление детергентного состава приводит к диссоциации ингибитора с по меньшей мере примерно 25% связанных молекул нейтральной металлопротеазы. Как правило, соответствующее разбавление происходит, когда жидкий детергентный состав добавляют к большому объему промывочной воды, что приводит к разбавлению детергентного состава в 200, 400, 500, 600 или даже 1000 раз.

В одном варианте осуществления данного состава при разбавлении указанного детергента высвобождается более или равное 45%, 65%, 75%, 85% или даже 95% связанного с ингибитором фермента нейтральной металлопротеазы в виде формы, не содержащей ингибитора. В одном варианте осуществления ингибитор, выбранный для состава, конкурентно ингибирует нейтральную металлопротеазу с кажущейся K_i от примерно 5 мМ до примерно 15 мМ в интервале pH от примерно 6,5 до примерно 11, предпочтительно, от примерно 7,5 до примерно 9,5. В предпочтительном варианте осуществления детергентная композиция содержит ингибиторный белковый гидролизат, имеющий кажущуюся K_i ~10 мМ при pH примерно 8,0.

Хотя абсолютное количество ингибитора, используемое в составе, может варьировать в зависимости от аффинности связывания, концентрации фермента и других факторов, как правило, оно составляет от примерно 0,1% до примерно 15%, от примерно 0,05% до примерно 5%, от примерно 0,1% до примерно 2,5% от массы жидкого детергентного состава перед соответствующим разбавлением.

В одном варианте осуществления жидкий детергентный состав дополнительно стабилизируют с помощью других присутствующих ингредиентов, включающих полипропиленгликоль и/или ионы кальция (например, CaCl₂). В некоторых вариантах осуществления состав представляет собой детергент HDL, полученный согласно характерному составу HDL, выбранному из группы, состоящей из: DW-AA, DW-AF, DW- AK, DW-CR, DW-CS и DW-CT. В некоторых вариантах осуществления жидкий детергентный состав не содержит бор.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к стабилизированной ингибитором композиции нейтральной металлопротеазы, содержащей: (a) от примерно 0,001% до примерно 10% по массе нейтральной металлопротеазы; и (b) конкурентный ингибитор, где конкурентный ингибитор связан с по меньшей мере примерно 90% молекул указанной нейтральной металлопротеазы. В предпочтительном варианте осуществления конкурентный ингибитор представляет собой белковый гидролизат. В другом предпочтительном варианте осуществления нейтральная металлопротеаза получена из Bacillus sp., в частности, она представляет собой NprE из B. amyloliquifaciens. Такая стабилизированная ингибитором композиция может находиться в жидкой или сухой (например, гранулированной) форме. В одном варианте осуществления композицию используют в качестве ингредиента-предшественника при получении описанных выше детергентных составов по настоящему изобретению. В другом варианте осуществления стабилизированная ингибитором композиция металлопротеазы находится в виде инкапсулированной частицы.

Таким образом, в другом варианте осуществления стабилизированную ингибитором композицию металлопротеазы используют для получения детергентного состава путем объединения композиции с: (a) водой; (b) детергентным поверхностно-активным веществом, составляющим от примерно 0,1% до примерно 75% по массе; (c) пропиленгликолем, составляющим от примерно 5% до примерно 15% по массе; и (d) ионом Ca2+ в количестве, составляющим от примерно 0,5 мМ до примерно 5,0 мМ.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения представляет собой жидкий детергентный состав, полученный путем объединения ингредиентов, включающих: (a) водный буфер, имеющий pH в интервале от примерно 6,5 до примерно 8,5; (b) детергентное поверхностно-активное вещество, составляющее от примерно 0,1% до примерно 75% по массе; (c) металлопротеазу, составляющую от примерно 0,01% до примерно 5% по массе; и (d) субстратный белок, где в результате расщепления субстратного белка под действием по меньшей мере одной металлопротеазы, т.е. одной или нескольких металлопротеаз, образуется продукт, который связывается с по меньшей мере примерно 90% молекул металлопротеазы. В одном варианте осуществления субстратный белок выбран из группы, состоящей из: пшеничной клейковины, казеина, соевого белка и растительного белка. В одном варианте осуществления субстратный белок используют в количестве, составляющем от примерно 0,01% до примерно 15% по массе. Как в случае других раскрываемых в данном описании составов, в некоторых вариантах осуществления металлопротеаза представляет собой нейтральную металлопротеазу, выделенную из Bacillus sp., в частности, нейтральную металлопротеазу NprE.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу получения стабилизированного ингибитором жидкого детергентного состава, включающему: (a) инкубацию смеси, содержащей по меньшей мере одну нейтральную металлопротеазу, т.е. одну или несколько нейтральных металлопротеаз, и белковый субстрат, в водном буфере при pH в интервале от примерно 6,5 до примерно 11 и при температуре от примерно 22°C до примерно 37°C, в процессе которой расщепление субстратного белка под действием по меньшей мере одной нейтральной металлопротеазы, т.е. одной или нескольких нейтральных металлопротеаз, приводит к образованию продукта гидролиза; (b) выделение продукта гидролиза с молекулярной массой менее приблизительно 5000 Да; и (c) объединение продукта гидролиза стадии (b) с жидким детергентным составом, содержащим от примерно 0,001% до примерно 10% по массе нейтральной металлопротеазы. В другом варианте осуществления изобретение относится к способу получения стабилизированного ингибитором жидкого детергентного состава, включающему объединение белкового продукта гидролиза с жидким детергентным составом, содержащим от примерно 0,001% до примерно 10% по массе нейтральной металлопротеазы, где белковый продукт гидролиза получают путем инкубации смеси, содержащей по меньшей мере одну нейтральную металлопротеазу, т.е. одну или несколько нейтральных металлопротеаз, и белковый субстрат, в водном буфере при pH в интервале от примерно 6,5 до примерно 11 и при температуре от примерно 22°C до примерно 37°C, в процессе которой расщепление субстратного белка под действием по меньшей мере одной нейтральной металлопротеазы, т.е. одной или нескольких нейтральных металлопротеаз, приводит к образованию продукта гидролиза, и где продукт гидролиза с молекулярной массой менее приблизительно 5000 Да выделяют перед объединением с нейтральной металлопротеазой. В одном варианте осуществления инкубационная смесь содержит от примерно 0,001% до примерно 10% нейтральной металлопротеазы и от примерно 5% до примерно 20% по массе белкового субстрата. В предпочтительном варианте осуществления нейтральная металлопротеаза представляет собой NprE, и белковый субстрат представляет собой казеин коровьего молока.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к вектору экспрессии, содержащему ген нейтральной металлопротеазы и ген белкового субстрата, где продукт гена белкового субстрата ферментативно превращают под действием продукта гена нейтральной металлопротеазы с образованием ингибитора белкового гидролизата. В другом варианте осуществления вектор экспрессии дополнительно содержит промотор, функционально связанный с геном белкового субстрата, где промотор увеличивает экспрессию продукта гена белкового субстрата, но не продукта гена нейтральной металлопротеазы. В одном варианте осуществления ген нейтральной металлопротеазы получают из Bacillus sp., и белковый субстрат получают из казеина. В предпочтительном варианте осуществления ген нейтральной металлопротеазы представляет собой NprE из B. amyloliquifaciens, и белковый субстрат представляет собой казеин.

Краткое описание фигур

На фиг.1 изображен график, полученный с использованием экспериментальных аналитических данных, который показывает, что NprE в повышенных концентрациях с добавлением полипропиленгликоля (PPG) и CaCl₂ позволяет сохранить повышенную активность AGLA с течением времени. Все образцы содержат NprE в указанной концентрации, а также 10% PPG и 0,5 мМ CaCl₂. Закрашенные кружки обозначают контроль, содержащий 625 ч./млн NprE без добавления PPG или CaCl₂.

На фиг.2 изображены кинетические данные, полученные для равновесного состояния, которые показывают, что продукт гидролиза казеина под действием NprE является конкурентным ингибитором NprE. На фиг.2A показана зависимость активности NprE по отношению к субстрату от возрастающих количеств ингибитора. На фиг.2B показан двойной график обратной зависимости с общим отрезком, отсекаемым на оси Y. На фиг.2C показан построенный по новым данным график зависимости кажущейся K_m от концентрации ингибиторного пептида. На фиг.2D показан построенный по новым данным двойной график обратной зависимости от увеличивающейся концентрации ингибиторного пептида. На фиг.2C и 2D отсекаемый на оси Х отрезок показывает, что кажущаяся K_i соответствует концентрации продукта гидролиза казеина, составляющей примерно 10 мМ.

На фиг.3 изображен график зависимости активности NprE от времени в присутствии различных белковых гидролизатов.

Подробное описание настоящего изобретения

Общее представление

Настоящее изобретение относится к композициям и детергентным составам, содержащим фермент металлопротеазы и ингибитор металлопротеазы, которые обладают повышенной стабильностью против деградации. Настоящее изобретение также относится к способам получения указанных стабилизированных ингибитором металлопротеазы композиций и детергентных составов.

Все раскрытые в данном описании композиции и детергентные составы содержат металлопротеазу и обладают повышенной стабильностью, которая обусловлена присутствием конкурентного ингибитора, способного обратимо связываться с ферментом и посредством этого предотвращать его автолитическую деградацию. Как указано в данном описании, ингибитор может связываться с активным центром и непосредственно препятствовать взаимодействию субстрата с ферментом по активному центру. Альтернативно, ингибитор может связываться с участком, отличным от активного центра (т.е. ингибитор не является специфичным в отношении активного центра), и предотвращать или ингибировать каталитическое взаимодействие субстрата с ферментом, например, путем индуцирования изменений третичной или четвертичной структуры, которые препятствуют или затрудняют взаимодействие субстрата с активным центром. Важно, что указанные стабилизированные ингибитором композиции и детергентные составы получают таким образом, что при хранении ингибитор связывается с металлопротеазой и эффективно уменьшает ее деградацию, но после разбавления композиции или детергента при его применении ингибитор отделяется, высвобождая активный фермент. Настоящее изобретение раскрывает белковые гидролизаты в качестве особенно эффективных ингибиторов металлопротеазы, стабилизирующих ее против деградации. В особенно предпочтительном варианте осуществления ингибиторный белковый гидролизат получают путем гидролиза белкового субстрата под действием непосредственно самого фермента металлопротеазы. Полученный продукт гидролиза может быть выделен и является особенно эффективным конкурентным ингибитором металлопротеазы, под действием которой он образуется.

Определения

Если не указано иное, все используемые в данном описании технические и научные термины имеют значения, традиционно используемые специалистами в области, к которой относится настоящее изобретение. Например, толкования многих используемых как использовано в данном описании, терминов специалисты в данной области могут найти в общих словарях Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, NY (1994); и Hale and Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991). Хотя в данном описании описаны предпочтительные способы и материалы, при осуществлении настоящего изобретения можно использовать любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным. Соответственно, определенные ниже термины более полно разъясняются посредством ссылки на описание в целом. Кроме того, если в контексте явно не указано иное, как использовано в данном описании, термины, используемые в единственном числе, включают множественное число. Если не указано иное, нуклеиновые кислоты читаются слева направо в направлении от 5'-конца к 3'-концу; аминокислотные последовательности читаются слева направо в направлении от амино-конца к карбокси-концу, соответственно. Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными описанными методиками, протоколами и реагентами, поскольку специалисты в данной области смогут модифицировать их в зависимости от преследуемых целей.

Подразумевается, что все максимальные пределы численных значений, приведенные в настоящем описании, включают все более низкие пределы численных значений, как если бы такие более низкие пределы численных значений были специально указаны в данном описании. Все минимальные пределы численных значений, приведенные в настоящем описании, включают все более высокие пределы численных значений, как если бы такие более высокие пределы численных значений были специально указаны в данном описании. Все численные интервалы, приведенные в настоящем описании, каждый включает более узкие численные интервалы, которые входят в такие более широкие численные интервалы, как если бы такие более узкие численные интервалы были специально указаны в данном описании.

Все цитируемые документы, в соответствующей части, включены в данное описание посредством ссылки; цитирование какого-либо документа не является допущением того, что он относится к известному уровню техники в области, к которой относится настоящее изобретение.

Как использовано в данном описании, термин "фермент" относится к любому белку, который катализирует химическую реакцию. Каталитическая функция фермента составляет его "активность" или "ферментативную активность". Фермент обычно классифицируют согласно типу его каталитической функции, такому как, например, гидролиз пептидных связей.

В данном описании выражение "эффективное количество фермента" относится к количеству фермента, необходимому для достижения ферментативной активности, требующейся для конкретного применения (например, для применения средства личной гигиены, чистящей композиции и др.). Такое эффективное количество может быть легко определено специалистом в данной области с учетом различных факторов, таких как конкретный используемый вариант фермента, применение детергента, конкретный состав детергента и т.п.

Как использовано в данном описании, термины "протеаза" или "протеиназа" относятся ко всем ферментам, катализирующим гидролиз пептидных связей в молекуле белка.

Как использовано в данном описании, термины "металлопротеаза" "металлопротеиназа" или "металлопептидаза" относятся к протеазе, которая может выполнять каталитическую функцию после связывания иона металла.

Как использовано в данном описании, термин "нейтральная металлопротеаза" относится к металлопротеазе, каталитическая активность которой реализуется в присутствии ионов цинка и достигает оптимального уровня при нейтральных значениях pH. Как правило, нейтральные металлопротеазы имеют размер от 30 до 40 кДа. Нейтральные металлопротеазы по настоящему изобретению, также называемые "нейтральными металлоэндопептидазами", включают ферменты класса EC 3.4.24.4.

Как использовано в данном описании, термин "субстрат" относится к веществу (например, химическому соединению), которое под действием каталитической активности фермента способно превращаться в продукт. В случае металлопротеазы субстрат обычно представляет собой белок, хотя металлопротеазы также могут воздействовать на пептидные или сложноэфирные связи небелковых соединений. Так, термин "белковый субстрат" относится к субстрату, который представляет собой белок.

Как использовано в данном описании, термин "активный центр" относится к участку фермента, в котором происходит связывание субстрата и реализация каталитической активности. В некоторых случаях фермент может содержать несколько активных центров. Как правило, металлопротеазы содержат один активный центр.

Как использовано в данном описании, термин "ингибитор" относится к любому веществу, которое уменьшает ферментативную активность. Например, ингибитор может представлять собой белковый гидролизат, полипептид, природный или синтетический аналог белкового гидролизата или полипептида. Так, ингибиторы могут включать синтетические соединения, которые имитируют некоторые аспекты способности белкового гидролизата связываться с активным центром фермента нейтральной металлопротеазы.

Как использовано в данном описании, термин "конкурентный ингибитор" относится к ингибитору, который обратимо связывается с ферментом и посредством этого препятствует связыванию субстрата, т.е. ингибитор конкурирует с субстратом за связывание с активным центром или ингибитор связывается с другим участком фермента и предотвращает или ингибирует каталитическое взаимодействие субстрата с ферментом в активном центре.

Как использовано в данном описании, "K_i" или "константа ингибирования" определяется как константа диссоциации комплекса фермент-ингибитор, т.е. отношение концентрации свободного фермента (т.е. "[E]") к концентрации фермента, связанного с ингибитором (т.е. "[E-I]"). K_i можно определить с помощью хорошо известных методов равновесной ферментативной кинетики, описанных в большинстве руководств по биохимии (см., например, Fersht, "Enzyme Structure and Mechanism," W.H. Freeman, 2nd Ed., 1985). Коротко говоря, константу ингибирования K_i определяют путем измерения влияния присутствия ингибитора (т.е. концентрации ингибитора) на равновесные кинетические константы фермента (т.е. K_m и k_cat) с помощью анализа, в котором используется известный субстрат.

Как использовано в данном описании, термин "кажущаяся K_i" относится к значению K_i, определенному в том случае, когда фактическая концентрация ингибитора не может быть точно определена. Например, если ингибитор представляет собой смесь продуктов гидролиза (т.е. смесь фрагментов белка), измеряемая K_i представляет собой "кажущуюся K_i", поскольку абсолютную концентрацию ингибитора можно определить, например, только путем химического анализа концентрации пептида. Фактические концентрации конкретных фрагментов, входящих в состав смеси, которые связываются с молекулой фермента и ингибируют ее, могут быть гораздо ниже, чем измеряемые концентрации. Следовательно, значение "кажущейся K_i" будет выше, чем значение K_i, определенное с использованием очищенного ингибитора.

Как использовано в данном описании, термин "автолиз" относится к лизису ткани или клетки под действием собственных ферментов. В одном варианте осуществления термин "автолиз" относится к гидролизу под действием фермента его собственной цепи, например, к автопротеолизу под действием фермента протеазы.

Как использовано в данном описании, термин "стабильность" в отношении фермента относится к его способности сохранять с течением времени определенный уровень функциональной активности в конкретных условиях окружающей среды. Термин "стабильность" можно использовать в ряде контекстов, относящихся к представляющим интерес конкретным условиям окружающей среды. Например, термин "автолитическая стабильность" относится к способности фермента противостоять автолитической деградации (т.е. автопротеолизу). Существенным изменением стабильности считается увеличение или уменьшение (в большинстве вариантов осуществления предпочтительно увеличение) периода полужизни ферментативной активности по меньшей мере примерно на 5% или больше, по сравнению с ферментативной активностью в отсутствии стабилизатора (например, ингибиторного соединения). Подразумевается, что данный термин не ограничивается использованием какой-либо конкретной протеазы для определения стабильности белка.

Как использовано в данном описании, термин "ферментативное превращение" относится к модификации субстрата или промежуточного продукта путем контактирования субстрата или промежуточного продукта с ферментом. В некоторых вариантах осуществления контактирование осуществляют путем непосредственного воздействия субстрата или промежуточного продукта на соответствующий фермент. В других вариантах осуществления контактирование включает воздействие субстрата или промежуточного продукта на организм, который экспрессирует и/или секретирует фермент, и/или метаболизирует желаемый субстрат и/или промежуточный продукт до целевого промежуточного соединения и/или конечного продукта, соответственно.

Как использовано в данном описании, термин "расщепление" относится к ферментативному превращению белкового субстрата в продукты под действием протеазы.

Как использовано в данном описании, термины "очищенный" и "выделенный" относятся к соединению, которое получают после удаления из образца загрязняющих примесей и/или веществ, с которыми соединение (например, полипептид или полинуклеотид) ассоциировано в природе.

Как использовано в данном описании, термин "гидролизат" относится к любому веществу, полученному в результате гидролиза. Подразумевается, что данный термин не ограничивается веществом, полученным с помощью какого-либо конкретного метода гидролиза. Предполагается, что данный термин включает "гидролизаты", полученные путем ферментативных, а также неферментативных реакций. Например, все известные гидролитические ферменты (например, серинпротеазы, металлопротеазы, гидролазы и др.) способны продуцировать гидролизаты в рамках значений термина, используемого в настоящем описании. Подобным образом, неферментативные методы гидролиза (например, кислотный/основной гидролиз и др.) также дают возможность получать гидролизаты в рамках значений термина, используемого в настоящем описании.

Как использовано в данном описании, термин "белковый гидролизат" относится к гидролизату, полученному путем гидролиза белка любого типа или класса. Любой известный белок можно гидролизовать с получением белкового гидролизата в рамках значений термина, используемого в настоящем описании. "Белковый гидролизат" может быть получен с помощью ферментативных или неферментативных методов и может содержать фрагменты белков (например, полипептиды), размер которых варьирует от двух до 100 или более аминокислот. Кроме того, как использовано в данном описании, термин "белковый гидролизат" не ограничивается одним соединением-продуктом и может включать гетерогенное распределение или смесь продуктов гидролиза (например, белковых фрагментов). Он также может включать гомогенное соединение или очищенную фракцию продуктов гидролиза. Предпочтительные варианты осуществления белковых гидролизатов включают: HyPep 4601™ (белковый гидролизат пшеничной клейковины), Amisoy (кислый гидролизат соевого белка), Amicase (кислый гидролизат казеина коровьего молока), протеозопептон (ферментативный гидролизат растительного белка).

Как использовано в данном описании, термин "белок" относится к любому соединению, состоящему из аминокислот, и определяемому специалистами в данной области как белок. Термины "белок", "пептид" и "полипептид" используются в настоящем описании как взаимозаменяемые. Там, где пептид является частью белка, специалисты в данной области понимают применение термина в контексте. Термины "дикого типа" и "нативный" используются применительно к природным белкам. В некоторых вариантах осуществления белковая последовательность дикого типа используется как исходная при получении рекомбинантных белков.

Как использовано в данном описании, термины "родственный белок" или "гомологичный белок" относятся к функционально и/или структурно подобным белкам (т.е. имеющим одинаковые функции и/или структуры). Предполагается, что данный термин охватывает одинаковые или подобные ферменты (например, с точки зрения структуры и функции), полученные из разных видов. Подразумевается, что настоящее изобретение не ограничивается родственными белками из какого-либо конкретного источника (источников) или белками, родственными в эволюционом отношении. Кроме того, термины родственные или гомологичные белки охватывают гомологи по третичной структуре и гомологи по первичной последовательности. Так, термины включают белки, последовательности которых являются "вариантными" или "мутантными" по сравнению с последовательностью дикого типа.

Как использовано в данном описании, термины "детергент", "композиция детергента" и "детергентный состав" относятся к смесям, предназначенным для применения в моющей среде для очистки загрязненных объектов. В некоторых вариантах осуществления термины используют применительно к стирке тканей и/или предметов одежды (например, "моющие средства для стирки"). В других вариантах осуществления термин относится к детергентам, используемым, например, для мытья посуды, столовых приборов и др. (таким как "средства для мытья посуды"). Как правило, данные термины охватывают составы, включая "высокоэффективные жидкости" ("HDL"), которые содержат, например, ферменты металлопротеазы, ингибиторы металлопротеаз, такие как белковые гидролизаты, стабилизаторы ферментов, такие как полипропиленгликоль, поверхностно-активные вещества, трансферазы, гидролитические ферменты, оксидоредуктазы, добавки, повышающие моющее действие, отбеливающие средства, активаторы отбеливания, подсинивающие средства и флуоресцентные красители, ингибиторы комкования, маскирующие средства, активаторы ферментов, антиоксиданты и солюбилизаторы. Подразумевается, что настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным детергентным составом или детергентной композицией.

Как использовано в данном описании, термин "поверхностно-активное вещество" относится к поверхностно-активному соединению, которое уменьшает поверхностное натяжение. Данный термин охватывает все хорошо известные типы поверхностно-активных веществ и систем поверхностно-активных веществ, которые включают неионные поверхностно-активные вещества, анионные поверхностно-активные вещества, катионные поверхностно-активные вещества, амфолитические поверхностно-активные вещества, цвиттерионные поверхностно-активные вещества, семиполярные неионные поверхностно-активные вещества и их смеси.

В данном описании фраза "стабильность детергента" относится к сохранению способности детергентных составов очищать загрязненные объекты в моющей среде в определенных условиях окружающей среды и в течение определенного периода времени. Термин стабильность детергента включает стабильность при хранении (т.е. перед использованием) или стабильность при применении в моющей среде. Стабильность детергента может варьировать в зависимости от типа тестирования очистки, используемого для определения стабильности. Кроме того, стабильность детергента может полностью соответствовать стабильности конкретных активных ингредиентов детергентного состава, если такие конкретные ингредиенты принимают значимое участие в тестировании очистки.

Если не указано иное, как использовано в данном описании, термины "чистящая композиция" и "чистящий состав" относятся к композициям, используемым для удаления нежелательных соединений из подлежащих очистки объектов, таких как ткани, посуда, контактные линзы, другие твердые основы, волосы (шампуни), кожа (мыла и кремы), зубы (жидкости для полоскания рта, зубные пасты) и др. Термин охватывает все вещества/соединения, выбранные для конкретного типа желаемой чистящей композиции и формы продукта (например, жидкост