Кормовая композиция, содержащая антиоксидант, предназначенная для усиления противовирусного иммунитета у животных-компаньонов

Кормовая композиция, содержащая антиоксидант, предназначенная для усиления противовирусного иммунитета у животных-компаньонов

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Данная заявка является частичным продолжением заявки с серийным номером 11/154210, поданной 16 июня 2005, являющейся продолжением заявки с серийным номером 09/978132, поданной 16 октября 2001, которая опубликована как патент США № 6914071, являющейся частичным продолжением заявки с серийным номером 09/922660, поданной 6 августа 2001, в которой заявляется приоритет предварительной заявки с серийным номером 60/253448, поданной 28 ноября 2000, и предварительной заявки с серийным номером 60/244504, подданной 31 октября 2000, каждая из которых, целиком включена в данное описание посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение охватывает композиции, предназначенные для усиления способности животного-компаньона сопротивляться вирусным инфекциям и/или справляться с вирусными инфекциями. Композиции по настоящему изобретению включают количество липоевой кислоты, которое эффективно для усиления противовирусного иммунитета у животного-компаньона.

Предпосылки к созданию изобретения

Животные-компаньоны, такие как собаки и кошки, видимо, страдают от проблем, вызванных старением. Некоторые из них иллюстрируют известные афоризмы. Один из них гласит: "Старого пса нельзя научить новым трюкам". Это высказывание следует из наблюдения, что по мере старения собак их умственная способность, видимо, снижается вместе с их физическими возможностями. Вероятно, снижаются умственные способности, связанные с мышлением, обучением и памятью (Cummings, B.J., Head, E., Ruehl, W., Milgram, N. W. & Cotman, C.W. (1996): The canine as an animal model of aging and dementia. Neurobiology of Aging 17:259-268). Кроме того, у стареющих животных могут проявляться поведенческие изменения, связанные с изменением умственной способности. Подобное уменьшение умственной способности вызывается множеством причин.

Указанное уменьшение умственной способности в общем случае наблюдаются у состарившихся собак и кошек. Собаки в возрасте семи лет или старше и кошки в возрасте семи лет или старше считаются старыми и могут испытывать подобные трудности.

Присутствие значительных количеств, по крайней мере, одного антиоксиданта в рационе взрослого животного-компаньона или антиоксиданта, который дают домашнему питомцу помимо указанной диеты, может подавлять начало ухудшения умственной способности у старых животных-компаньонов и/или поддерживать умственную способность взрослого животного-компаньона в пожилом возрасте.

Сущность изобретения

В соответствии с настоящим изобретением, существует диета для животного-компаньона, которая отвечает обычным питательным требованиям для взрослого домашнего питомца и которая дополнительно включает количество антиоксиданта или содержащей его смеси, достаточное для того, чтобы подавлять начало ухудшения умственной способности у указанного животного-компаньона в пожилые годы.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения охватывает способ замедления ухудшения умственной способности у пожилого животного-компаньона, который включает назначение указанному пожилому домашнему питомцу антиоксиданта или смеси антиоксидантов в концентрации, достаточной для того, чтобы обеспечить указанное подавление.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения охватывает диету для взрослого животного-компаньона, которая отвечает обычным питательным требованиям для взрослого домашнего питомца и которая дополнительно содержит антиоксидант, выбранный из группы, включающей витамин E, витамин С, альфа-липоевую кислоту, L-карнитин и любые их смеси в количествах, достаточных для подавления ухудшения умственных способностей у указанного домашнего питомца в пожилом возрасте.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения охватывает способы увеличения умственной способности у пожилого животного-компаньона, который включает назначение указанному домашнему питомцу в пожилом возрасте количества антиоксиданта или смеси антиоксидантов, достаточного для увеличения умственной способности.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения охватывает способы увеличения умственной способности у взрослого животного-компаньона, который включает назначение указанному домашнему питомцу количества антиоксиданта или смеси антиоксидантов, достаточного для увеличения умственной способности указанного домашнего питомца.

Другой вариант осуществления настоящего изобретения охватывает кормовые композиции для домашних питомцев, включающие количество одного или нескольких антиоксидантов, например, липоевой кислоты, эффективное для усиления противовирусной активности у животного-компаньона.

Подробное описание изобретения

Общее описание

Настоящее изобретение охватывает кормовые композиции для домашних питомцев, включающие количество липоевой кислоты, эффективное для усиления противовирусной активности у животного-компаньона. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения эффективное количество липоевой кислоты, предназначенной для усиления противовирусной активности у животного-компаньона, составляет, по меньшей мере, приблизительно 25 м.д.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения эффективное количество составляет, по меньшей мере, приблизительно 50 м.д.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения эффективное количество составляет, по меньшей мере, приблизительно 100 м.д.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения эффективное количество составляет от приблизительно 100 м.д. до приблизительно 600 м.д.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения эффективное количество составляет от приблизительно 100 м.д. до приблизительно 200 м.д.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения животным-компаньоном является собака.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения животным-компаньоном является кошка.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанное эффективное количество эффективно для усиления врожденной противовирусной активности у животного-компаньона.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения кормовую композицию для домашних питомцев, содержащую липоевую кислоту, назначают в течение, по крайней мере, 15 дней.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения кормовую композицию для домашних питомцев, содержащую липоевую кислоту, назначают в течение, по крайней мере, 30 дней.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения кормовую композицию для домашних питомцев, содержащую липоевую кислоту, назначают в течение, по крайней мере, 45 дней.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения кормовую композицию для домашних питомцев, содержащую липоевую кислоту, назначают ежедневно.

Корм, который дают взрослому животному-компаньону, например собаке и кошке, является стандартной нормальной едой, которую дают животному в таком возрасте. Ниже приведена типичная диета для собак в возрасте от 1 до 6 лет.

Таблица 1
Компонент	Заданное значение
Белок (% сухого вещества)	23
Жир (% сухого вещества)	15
Фосфор (% сухого вещества)	0,6
Натрий (% сухого вещества)	0,3

Добавление значительных количеств антиоксиданта или смеси антиоксидантов в корм взрослого животного-компаньона может вызвать задержку начала видимых изменений в поведении, особенно в ухудшении умственных способностей, у пожилого домашнего питомца, что конкретно подтверждается способностью выполнять задания в экспериментах по обучению. Добавление одного или нескольких антиоксидантов в корм взрослого животного-компаньона может также вызвать повышение противовирусной активности животного-компаньона. Следует понимать, что термин взрослый в общем случае означает собаку в возрасте, по крайней мере, от 1 года до 6 лет и кошку в возрасте, по крайней мере, от 1 года до 6 лет. Термин старая собака или кошка означает, что возраст животного составляет 7 лет или больше.

Потерю умственных способностей у животных семейства собачьих и кошачьих наблюдали в течение ряда лет. Указанная потеря умственных способностей проявляется различным образом. Для собак, например, она может проявляться в том, что животное теряет способность ориентироваться в пространстве, гадит в доме, у животного изменяется модель сна-бодрствования, снижается или изменяется характер взаимодействия с людьми и другими домашними животными, животное теряет способность к обучению и способность концентрировать внимание. Указанные состояния могут также проявляться у кошек. Болезнь Альцгеймера, в том виде, как она проявляется у людей, у животных семейства собачьих и кошачьих не обнаружена.

Для объяснения указанной потери умственных способностей было выдвинуто множество теорий. В настоящее время исследователями не предложено ни одного диетического курса, который подавляет указанную потерю умственных способностей или в состоянии реально вызвать положительные изменения умственных способностей, которые могут быть установлены для собак и кошек в виде объективных параметров.

Авторам настоящего изобретения удалось добиться отсрочки начала указанных ухудшений. Используя диету по настоящему изобретению для взрослых животных-компаньонов, можно показать, что у пожилых домашних животных умственная способность может поддерживаться в течение более длительного промежутка времени. Существенным является то, что ухудшение умственных способностей может быть остановлено или отсрочено. Можно улучшить память и способность к обучению. Может быть увеличена умственная активность в целом. Связанное с возрастом снижение когнитивных способностей может быть замедлено. Что касается синдрома когнитивной дисфункции, то его прогрессирование может быть замедлено у пожилых собак и становится возможным контролировать клинические признаки, связанные с указанным синдромом. Целевую группу составляет профилактика там, где она возможна, и домашние животные, нуждающиеся в подобных компонентах.

Авторы настоящего изобретения также неожиданно обнаружили, что добавление одного или нескольких антиоксидантов, например, липоевой кислоты, пригодно для усиления врожденной противовирусной функции иммунной системы у животных-компаньонов, например, у собак и кошек. В настоящем описании термин "усиливать" или "усиление" по отношению к противовирусной функции иммунной системы относится к способности животных-компаньонов давать повышенный иммунный ответ на антиген и, таким образом, проявлять большую стойкость к инфекции или проявлять способность быстрее выводить вирусные инфекции из организма. Таким образом, животное-компаньон, например собака, поедающая корм для домашних животных, который содержит антиоксидант, например липоевую кислоту, будет более стойким и будет быстрее выводить вирусные инфекции, чем животное, которое не потребляет антиоксиданты.

Компонентом корма, который позволяет добиться указанных результатов, является антиоксидант или смесь антиоксидантов. Антиоксидант представляет собой соединение, которое связывает свободные радикалы. Примеры подобных соединений включают такие пригодные к употреблению в пищу вещества, как гинкго билоба, мякоть лимона, виноградные выжимки, томатные выжимки, морковь и шпинат, преимущественно в высушенном виде, а также другие вещества, такие как бета-каротин, селен, кофермент Q10 (убихинон), лютеин, токотриенолы, изофлавоны сои, S-аденозилметионин, глютатион, таурин, N-ацетилцистеин, витамин E, витамин С, альфа-липоевая кислота, L-карнитин и т.п. Витамин E может применяться в виде токоферола или смеси токоферолов и их различных производных, таких как сложные эфиры, например, как ацетат, сукцинат, пальмитат витамина E и т.п. Альфа-форма предпочтительна, однако могут быть включены бета-, гамма- и дельта-формы. Форма D является предпочтительной, но и рацемические смеси также приемлемы. Указанные формы и производные после усвоения их домашним животным будут функционировать как напоминающая витамин E активность. Витамин С можно вводить в указанную диету в виде аскорбиновой кислоты и ее различных производных соединений, таких как соль с фосфатом кальция, соль с холестерином, с 2-монофосфатом и т.п., которые будут функционировать после усвоения домашним животным как напоминающая витамин С активность. Они могут быть в любой форме, такой как жидкость, полутвердое вещество, твердое вещество и стойкая к нагреванию форма. Альфа-липоевая кислота может вводиться в диету в виде альфа-липоевой кислоты или производной липоевой кислоты, как указано в патенте США № 5621117, в виде ее рацемических смесей, солей, сложных эфиров или амидов. L-карнитин можно вводить в корм, а также можно использовать различные производные карнитина, такие как соли, например, гидрохлорид, фумарат и сукцинаты, а также ацетилированный карнитин и т.п.

Применяемые в корме количества, которые все выражают в виде % масс. (в пересчете на сухое вещество) от массы корма, рассчитывают как активное вещество как таковое, которое определяют в виде свободного вещества. Максимальные применяемые количества не должны быть токсичными.

Может использоваться, по крайней мере, приблизительно 100 м.д. или, по крайней мере, приблизительно 150 м.д. витамина E. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения может использоваться диапазон от приблизительно 500 до приблизительно 1000 м.д. Хотя это не является необходимым, в общем случае максимальное количество не превышает приблизительно 2000 м.д. или приблизительно 1500 м.д.

Что касается витамина С, то используют приблизительно 50 м.д., предпочтительно, приблизительно 75 м.д. и, еще более предпочтительно, приблизительно 100 м.д. Может использоваться нетоксичное максимальное количество.

Количество липоевой кислоты может изменяться, по крайней мере, от приблизительно 25 м.д., предпочтительно, по крайней мере, от приблизительно 50 м.д., более предпочтительно, по крайней мере, от приблизительно 100 м.д. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения диапазон количества липоевой кислоты, которое может назначаться собакам, составляет от приблизительно 150 м.д. до приблизительно 4500 м.д. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения диапазон количества липоевой кислоты, которое может назначаться кошкам, составляет от приблизительно 65 м.д. до приблизительно 2600 м.д. Максимальные количества могут меняться от приблизительно от 100 м.д. до 600 м.д. или равняться количеству, которое остается нетоксичным для домашнего животного. В различных вариантах осуществления настоящего изобретения диапазон составляет от приблизительно от 100 м.д. до приблизительно 200 м.д.

Для L-карнитина пригодный для собак минимум составляет приблизительно 50 м.д., предпочтительно, приблизительно 200 м.д., более предпочтительно, приблизительно 300 м.д. Для кошек можно использовать несколько более высокие минимумы L-карнитина, такие как приблизительно 100 м.д., 200 м.д. и 500 м.д. Можно использовать нетоксичное максимальное количество, например, меньше чем приблизительно 5000 м.д. Для собак, можно использовать меньшие количества, например, меньше чем приблизительно 5000 м.д. Для собак предпочтительный диапазон составляет от приблизительно 200 м.д. до приблизительно 400 м.д. Для кошек предпочтительный диапазон составляет от приблизительно 400 м.д. до приблизительно 600 м.д.

Бета-каротин может использоваться в количестве 1-15 м.д.

Селен может использоваться в количестве от приблизительно 0,1 и вплоть до приблизительно 5 м.д.

Лютеин: можно использовать, по крайней мере, приблизительно 5 м.д.

Токотриенолы: можно использовать, по крайней мере, приблизительно 25 м.д.

Кофермент Q10: можно использовать, по крайней мере, приблизительно 25 м.д.

S-аденозилметионин: можно использовать, по крайней мере, приблизительно 50 м.д.

Таурин: можно использовать, по крайней мере, приблизительно 1000 м.д.

Изофлавоны сои: можно использовать, по крайней мере, приблизительно 25 м.д.

N-ацетилцистеин: можно использовать, по крайней мере, приблизительно 50 м.д.

Глютатион: можно использовать, по крайней мере, приблизительно 50 м.д.

Гинкго билоба: можно использовать, по крайней мере, приблизительно 50 м.д.

Ниже приводятся исходные ингредиенты, которые обладают высокой величиной ORAC (способностью поглощать радикалы кислорода): Когда их добавляют в корм в количестве 1% (общее замещение ингредиента с низкой величиной ORAC, такого как зерно, составляет 5%), они повышают величину ORAC всего корма и повышают величину ORAC в плазме животных, которые потребляли корм, содержащий указанные компоненты. Предпочтительно, любой ингредиент с величиной ORAC>25 единиц массы/моль эквивалентов Trolox на грамм сухого вещества может использоваться, если его добавляют в количестве 1% в комбинации с четырьмя другими 1%-ными ингредиентами для получения в общей сложности 5%-ного содержания в корме.

Жмых шпината, жмых помидоров, мякоть лимона, жмых винограда, гранулы моркови, брокколи, зеленый чай, гинкго билоба и клейковина зерна.

Пример 1

Семнадцать взрослых собак гончей породы в возрасте 2-4 года (контрольная группа n=8, обогащенная антиоксидантом группа n=9) произвольно распределяют в контрольную группу и в группу с обогащенным антиоксидантом кормом. Контрольная диета содержит 59 м.д. витамина E и <32 м.д. витамина С. Исследуемая диета содержит 900 м.д. витамина E и 121 м.д. витамина С, 260 м.д. L-карнитина и 135 м.д. альфа-липоевой кислоты. Спустя приблизительно 1 месяц после начала назначения диеты, первым заданием на решение проблемной ситуации, которое задают собакам, было задание на распознавание образов, являющееся тестом на внимание в пространстве (Milgram, N.W., Adams, B. Callahan, H., Head, E., Mackey, B., Thirlwell, C. & Cotman, C.W. (1999): Landmark discrimination learning in the dog. Learning & Memory. 6:54-61).

Обучение распознаванию объектив требует, чтобы субъекты выбрали конкретный предмет на основании близости к объекту. Тем не менее, начальное обучение основано на способности собаки обучаться распознаванию объектов. Авторы настоящего изобретения ранее обнаружили, что влияние возраста на обучение распознаванию объектов зависит от трудности с задания.

Взрослые собаки, получавшие обогащенную диету, сделали меньше ошибок, чем взрослые собаки контрольной группы, при изучении теста ориентира 0 (среднее значение для контрольной группы =31,1, среднее значение группы с обогащенной диетой =15,1). Далее взрослые собаки переходили к испытаниям на ориентире 1 и 2, при этом ориентир перемещался от положительной лунки. Взрослые собаки, содержавшиеся на обогащенной диете, выучили ориентиры 0-2 с меньшим количеством ошибок, по сравнению с собаками контрольной группы (среднее количество ошибок в ориентирах 0+1+2 (контрольная группа)=132,9; среднее количество ошибок в ориентирах 0+1+2 (собаки на обогащенной диете)=87,1).

Пример 2

Для данного исследования из случайных источников отбирают 30 взрослых собак. Перед началом испытаний возраст собак составляет, по крайней мере, 10 месяцев, они не беременны, не находятся в состоянии лактации и имеют приемлемый вес. Животных случайным образом делят на 5 групп для опробования корма, при этом в каждой группе оказывается 3 самца и 3 самки.

В течение 2-недельного периода, предшествующего проведению испытаний диеты, всем собакам дают контрольный корм (добавлено 0 м.д. DL-альфа-липоевой кислоты), который удовлетворяет всем рекомендациям или превышает все рекомендации, касающиеся питательных веществ, которые предложены Американской ассоциацией государственных инспекторов по качеству кормов для животных (AAFCO 2000) (таблица 1). В период, предшествующий испытанию диеты, собак произвольно отбирают в 5 групп для проведения опробования одной из диет со следующим содержанием DL-альфа-липоевой кислоты (в пересчете на сухое вещество): 0 м.д., 150 м.д., 1500 м.д., 3000 м.д., 4500 м.д. Во все диеты, как контрольную, так и содержащую альфа-липоевую кислоту, добавляют витамин E, содержание которого составляет 600-1000 Международных Единиц, а витамин С добавляют на уровне 100-200 м.д.

Испытуемый корм был единственным источником питательных веществ, за исключением воды. Пресную воду дают в необходимом количестве. После того, как собаки были отобраны, определяют исходные значения массы тела, а дозу еды рассчитывают для каждого пса на основании ожидаемой энергии поддержания (ME) корма. Начальные расчеты доз основаны на требованиях к энергии поддержания (MER) для собаки, которую модифицируют с помощью коэффициента с тем, чтобы учесть нормальную активность, вычисляемую по следующей формуле:

MER (ккал/день) = 1,6×RER (требование к энергии покоя),

где

RER (ккал/день) = 70×масса тела (кг)/0,75.

Собак еженедельно взвешивают и дозы пищи при необходимости, регулируют таким образом, чтобы обеспечить достаточно пищи и поддержать оптимальную массу тела. Оптимальную массу тела устанавливают соответствующей величине 3 по 5-бальной шкале. Если собака, после регулирования дозы, не в состоянии поддерживать массу тела в пределах 10% начальной массы тела, то такую собаку выводят из эксперимента. Регистрируют все измерения массы тела, а также количество поглощенной пищи.

Образцы измельчают и 0,100±0,001 г образца дважды экстрагируют в 5,0 мл фосфатного буфера (10 мМ Na₂HPO₄, 2 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК), 0,9% NaCl, рН 7,4). 250 мкл экстракта помещают в стеклянную пробирку для центрифуги емкостью 5 мл, снабженную колпачком. Добавляют 15 мкл раствора ЭДТК (100 мМ ЭДТК, рН доводят до 7,8 с помощью приблизительно 1 М раствора NaOH) и добавляют 50 масс. единиц/л свежеприготовленного дитиоэритрита (DTE). Растворы перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 минут. Затем добавляют 10 масс. единиц/л 1 M раствора H₃PO₄ и 2,0 мл диэтилового эфира. Пробирки закрывают колпачками, перемешивают и центрифугируют с ускорением 1500×g в течение 3 мин при комнатной температуре. Слой эфира переносят в отдельную стеклянную пробирку для центрифуги емкостью 5 мл, а водный слой еще дважды экстрагируют по 1,5 мл эфира. Все экстракции, полученные из одного образца, объединяют. Затем экстракты высушивают в азотном испарителе на водяной бане при комнатной температуре. После этого образцы закрывают колпачками и оставляют на ночь в замороженном виде.

Затем высушенные экстракты оттаивают и восстанавливают с помощью 70 масс. единиц/л раствора SDS/ЭДТК (0,11% додецилсульфат натрия (SDS), 15 мМ ЭДТК, 0,9% NaCl) и 5 мкл свежеприготовленного 1-мМ DTE. Затем в каждую пробирку добавляют по 50 мкл свежеприготовленного NaBH₄. Пробирки перемешивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 10 минут. Через 10 мин образцы замораживают при -70°C. Прежде чем оттаивать растворы, добавляют 20 мкл 2 М раствора HCl. После того как растворы оттают, добавляют 800 мкл 100 мМ NH₄HCO₃. Растворы перемешивают и добавляют 5 масс. единиц/л 100 мМ раствора монобромбимана в ацетонитриле (mBBr). Затем растворы инкубируют в темноте в течение 90 мин при комнатной температуре.

После инкубирования излишек mBBr и производного DTE удаляют из образца экстракцией с помощью 1,5 мл дихлорметана. Водный слой помещают в колонку ВЭЖХ. Липоевую кислоту отделяют, используя подвижную фазу, содержащую 30% ацетонитрила и 1% уксусной кислоты, рН которой доводят до 3,95 с помощью приблизительно 2 М раствора NH₄OH; подвижную фазу подают насосом со скоростью подачи 1,0 мл/мин при изократическом элюировании в течение 15 мин для инъекции каждого образца. В процессе указанных приготовлений принимают, что плотность экструдированного корма составляет 1 г/мл.

В асептических условиях берут образцы крови для проведения полного анализа крови и биохимического анализа крови за 2 недели до начала испытаний, а затем вновь через 0, 28, 56, 84, 112, 140 и 168 дней в процессе проведения испытаний. Кроме того, 15 мл цельной крови отбирают для выделения лимфоцитов в дни 0, 28 и 84 применения диеты.

Образец цельной крови с добавленным гепарином помещают в коническую пробирку Accuspin для центрифугирования емкостью 50 мл (Sigma Chemical) и добавляют равный объем забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS). Образцы без остановки центрифугируют при ускорении 700×g в течение 30 мин. Слой моноцитов отделяют, переносят в коническую пробирку для центрифугирования емкостью 15 мл, вновь суспендируют в 1-3 мл PBS и подвергают центрифугированию в тех же самых условиях, что и ранее (первая промывка). Вторую промывку проводят так же, как и первую. Наконец, клетки собирают и суспендируют в хлорной кислоте (10% масс./об.), а затем замораживают при -70°С до начала проведения анализа.

Образцы переносят из морозильной камеры с температурой -70°C в охладитель с твердой углекислотой. Пробирки центрифугируют со скоростью 12000 об/мин в течение 5 минут в охлаждаемой центрифуге. Аликвоту супернатанта для проведения анализа глютатиона (GSH) переносят в коническую пробирку для тестирования.

Функционализацию растворимых в кислоте экстрактов проводят по методу Рида и сотрудников (Fariss et al.) в модификации Джонса (Jones и другие).

Если кратко, то экстракт в количестве 150 мкл и внешние стандарты добавляют в пробирку Эппендорфа емкостью 1,5 мл, а затем добавляют 20 мкл гамма-глютамил-глютамата в качестве внутреннего стандарта и 50 мкл IAA и перемешивают. Доводят рН раствора приблизительно до 10 (розовый цвет) с помощью рабочего раствора KOH - KHCO₃. Растворы инкубируют в течение 1 час при комнатной температуре в темноте. Добавляют реактив Зангера в том же количестве, что и полный объем, и полученный раствор оставляют инкубироваться на ночь (20 час) в темноте при комнатной температуре.

После инкубирования раствор центрифугируют со скоростью 12000 об/мин в течение 5 минут, супернатант переносят в другую пробирку Эппендорфа емкостью 1,5 мл. 200 мкл супернатанта добавляют в янтарную виалу, которая вмещает 300 мкл, закрывают верх с помощью кримпера для проведения ВЭЖХ анализа.

Растворители и условия разделения те же, что описанные (Fariss, Jones). Уровни GSH и GSSG определяют количественно относительно аутентичных стандартов. Для оценки эффективности функционализации в качестве внутреннего стандарта используют гамма-глютамил-глютамат.

Сравнение значений для клинической биохимии, гематологии и массы тела относительно базовых показателей анализируют парным t-тестом на SAS для Windows с уровнем значимости P<0,05. Средние значения величин в каждой измеренной временной точке отделяют, применяя однонаправленный дисперсионный анализ с уровнем значимости P<0,05. Разницу отношения GSH:GSSG между днем 84 и базовым значением между группами анализируют с помощью SAS для Windows, проводя однонаправленный дисперсионный анализ с уровнем значимости P <0,05.

Результаты

Значения для концентраций липоевой кислоты (м.д.) в корме, которые определяют при проведении 7 последовательных анализов (дни 0, 28, 56, 84, 112, 140, 168), находятся в диапазоне ожидаемой чувствительности анализа и определяемых параметров, с которыми обычно имеют дело устройства, находящиеся в распоряжении авторов изобретения (таблица 2).

Данные о потреблении пищи ничем не примечательны. Большинство животных во всех группах, в среднем, поглощает больше пищи через 6 месяцев, чем в начале исследования. Данные массы тела остаются обычными, за исключением того, что некоторая потеря веса наблюдается первоначально в группе, получавшей 4500 м.д., но указанное изменение полностью восстанавливается по прошествии 6 месяцев. Указанная незначительная потеря веса не сказалась на оценке упитанности собак, выраженной в баллах.

При проведении повседневных обследований не отмечено каких-либо связанных с пищей аномалий или не отмечена токсичность DL-альфа-липоевой кислоты. Все животные в изучаемой популяции оставались нормальными во время всего хода изучения. Отдельные случаи рвоты в процессе исследования наблюдалась у нескольких животных; тем не менее, не наблюдалась тенденция, которая позволила бы прийти к заключению, что рвота может быть связана с липоевой кислотой. Одно животное в группе, получавшей наибольшую дозу, на 21-й день было отстранено от дальнейшего изучения вследствие потери веса и лейкоцитоза. Лейкоцитоз для данного животного не был устранен к концу проведения исследований, и, как полагают, он связан с протеканием какого-либо другого заболевания.

Когда биохимические показатели сыворотки, полученные в дни 28, 56, 84, 112, 140 и 168, сравнивают с начальными значениями для той же самой группы собак, то отмечают несколько статистических отличий однако, ни одно из них не признано биологически значимым, поскольку указанные значения находятся в пределах или близки к нормальным значениям лабораторных показателей и в течение ряда месяцев отмечались устойчивые тренды. Сравнения между контрольными группами и другими подвергавшимися воздействию группами в каждом интервале времени также выявляют несколько статистических различий, однако ни одно из них не признано биологически значимым, поскольку указанные значения находятся в пределах или близки к нормальным значениям лабораторных показателей и никакие тренды не наблюдались.

Когда данные для общего анализа крови, полученные в дни 28, 56, 84, 112, 140 и 168, сравнивают с начальными значениями для той же самой группы собак, то отмечают несколько статистических отличий однако, ни одно из них не признано биологически значимым, поскольку указанные значения находятся в пределах или близки к нормальным значениям лабораторных показателей и никакие тренды не наблюдались. Сравнения между контрольными группами и другими подвергавшимися воздействию группами в каждом интервале времени выявляют несколько статистических различий однако, ни одно из не признано биологически значимым, поскольку указанные значения находятся в пределах или близки к нормальным значениям лабораторных показателей и никакие тренды не отмечены.

Отношение GSH:GSSG

Изменение в отношении GSH:GSSG по прошествии 84 дней применения диеты выявляет значительный общий эффект диеты (P=0,024) во всех получавших добавку группах, имеющих увеличение в отношении (таблица 3). Дисперсионный анализ выявляет значимую разницу, по сравнению с базовой пищей, для самых малых и самых больших доз добавок, однако наибольшее численное увеличение отмечено для самого низкого уровня добавки. Другими словами, изменения в отношении GSH:GSSG для самых больших и самых малых доз добавок значительно отличались от изменений, наблюдавшихся за тот же самый интервал времени для базовой еды. Отношения для 4 точек невозможно было определить в день 84, поскольку никакого GSSG не было обнаружено ни в одном из указанных образцов (1 контрольная группа, 3 группы подвергавшиеся обработке). Таким образом, для групп, получавших добавку, данные могли бы дать еще более высокие отношения GSH:GSSG, если бы анализ обладал достаточной чувствительностью, чтобы обнаружить низкие уровни GSSG на день 84.

Таблица 2
Уровень добавкиСтандартный процесс (м.д.)	Среднее значение	Стандартноеотклонение	Целевое значение
0	24	17	Не обнаружено
150	151	13	101
1500	1471	113	98
3000	2869	250	96
4500	4176	642	93

Таблица 3
Изменение среднего значения GSH:GSSG со дня 0 до дня 84 у собак, потреблявших DL-липоевую кислоту в экструдированном корме
Добавка	Различие в отношении GSH:GSSG - со дня 0 до дня 84Сравнение добавки с базовой едой	N	Значение P
0 м.д.	-9,2±26	5*	Не установлено
150 м.д.	70±20	6	0,003
1500 м.д.	24±7	6	0,16
3000 м.д.	10±4	4*	0,46
4500 м.д.	50±36	4*	0,03
* Для 1 собаки в контрольной группе и группе с уровнем добавки 4500 м.д. GSSG не обнаружен в день 84, в то время как в группе с уровнем добавки 3000 м.д. GSSG не обнаружен для 2 собак в день 84.

Дальнейшие наблюдения, касающиеся альфа-липоевой кислоты, подтверждают ее пригодность для использования. Длительное включение альфа-липоевой кислоты в диету безопасно и эффективно. Она улучшает величину отношения восстановленного глютатиона (GSH) к окисленному глютатиону (GSSG). Длительное введение альфа-липоевой кислоты можно осуществлять в течение минимум от одного, двух, трех, четырех, пяти или шести месяцев и вплоть до одного, двух, трех, четырех, пяти лет или даже больше, включая весь срок жизни животного. Альфа-липоевая кислота работает в диете, не требуя специальной защиты, такой как инкапсулирование, и не обязательно должна присутствовать в диете в виде стандартной лекарственной формы, используемой в фармацевтических препаратах, например, в виде таблетки, пилюли, капсулы и т.п. Липоевую кислоту добавляют в диету минимум в количестве 25, 50, 75 или 100 м.д. Наивысший диапазон находится чуть ниже ее токсичности, и приблизительно составляет 400, 300 или 200 м.д. в диете. В общем случае, дозировка не превышает приблизительно 6 или 7 мг/кг массы тела животного в день, как правило, не превышает приблизительно 5 мг/кг массы тела животного в день. Альфа-липоевая кислота улучшает защитные антиоксидантные свойства, а также улучшает устойчивость животного к окислительному повреждению. Все эти значения приведены с учетом соответствующих количеств другого присутствующего антиоксиданта, такого как витамин E и витамин С. Таким образом, показано, что действие альфа-липоевой кислоты превосходит действие витамина С и/или витамина E.

Пример 3

Экспериментальные условия

Двадцать собак кормят в течение 30 дней. Десяти собакам дают пищу с контролируемым уровнем AAFCO, а 10 другим собакам дают пищу с контролируемым уровнем AAFCO, содержащую 150 м.д. альфа-липоевой кислоты. По истечении 30 дней у каждой собаки в трубки Paxgene отбирают образцы цельной крови.

Полные РНК выделяют из образцов цельной крови, используя набор реагентов PAXgene для выделения РНК. Все измерения проводят с 2 биочипами Affymetrix для собак. Для проведения статистического анализа все измерения нормализуют, используя показатель монотонного анализа. t-Тест дисперсионного анализа проводят для генов, которые по-разному экспрессируются для контрольного корма и испытуемого корма (по крайней мере, 20%-ное изменение в экспрессии с уровнем значимости p<0,05).

По-разному экспрессирующиеся гены анализируют с использованием программного обеспечения GeneGo для анализа метаболического пути. Собаки, которым давали липоевую кислоту в течение 30 дней, дают опосредованную интерфероном противовирусную ответную реакцию. Гены, усиливающиеся за счет потребления собаками липоевой кислоты в течение 30 дней, которые вовлекаются в опосредованную интерфероном противовирусную ответную реакцию, приведены в таблице 4.

Таблица 4
	Взрослые собаки, которым давали липоевую кислоту в течение 30 дней
Символ гена	Белок	Название белка	Кратность увеличения	Значение Р
CREBBP	CBP человека	CREB-связывающий белок	1,2	0,04
EIF2AIK2	E2AK2 человека	Активированный индукцией интерферона белок двухцепочечной РНК	1,4	0,04
IFNAR2	INAR2 человека	альфа-интерферон/предшественник бета-цепи бета-рецептора	1,3	0,01
IFNGR2	INGR2 человека	интерферон/предшественник бета-цепи гамма-рецептора	1,2	0,03
IRF9	IRF9 человека	фактор регулирования интерферона 9	1,3	0,2
JAK2	JAK2 человека	тирозин-протеин киназа JAK2	1,4	0,01
RNASEL	KN5A человека	2-5A-зависимая рибонуклеаза	1,5	0,04

На основании исследований, проведенных на собаках, которым давали липоевую кислоту в течение 30 дней, авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что на поверхности клетки количество рецепторов интерферона альфа/бета и интерферона гамма увеличилось, создавая предпосылки для усиления всего противовирусного защитного механизма, опосредованного интерфероном. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что JAK2, ключевой активатор STAT1 и STAT2, усилился. Интерфероновый регуляторный фактор 9 (IFR9) усилился. 1FR9, STAT1 и STAT2 образуют комплекс (ISFG3), который смещается к ядру и усиливает активированные интерфероном противови