Выделенное антитело против ip-10, иммуноконъюгат и биспецифическая молекула на его основе, их композиции, способ лечения (варианты), кодирующая молекула нуклеиновой кислоты, соответствующий экспрессионный вектор, клетка-хозяин и гибридома

Выделенное антитело против ip-10, иммуноконъюгат и биспецифическая молекула на его основе, их композиции, способ лечения (варианты), кодирующая молекула нуклеиновой кислоты, соответствующий экспрессионный вектор, клетка-хозяин и гибридома

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области биотехнологии, фарамакологии и медицины, конкретно к технологии получения выделенных антител, в особенности человеческих антител, которые связываются с IP-10 с высокой аффинностью, на основе которых предложены фармацевтические композиции и способы лечения различных воспалительных и аутоиммунных заболеваний.

Уровень техники

Индуцируемый интерфероном γ белок 10 (IP-10) (известный также как СХСИО) представляет собой хемокин молекулярной массы 10 кД, который исходно идентифицирован на основе экспрессии гена IP-10 в клетках, обработанных интерфероном γ (ИФН-γ) (см. статью Luster A.D. et al., (1985), Nature, 315:672-676). IP-10 демонстрирует гомологию с белками, обладающими хемотаксической активностью, такими как тромбоцитарный фактор 4 и β-тромбоглобулин, и с белками, обладающими митогенной активностью, такими как пептид III активации соединительной ткани (см. статью Luster A.D. et al., (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:2868-2871). IP-10 секретируется множеством клеток, включая эндотелиальные клетки, моноциты, фибробласты и кератиноциты, в ответ на ИФН-γ (см. статью Luster A.D. and Ravetch J.V., (1987), J. Exp. Med., 166:1084-1097). Показано также, что IP-10 присутствует в кожных макрофагах и эндотелиальных клетках при реакциях гиперчувствительности замедленного типа (DTH) в коже человека (см. статью KaplanG. et al., (1987), J. Exp. Med., 166:1098-1108). Несмотря на то, что он исходно идентифицирован на основе того, что индуцируется ИФН-α, IP-10 может также индуцироваться ИФН-α, например, в дендритных клетках (см. статью Padovan E. et al., (2002), J. Leukoc. Biol., 71:669-676). Экспрессия IP-10 может быть также индуцирована в клетках центральной нервной системы, таких как астроциты и микроглия, такими стимулами, как ИФН-γ, вирусы и липополисахариды (см. статьи Vanguri R. and Farber J.M., (1994), J. Immunol., 152:1411-1418; Ren L.Q. et al., (1998), Brain Res. Mol. Brain Res., 59:256-263). Обзор иммунологии IP-10 представлен в статье Neville L.F. et al., (1997), Cytokine Growth Factor Rev., 8:207-219.

Рецептор для IP-10 идентифицирован как CXCR3, седьмой трансмембранный рецептор (см. статью Loetscher М. et al., (1996), J. Exp. Med., 184:963-969). Показано, что CXCR3 экспрессируется на активированных Т-лимфоцитах, но не на покоящихся Т-лимфоцитах, или В-лимфоцитах, моноцитах либо гранулоцитах (Loetscher М. et al., см. выше). Показано, что повышающая регуляция экспрессии CXCR3 происходит на NK (натуральных киллерных) клетках при стимуляции TGF-β 1 (фактором роста Т-клеток β 1) (см. статью Inngjerdingen М. et al., (2001), Blood, 97:367-375).

Идентифицированы также два других лиганда для CXCR3: MIG (Loetscher М. et al., см. выше) и ГАС (см. статью Cole K.Е. et al., (1998), J. Exp. Med., 187:2009-2021).

Показано, что связывание IP-10 с CXCR3 опосредует мобилизацию кальция и хемотаксис в активированных Т-клетках (Loetscher M. et al., см. выше). Хемотаксис и мобилизация внутриклеточного кальция индуцируются также связыванием IP-10 с CXCR3 на активированных NK-клетках (см. статью Maghazachi A.A. et al., (1997), FASEB J., 11:765-774). В тимусе IP-10, как показано, является хемоаттрактантом для Т-клеток TCRαβ+ CD8+, Т-клеток TCRγδ+ и клеток NK-типа (см. статью Romagnani P. et al., (2001), Blood, 97:601-607).

IP-10 или его рецептор CXCR3 идентифицированы при ряде различных воспалительных и аутоиммунных состояний, включая рассеянный склероз (см., например, статью Sorensen T.L et al., (1999), J. Clin. Invest., 103:807-815), ревматоидный артрит (см., например, статью Patel D.D. et al., (2001), Clin. Immunol., 98:39-45), язвенный колит (см., например, статью Uguccioni M. et al., (1999), Am. J. Pathol., 155:331-336), гепатит (см., например, статью Narumi S. et al., (1997), J. Immunol., 158:5536-5544), повреждение спинного мозга (см., например, статьи McTigue D.M. et al., (1998), J. Neurosci. Res., 53:368-376; Gonzalez et al., 2003, Exp. Neurol., 184:456-463), системную красную волчанку (см., например, статью Narumi S. et al., (2000), Cytokine 12:1561-1565), отторжение трансплантата (см., например, Zhang Z. et al., (2002), J. Immunol., 168:3205-3212), синдром Шегрена (см., например, статью Ogawa N. et al., (2002), Arthritis Rheum., 46:2730-2741). Следовательно, необходимы терапевтические агенты, которые ингибируют данную активность, в особенности, агенты, которые пригодны для применения у человека.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение представляет выделенные моноклональные антитела, в частности, человеческие моноклональные антитела, которые связываются с IP-10 и которые проявляют множество желательных свойств. Данные свойства включают высокую аффинность связывания с человеческим IP-10, а также перекрестную реактивность с IP-10 макаки-резуса, но при отсутствии существенной перекрестной реактивности либо с человеческим MIG, человеческим ITAC, либо мышиным IP-10. Кроме того, антитела ингибируют связывание IP-10 с его рецептором, CXCR3, ингибируют ток кальция, индуцированный IP-10 в клетках, экспрессирующих рецептор, и ингибируют индуцируемую IP-10 миграцию клеток (хемотаксис). К тому же показано, что антитела, соответствующие изобретению, связываются с IP-10 в областях головного мозга человека, у которого диагностирован рассеянный склероз.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения человеческий IP-10 включает полипептид, имеющий последовательность аминокислот, как представлено в SEQ ID NO:121 [Genbank Регистрационный No. NP_001556];

CXCR3 включает полипептид, имеющий последовательность аминокислот, как представлено в SEQ ID NO:122 [Genbank Регистрационный No. NP_001495]; IP-10 макаки-резуса включает полипептид, имеющий последовательность аминокислот, как представлено в SEQ ID NO:123 [Genbank Регистрационный No. AAK95955]; мышиный IP-10 включает полипептид, имеющий последовательность аминокислот, как представлено в SEQ ID NO:124 [Genbank Регистрационный No. NPJ367249]; человеческий MIG включает полипептид, имеющий последовательность аминокислот, как представлено в SEQ ID NO:125 [Genbank Регистрационный No. NP_002407] и/или ITAC человека включает полипептид, имеющий последовательность аминокислот, как представлено в SEQ ID NO:126 [Genbank Регистрационный No. NP_005400].

В одном варианте осуществления изобретение представляет выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, причем антитело специфически связывается с IP-10 и включает вариабельную область тяжелой цепи, которая представляет собой продукт или происходит из гена зародышевой линии V_H человека, выбранного из группы, состоящей из гена V_H 3-33 человека, гена V_H 3-30.3 человека, гена V_H 5-51 человека и гена V_H 4-61 человека.

В другом варианте осуществления изобретение представляет выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, причем антитело специфически связывается с IP-10 и включает вариабельную область легкой цепи, которая представляет собой продукт или происходит из гена зародышевой линии V_k человека, выбранной из группы, состоящей из гена V_k A27 человека, гена V_k L15 человека, гена V_k L6 человека и гена V_k L18 человека.

В еще одном варианте осуществления изобретение представляет выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, причем антитело специфически связывается с IP-10 и включает:

(а) вариабельную область тяжелой цепи, которая представляет собой продукт или происходит из гена зародышевой линии V_H человека, выбранного из группы, состоящей из гена V_H 3-33 человека, гена V_H 3-30.3 человека, гена V_H 5-51 человека и гена V_H 4-61 человека и (b) вариабельную область легкой цепи, которая представляет собой продукт или происходит из гена V_k зародышевой линии человека, выбранного из группы, состоящей из гена V_k A27 человека, гена V_k L15 человека, гена V_k L6 человека и гена V_k L18 человека.

В одном варианте осуществления изобретение представляет выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, причем антитело включает:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, которая представляет собой продукт или происходит из гена V_H 3-33 человека и

(b) вариабельную область легкой цепи, которая представляет собой продукт или происходит из гена V_k человека, выбранную из группы, состоящей из гена V_k A27 человека, гена V_k L15 человека и гена V_k L6 человека, причем антитело специфически связывается с IP-10.

В другом варианте осуществления изобретение представляет выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, причем антитело включает:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, которая представляет собой продукт или происходит из гена V_H 3-30.3 человека и

(b) вариабельную область легкой цепи, которая представляет собой продукт или выделена из гена V_k L6 человека;

причем антитело специфически связывается с IP-10.

В еще одном варианте осуществления изобретение представляет выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, причем антитело включает:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, которая представляет собой продукт или происходит из гена V_H 5-51 человека и

(b) вариабельную область легкой цепи, которая представляет собой продукт или происходит из гена V_k L18 человека;

причем антитело специфически связывается с IP-10.

В еще одном варианте осуществления изобретение представляет выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, причем антитело включает:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, которая представляет собой продукт или происходит из гена V_k 4-61 человека и

(b) вариабельную область легкой цепи, которая представляет собой продукт или происходит из гена V_k A27 человека;

причем антитело специфически связывается с IP-10.

В другом аспекте изобретение представляет выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, включающую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR 1, CDR2 и CDR3 и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2 и CDR3, причем:

(a) последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR3 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот SEQ ID NONO:24-34 и их консервативных модификаций,

(b) последовательность вариабельной области легкой цепи CDR3 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот SEQ ID NONO:73-83 и их консервативных модификаций,

(с) антитело специфически связывается с IP-10 и

(d) антитело проявляет по меньшей мере одно из следующих свойств:

(i) антитело ингибирует связывание IP-10 с CXCR3;

(ii) антитело ингибирует индуцированный IP-10 ток кальция;

(iii) антитело ингибирует индуцированную IP-10 миграцию клеток;

(iv) антитело перекрестно реагирует с IP-10 макаки-резуса;

(v) антитело не является перекрестно реактивным с мышиным IP-10;

(vi) антитело не является перекрестно реактивным с человеческим MIG;

(vii) антитело не является перекрестно реактивным с человеческим ITAC.

В предпочтительном варианте осуществления последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR2 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот SEQ ID NONO:13-23 и их консервативных модификаций, и последовательность вариабельной области легкой цепи CDR2 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот SEQ ID NONO:62-72 и их консервативных модификаций.

В другом предпочтительном варианте осуществления последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR1 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот SEQ ID NONO:1-12 и их консервативных модификаций, и последовательность вариабельной области легкой цепи CDR1 включает последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из последовательностей аминокислот SEQ ID NONO:51-61 и их консервативных модификаций.

Антитело может представлять собой, например, человеческое антитело, гуманизированное антитело или химерное антитело.

В другом аспекте изобретение представляет выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающую часть, включающую вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем:

(a) вариабельная область тяжелой цепи включает последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80% гомологична последовательности аминокислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NONO:35-46,

(b) вариабельная область легкой цепи включает последовательность аминокислот, которая по меньшей мере на 80% гомологична последовательности аминокислот, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NONO:84-94,

(c) антитело специфически связывается с IP-10 и

(d) антитело проявляет по меньшей мере одно следующих функциональных свойств:

(i) антитело ингибирует связывание IP-10 с CXCR3;

(ii) антитело ингибирует индуцируемый IP-10 ток кальция;

(iii) антитело ингибирует индуцируемую IP-10 миграцию клеток;

(iv) антитело перекрестно реагирует с IP-10 макаки-резуса;

(v) антитело не является перекрестно реактивным с мышиным IP-10;

(vi) антитело не является перекрестно реактивным с человеческим MIG;

(vii) антитело не является перекрестно реактивным с человеческим ITAC.

Антитело может представлять собой, например, человеческое антитело, гуманизированное антитело или химерное антитело.

В предпочтительных вариантах осуществления изобретения выделенное моноклональное антитело или его антигенсвязывающая часть включает:

(a) CDR1 вариабельной области тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NONO:1-12,

(b) CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NONO:13-23,

(c) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, включающий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NONO:24-34,

(d) CDR1 вариабельной области легкой цепи, включающий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NONO:51-61,

(e) CDR2 вариабельной области легкой цепи, включающий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NONO:62-72, и

(f) CDR3 вариабельной области легкой цепи, включающий последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NONO:73-83, причем антитело специфически связывает IP-10.

В других предпочтительных вариантах осуществления изобретение представляет выделенное моноклональное антитело, или его антигенсвязывающую часть, включающую:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, включающую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NONO:35-46, и

(b) вариабельную область легкой цепи, включающую последовательность аминокислот, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NONO:84-94, причем антитело специфически связывает IP-10.

В другом аспекте изобретения представлены антитела или их антигенсвязывающие части, которые конкурируют за связывание с IP-10 с любыми из вышеупомянутых антител.

Антитела, соответствующие изобретению, могут быть, например, антителами полной длины, например изотипа IgG1 или IgG4. Альтернативно антитела могут представлять собой фрагменты антител, такие как фрагменты Fab или Fab'2, либо одноцепочечные антитела.

В изобретении представлен также иммуноконъюгат, включающий антитело, соответствующее изобретению, или его антигенсвязывающую часть, связанные с терапевтическим агентом, таким как цитотоксин или радиоактивный изотоп.

В изобретении представлена также биспецифическая молекула, включающая антитело или его антигенсвязывающую часть, соответствующие изобретению, связанные со второй функциональной группой, обладающей другой специфичностью связывания по сравнению с указанным антителом или его антигенсвязывающей частью.

Представлены также композиции, включающие антитело или его антигенсвязывающую часть либо иммуноконъюгат или биспецифическую молекулу, соответствующие изобретению, и фармацевтически приемлемый носитель.

Кроме того, изобретение охватывает молекулы нуклеиновых кислот, кодирующие антитела или их антигенсвязывающие части, соответствующие изобретению, а также экспрессионные векторы, включающие данные нуклеиновые кислоты, и клетки-хозяева, содержащие такие экспрессионные векторы.

Более того, изобретение представляет трансгенную мышь, несущую трансгены тяжелой и легкой цепи человеческого иммуноглобулина, причем мышь экспрессирует антитело, соответствующее изобретению, а также гибридомы, продуцирующие антитело, соответствующее изобретению.

В другом аспекте изобретение представляет способ ингибирования воспалительногоилиаутоиммунногоответа,опосредуемогоактивированными Т-клетками или NK-клетками, заключающийся в контактировании Т-клеток или NK-клеток с антителом или его антигенсвязывающей частью, соответствующими изобретению, таким образом, что происходит ингибирование воспалительного или аутоиммунного ответа.

В еще одном аспекте изобретения представлен способ лечения воспалительного или аутоиммунного заболевания у нуждающегося в лечении субъекта, заключающийся во введении субъекту антитела или его антигенсвязывающей части, соответствующих изобретению, так что осуществляется лечение воспалительного или аутоиммунного заболевания у субъекта.

Заболеванием может быть, например, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, воспалительная болезнь кишки (например, язвенный колит, болезнь Крона), системная красная волчанка, диабет типа 1, воспалительные кожные нарушения (например, псориаз, плоский лишай), аутоиммунное заболевание щитовидной железы (например, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото), синдром Шегрена, легочное воспаление (например, астма, хроническая обструктивная болезнь легких, саркоидоз легких, аутоиммунныйальвеолит), отторжение трансплантата, повреждение спинного мозга, повреждение головного мозга (например, инсульт), нейродегенеративные заболевания (например, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона), гингивит, воспаление, вызванное генотерапией, болезни ангиогенеза, воспалительная болезнь почек (например, IgA нефропатия, мембранопролиферативный гломерулонефрит, быстро прогрессирующий гломерулонефрит) и атеросклероз.

В еще одном аспекте изобретение представляет способ лечения вирусной или бактериальной инфекции, влекущие за собой нежелательную активность IP-10 у нуждающегося в лечении субъекта, заключающийся во введении субъекту антитела или его антигенсвязывающей части, соответствующих изобретению, так что осуществляется лечение вирусной или бактериальной инфекции у субъекта. Например, антитела могут быть использованы для лечения вирусного менингита, вирусного энцефалита и бактериального менингита.

Вирусная инфекция, которую предусматривают лечить способом, соответствующим изобретению, может быть опосредована, например, вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусом гепатита С (HCV), вирусом простого герпеса типа I (HSV-1) или вирусом тяжелого острого респираторного синдрома (SARS).

В изобретении представлены также способы получения антител против IP-10 "второго поколения" на основе последовательностей антител против IP-10, предложенных в данном контексте.

Например, изобретение представляет способ получения антитела против IP-10, предусматривающий;

(a) получение: (i) последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела, включающей последовательность CDR1, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NONO:1-12, последовательность CDR2, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NONO:13-23 и/или последовательность CDR3, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NONO:24-34, и (ii) последовательности вариабельной области легкой цепи антитела, включающей последовательность CDR1, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NONO:51-61, последовательность CDR2, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NONO:62-72 и/или последовательность CDR3, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NONO:73-83;

(b) изменение по меньшей мере одного остатка аминокислоты в последовательности вариабельной области тяжелой цепи антитела и/или последовательности вариабельной области легкой цепи антитела с целью создания по меньшей мере одной измененной последовательности антитела, и

(c) экспрессию измененной последовательности антитела в виде белка.

Другие признаки и преимущества данного изобретения будут очевидны из последующего детального описания и примеров, которые не следует истолковывать, как ограничивающие. Содержание всех ссылок, описаний Genbank, патентов и опубликованных патентных заявок, цитируемых во всем материале данной заявки, специально включено в данном контексте в виде ссылки.

Краткое описание чертежей

На Фигуре 1 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:99) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:35) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 1D4. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:1), CDR2 (SEQ ID NO:13) и CDR3 (SEQ ID NO:24) и указаны отклонения от зародышевой линии V, D и J.

На Фигуре 2 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:110) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:84) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 1D4. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:51), CDR2 (SEQ ID NO:62) и CDR3 (SEQ ID NO:73) и указаны отклонения от зародышевой линии V и J.

На Фигуре 3 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:100) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:36) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 1Е1. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:2), CDR2 (SEQ ID NO:14) и CDR3 (SEQ ID NO:25) и указаны отклонения от зародышевой линии V и J.

На Фигуре 4 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:111) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:85) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 1Е1. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:52), CDR2 (SEQ ID NO:63) и CDR3 (SEQ ID NO:74) и указаны отклонения от зародышевой линии V и J.

На Фигуре 5 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:101) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:37) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 2G1. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:3), CDR2 (SEQ ID NO:15) и CDR3 (SEQ ID NO:26) и указаны отклонения от зародышевой линии V и J.

На Фигуре 6 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:112) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:86) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 2G1. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:53), CDR2 (SEQ ID NO:64) и CDR3 (SEQ ID NO:75) и указаны отклонения от зародышевой линии V и J.

На Фигуре 7 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:102) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:38) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 3С4. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:4), CDR2 (SEQ ID NO:16) и CDR3 (SEQ ID NO:27) и указаны отклонения от зародышевой линии V, D и J.

На Фигуре 8 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:113) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:87) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 3С4. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:54), CDR2 (SEQ ID NO:65) и CDR3 (SEQ ID NO:76) и указаны отклонения от зародышевой линии V и J.

На Фигуре 9 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:103) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:39) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 6А5. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:5), CDR2 (SEQ ID NO:17) и CDR3 (SEQ ID NO:28) и указаны отклонения от зародышевой линии V, D и J.

На Фигуре 10 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:114) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:88) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 6А5. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:55), CDR2 (SEQ ID NO:66) и CDR3 (SEQ ID NO:77) и указаны отклонения от зародышевой линии V и J.

На Фигуре 11 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:104) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:40) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 6А8. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:6), CDR2 (SEQ ID NO:18) и CDR3 (SEQ ID NO:29) и указаны отклонения от зародышевой линии V и J.

На Фигуре 12 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:115) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:89) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 6А8. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:56), CDR2 (SEQ ID NO:67) и CDR3 (SEQ ID NO:78) и указаны отклонения от зародышевой линии V и J.

На Фигуре 13 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:105) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:41) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 6В10. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:7), CDR2 (SEQ ID NO:19) и CDR3 (SEQ ID NO:30) и указаны отклонения от зародышевой линии V, D и J.

На Фигуре 14 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:116) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:90) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 6В10. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:57), CDR2 (SEQ ID NO:68) и CDR3 (SEQ ID NO:79) и указаны отклонения от зародышевой линии V и J.

На Фигуре 15 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:106) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:42) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 7С10. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:8), CDR2 (SEQ ID NO:20) и CDR3 (SEQ ID NO:31) и указаны отклонения от зародышевой линии V, D и J.

На Фигуре 16 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:117) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:91) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 7С10. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:58), CDR2 (SEQ ID NO:69) и CDR3 (SEQ ID NO:80) и указаны отклонения от зародышевой линии V и J.

На Фигуре 17 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:107) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:43) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 8F6. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:9), CDR2 (SEQ ID NO:21) и CDR3 (SEQ ID NO:32) и указаны отклонения от зародышевой линии V, D и J.

На Фигуре 18 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:118) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:92) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 8F6. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:59), CDR2 (SEQ ID NO:70) и CDR3 (SEQ ID NO:81) и указаны отклонения от зародышевой линии V и J.

На Фигуре 19 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:108) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:44) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 10А12. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:10), CDR2 (SEQ ID NO:22) и CDR3 (SEQ ID NO:33) и указаны отклонения от зародышевой линии V и J. Альтернативно остаток аминокислоты 32 в CDR1 может быть мутирован из цистеина в серии (SEQ ID NO:11), приводя к последовательности V_H SEQ ID NO:45.

На Фигуре 20 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:119) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:93) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 10А12.

Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:60), CDR2 (SEQ ID NO:71) и CDR3 (SEQ ID NO:82) и указаны отклонения от зародышевой линии V и J.

На Фигуре 21 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:109) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:46) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 13С4. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:12), CDR2 (SEQ ID NO:23) и CDR3 (SEQ ID NO:34) и указаны отклонения от зародышевой линии V, D и J.

На Фигуре 22 представлена нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:120) и последовательность аминокислот (SEQ ID NO:94) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 13С4. Схематически изображены участки CDR1 (SEQ ID NO:61), CDR2 (SEQ ID NO:72) и CDR3 (SEQ ID NO:83) и указаны отклонения от зародышевой линии V и J.

На Фигуре 23 представлены результаты элайнмента последовательности аминокислот вариабельной области тяжелой цепи 1D4, 1Е1, 2G1, 6А5, 6А8, 7С10 и 10А12 с последовательностью аминокислот человеческой зародышевой линии V_H 3-33 (SEQ ID NO:47).

На Фигуре 24 представлены результаты элайнмента последовательности аминокислот вариабельной области тяжелой цепи 6В10 и 8F6 с последовательностью аминокислот человеческой зародышевой линии V_H 3-30.3 (SEQ ID NO:48).

На Фигуре 25 представлены результаты элайнмента последовательности аминокислот вариабельной области тяжелой цепи 3С4 с последовательностью аминокислот человеческой зародышевой линии V_H 5-51 (SEQ ID NO:49).

На Фигуре 26 представлены результаты элайнмента последовательности аминокислот вариабельной области тяжелой цепи 13С4 с последовательностью аминокислот человеческой зародышевой линии V_H 4-61 (SEQ ID NO:50).

На Фигуре 27 представлены результаты элайнмента последовательности аминокислот вариабельной области легкой цепи 1D4, 2G1, 6А5, 6А8, 10А12 и 13С4 с последовательностью аминокислот человеческой зародышевой линии V_k A27 (SEQ ID NO:95).

На Фигуре 28 представлены результаты элайнмента последовательности аминокислот вариабельной области легкой цепи 1Е1, 6В10 и 8F6 с последовательностью аминокислот человеческой зародышевой линии V_k L6 (SEQ ID NO:96).

На Фигуре 29 представлены результаты элайнмента последовательности аминокислот вариабельной области легкой цепи 3С4 с последовательностью аминокислот человеческой зародышевой линии V_k L18 (SEQ ID NO:97).

На Фигуре 30 представлены результаты элайнмента последовательности аминокислот вариабельной области легкой цепи 7С 10 с последовательностью аминокислот человеческой зародышевой линии V_k L15 (SEQ ID NO:98). Осуществление изобретения

Настоящее изобретение относится к выделенным моноклональным антителам, в особенности человеческим моноклональным антителам, которые специфически связываются с IP-10 и которые ингибируют функциональные свойства IP-10.

В ряде вариантов осуществления антитела, соответствующие изобретению, выделены из определенных последовательностей тяжелых и легких цепей зародышевой линии и/или включают определенные структурные признаки, такие как участки CDR, содержащие определенные последовательности аминокислот.

Изобретение представляет выделенные антитела, способы получения данных антител, иммуноконъюгаты и биспецифические молекулы, включающие данные антитела, и фармацевтические композиции, содержащие антитела, иммуноконъюгаты или биспецифические молекулы, соответствующие изобретению.

Изобретение относится также к способам применения антител для подавления воспалительных или аутоиммунных ответов, например, при лечении различных воспалительных или аутоиммунных заболеваний, а также к способам лечения вирусных инфекций, включающих нежелательную активность IP-10.

Чтобы можно было легче понять настоящее изобретение, сначала определяют некоторые термины. Дополнительные определения приведены во всем тексте детального описания.

Термины "белок 10, индуцируемый интерфероном γ", "IP-10" и "CXCL10" используются взаимозаменяемо и включают варианты, изоформы и видовые гомологи человеческого IP-10. Соответственно, человеческие антитела, соответствующие изобретению, в некоторых случаях могут быть перекрестно реактивными с IP-10 видов, отличных от человека. В других случаях антитела могут быть полностью специфическими в отношении человеческого IP-10 и могут не проявлять видовую или другие типы перекрестной реактивности.

Полная последовательность аминокислот человеческого IP-10 имеет регистрационный номер Genbank NP_001556 (SEQ ID NO:121). Полная последовательность аминокислот IP-10 макаки-резуса имеет регистрационный номер Genbank AAK95955 (SEQ ID NO:123). Полная последовательность аминокислот мышиного IP-10 имеет регистрационный номер Genbank NP_067249 (SEQ ID NO:124).

Термин "CXCR3" относится к рецептору для IP-10 (CXCL10). Полная последовательность аминокислот человеческого CXCR3 имеет регистрационный номер Genbank NP_001495 (SEQ ID NO:122).

Термин "MIG" относится к лиганду CXCR3, известному также как монокин, индуцируемый γ-интерфероном, который отличен от IP-10. Полная последовательность аминокислот человеческого MIG имеет регистрационный номер Genbank NP_002407 (SEQ ID NO:125).

Термин "ITAC" относится к лиганду CXCR3, также известному как индуцируемый интерфероном хемоаттрактант Т-клеток α, который отличен от IP-10. Полная последовательность аминокислот человеческого ITAC имеет регистрационный номер Genbank NP_005400 (SEQ ID NO:126).

Термин "иммунный ответ" относится кдействию, например, лимфоцитов, антиген-презентирующих клеток, фагоцитарных клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, продуцируемых вышеуказанными клетками или печенью (включая антитела, цитокины и комплемент), которое приводит в результате к избирательному повреждению, разрушению или выведению из организма человека инвазивных патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогеном, раковых клеток или, в случаях аутоиммунитета или патологического воспаления, нормальных человеческих клеток или тканей.

Термин "путь сигнальной трансдукции" относится к биохимической связи между множеством молекул сигнальной трансдукции, которые играют роль в передаче сигнала из одной части клетки в другую часть клетки. Как используют в данном контексте, выражение "клеточный поверхностный рецептор" включает, например, молекулы и комплексы молекул, способные к приему сигнала и передаче данного сигнала через плазматическую мембрану клетки. Примером "клеточного поверхностного рецептора", соответствующего настоящему изобретению, является рецептор CXCR3, с которым связывается молекула IP-10.

Термин "антитело", как ссылаются в данном контексте, включает целые антитела и любой антигенсвязывающий фрагмент (т.е., "антигенсвязывающую часть") или их отдельные цепи. Термин "антитело" относится к гликопротеину, содержащему по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, связанные друг с другом дисульфидными связями, или его антигенсвязывающей части. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (сокращенно обозначают в данном контексте как V_H) и константной области тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, C_H1, C_H2 и C_H3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (сокращенно обозначают в данном контексте как V_L) и константной области легкой цепи. Константная область легкой цепи состоит из одного домена C_L. Области V_H и V_L могут быть далее подразделены на участки гипервариабельности, называемые участками, определяющими комплементарность (CDR), между которыми расположены участки, которые являются более консервативными, называемые скелетными (остовными) областями (FR). Каждая из V_H и V_k состоит из трех CDR и четырех FR, построенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелой и легкой цепей содержат связывающий домен, который взаимодействует с антигеном. Константные области антител могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) системы классического комплемента.

Термин "антигенсвязывающая часть" антитела (или просто "часть антитела"), как используют в данном контексте, относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, IP-10). Показано, что антигенсвязывающая функция антитела может осуществляться фрагментами антитела полной длины. Примеры связывающих фрагментов, охватываемых термином "антигенсвязывающая часть" антитела, включают (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H, C_L и C_H1; (ii) фрагмент Р(ab')₂, двухвалентный фрагмент, содержащий два фрагмента Fab, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и СН1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов V_k и V_H одного плеча антитела, (v) фрагмент dAb (см. статью Ward et al., (1989), Nature, 341:544-546), который состоит из домена V_H, и (vi) выделенный участок определяющий комплементарность (CDR). Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, V_L и V_H, кодируются отдельными генами, они могут быть связаны посредством рекомбинантных методов синтетическим линкером, который дает возможность получить их в виде одной белковой цепи, в которой области V_k и V_H спарены с образованием одновалентных молекул (известных как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, статьи Bird et al., (1988), Science, 242:423-426; и Huston et al., (1988), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883). Предусматривается также, что термин "антигенсвязывающая часть" антитела охватывает данные одноцепочечные антитела. Данные фрагменты антитела получают при использовании принятых методик, известных специалистам в области техники, и фрагменты подвергают скринингу на применение таким же образом, как интактные антитела.

Термин "выделенное антитело", как используют в данном контексте, пред