Способы улучшения направленного воздействия на cd138-экспрессирующие опухолевые клетки и агенты для их осуществления

Способы улучшения направленного воздействия на cd138-экспрессирующие опухолевые клетки и агенты для их осуществления

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет предварительной заявки на патент США № 61/016614, поданной 26 декабря 2007 г., предварительной заявки на патент США № 61/087466, поданной 8 августа 2008 г., и предварительной заявки на патент США № 61/087590, поданной 8 августа 2008 г., которые полностью включены в настоящее описание изобретения в качестве ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к применению иммуноконъюгатов против антигена CD138 и композиций, включающих указанные иммуноконъюгаты, для уменьшения адгезии стромальных клеток к CD138-экспрессирующим клеткам-мишеням и, таким образом, для более эффективного лечения заболеваний, обусловленных СD138-экспрессирующими клетками.

Уровень техники

CD138, действующий в качестве рецептора внеклеточного матрикса, сверхэкспрессирован на клетках множественной миеломы (ММ) и, как было установлено, влияет на развитие и/или пролиферацию клеток ММ. CD138 экспрессирован также на клетках рака яичника, рака почки, рака желчного пузыря, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака легкого, рака ободочной кишки, лимфомы Ходжкина и неходжкинской лимфомы, хронического лимфолейкоза (CLL) и многих других.

Публикации и другие материалы, включая патенты, использованные в настоящем описании изобретения для иллюстрации изобретения и, в частности, для более подробного описания возможностей осуществления настоящего изобретения, включены в качестве ссылки. Публикации, приведенные в нижеследующем описании изобретения только с указанием автора и даты публикации, перечислены в алфавитном порядке по имени автора в прилагаемом библиографическом разделе.

Тассон и др. (2004) сообщили в превосходном связывании антитела В-В4 IgG1 мыши с антигеном CD138, экспрессированным на поверхности клеток ММ. Тассон также отметил высокую цитотоксическую активность иммуноконъюгата В-В4-DM1, включающего митанзиноид DM1 в качестве эффекторной молекулы, против клеток множественной миеломы (см. также публикацию патента США 20070183971).

Тассон также показал, что конъюгат антитела В-В4 эффективно действует даже в микросреде костного мозга, которая вызывает устойчивость клеток множественной миеломы (ММ) ко многим лекарственным средствам, вводимым субъектам, страдающим множественной миеломой, таким как, например, дексаметазон. Иммуноконъюгаты, созданные Тассоном, были способны эффективно разрушать опухолевые клетки ММ в среде костномозговой стромы.

Несмотря на то, что Тассон и др. создали эффективный метод лечения множественной миеломы и композицию, которая может быть использована при осуществлении такого метода лечения, в данной области существует большая потребность в новых методах и лекарственных средствах.

Существует потребность в усовершенствованных методах лечения с использованием иммуноконъюгатов на основе антитела В-В4. Кроме того, существует потребность в эффективных методах лечения с использованием иммуноконъюгатов на основе антитела В-В4, обладающих одним или несколькими преимуществами. Такие иммуноконъюгаты предпочтительно характеризуются лучшим связыванием с антигеном, лучшим лизисом опухолевых клеток, включая, в частности, CD138-экспрессирующие опухолевые клетки и А-клетки, или более гомогенным связыванием с мишенью и, в частности, способностью более эффективно лечить заболевания, ассоциированные с CD138-экспрессирующими клетками.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение относится к способу уменьшения адгезии стромальных клеток к CD138-экспрессирующим опухолевым клеткам в опухолевых клетках нуждающегося субъекта, который включает:

введение в указанные опухолевые клетки иммуноконъюгата против CD138-экспрессирующих опухолевых клеток, в частности, иммуноконъюгата, содержащего расщепляемый линкер и эффектор, рассмотренные в настоящем описании изобретения, в количестве, эффективном для уменьшения адгезии стромальных клеток к CD138-экспрессирующим опухолевым клеткам, и необязательно введение в указанные опухолевые клетки дополнительного цитотоксического средства в количестве, обеспечивающем ингибирование, задержку и/или предотвращение роста опухолевых клеток.

Адгезия может быть уменьшена по меньшей мере примерно на 10%, примерно на 20%, примерно на 30%, примерно на 40%, примерно на 50%, примерно на 60%, примерно на 70%, примерно на 80% или больше, и/или может быть достигнуто ослабление лекарственной устойчивости, опосредованной указанной адгезией, включая опосредованную адгезией лекарственную устойчивость к дополнительному цитотоксическому средству (которое не является одним из вышеуказанных иммуноконъюгатов), вводимому в количестве, обеспечивающем ингибирование, задержку и/или предотвращение роста опухолевых клеток. Иммуноконъюгат и один или несколько цитотоксических средств можно вводить последовательно, при этом цитотоксическое средство можно вводить после введения иммуноконъюгата или одновременно с ним.

Иммуноконъюгат по настоящему изобретению, в частности, включает:

(а) генетически созданное антитело против клетки-мишени и

(b) эффекторную молекулу,

при этом указанный иммуноконъюгат гомогенно и направленно воздействует на CD138-экспрессирующие клетки-мишени.

Генетически созданное антитело против клетки-мишени по настоящему изобретению может

(i) по существу состоять из антигенсвязывающей области (ABR) против CD138 антитела, отличного от человеческого, или

(ii) включать антигенсвязывающую область (ABR) против CD138, выделенную из антитела, отличного от человеческого, и

дополнительную область антитела, по меньшей мере часть которой выделена из человеческого антитела.

Антигенсвязывающая область (ABR) может включать:

(а) CDR3 вариабельной области тяжелой цепи, включающую аминокислотные остатки 99-111 SEQ ID NO:1, и

(b) CDR3 вариабельной области легкой цепи, включающую аминокислотные остатки 89-97 SEQ ID NO:2.

Антигенсвязывающая область (ABR) может далее включать:

(а) CDR1 и CDR2 вариабельной области тяжелой цепи, включающие соответственно аминокислотные остатки 31-35 и 51-68 SEQ ID NO:1, и/или

(b) CDR1 и CDR2 вариабельной области легкой цепи, включающие соответственно аминокислотные остатки 24-34 и 50-56 SEQ ID NO:2.

Дополнительная область антитела может включать:

(а) аминокислотные остатки 123-448 SEQ ID NO:1 и/или

(b) аминокислотные остатки 108-214 SEQ ID NO:2

и их мутанты, которые

(i) сохраняют или снижают антителозависимую цитотоксичность и/или комплементзависимую цитотоксичность генетически созданного антитела против клетки-мишени и/или

(ii) стабилизируют генетически созданное антитело против клетки-мишени.

Эффекторная молекула может быть присоединена к указанному генетически созданному антителу против клетки-мишени с помощью линкера. Линкер может включать дисульфидную связь. Эффекторная молекула (например, DM4) может создавать стерическое препятствие между антителом против клетки-мишени и эффекторной молекулой. Эффекторная молекула может быть по меньшей мере одним майтанзиноидом (например, DM1, DM3 или DM4), таксаном, СС1065 или их аналогом.

Иммуноконъюгат может связываться с CD138 с изменчивостью направленного воздействия менее 150%, 140%, 130%, 120%, 110%, 100%, 90%, 80%, 70%, 60% или 50%.

Настоящее изобретение относится также к иммуноконъюгату, который включает:

агент против антигена CD138, включающий:

выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO:1. Константная область указанной тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части может быть константной областью изотипа IgG4.

Настоящее изобретение относится также к способу лечения множественной миеломы у субъекта, который включает:

получение одного или нескольких иммуноконъюгатов по настоящему изобретению и

введение субъекту указанного иммуноконъюгата в количестве, обеспечивающем эффективное лечение множественной миеломы.

Агент против клетки-мишени иммуноконъюгата может включать последовательность легкой цепи, которая по меньшей мере примерно на 70% идентична SEQ ID NO:2. Агент против клетки-мишени иммуноконъюгата может также включать последовательность тяжелой цепи, которая по меньшей мере примерно на 70% идентична SEQ ID NO:1.

Настоящее изобретение относится также к способу доставки лекарственного средства иммуноконъюгатом, который включает:

получение одного или нескольких иммуноконъюгатов по настоящему изобретению и

введение указанного иммуноконъюгата в терапевтически эффективном количестве, при этом указанный изотип IgG4 ослабляет антителозависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (АDCC), комплементзависимую цитотоксичность и/или Fс-опосредованное направленное воздействие на FcR печени.

Настоящее изобретение относится также к способу ингибирования, задержки и/или предотвращения роста опухолевых клеток в культуре клеток, который включает:

введение в указанную культуру клеток одного или нескольких иммуноконъюгатов по настоящему изобретению в эффективном количестве, ингибирующем, задерживающем и/или предотвращающем рост опухолевых клеток. Эффективное количество может индуцировать гибель клеток или остановку непрерывного клеточного цикла в CD138-экспрессирующих опухолевых клетках и необязательно А-клетках, не экспрессирующих антиген CD138, в частности, стромальных клетках опухоли. Клетки в указанной культуре клеток могут быть получены у субъекта, страдающего раком, и после введения эффективного количества иммуноконъюгата клетки указанной культуры клеток могут быть вновь имплантированы субъекту, страдающему раком.

Настоящее изобретение относится также к способу ингибирования, задержки и/или предотвращения роста опухоли, содержащей CD138-экспрессирующие опухолевые клетки, и/или распространения опухолевых клеток такой опухоли у нуждающегося субъекта, который включает:

введение указанному субъекту по меньшей мере одного или нескольких иммуноконъюгатов по настоящему изобретению в количестве, ингибирующем или задерживающем рост опухоли и/или распространение опухолевых клеток,

при этом указанный иммуноконъюгат ингибирует, задерживает или предотвращает рост и/или распространение указанных опухолевых клеток.

Эффекторная молекула указанного иммуноконъюгата может быть токсином, цитотоксическим ферментом, низкомолекулярным цитотоксическим лекарственным средством, порообразующим агентом, модификатором биологической реакции, ферментом, активирующим пролекарство, антителом, цитокином или радиоактивным изотопом.

Иммуноконъюгаты по настоящему изобретению можно вводить в виде однократной дозы от 5 мг/м² до около 300 мг/м² необязательно с интервалом в несколько часов, дней, недель или, комбинируя указанные интервалы.

Схемы введения многократных доз с интервалами в несколько часов, дней и недель, также входят в объем настоящего изобретения и, в частности, включают введение с интервалами в 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 часа, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 дней, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 недель.

Настоящее изобретение относится также к способу ингибирования, задержки и/или предотвращения роста опухоли и/или распространения злокачественных опухолевых клеток у нуждающегося субъекта, который включает:

(а) введение указанному субъекту одного или нескольких цитотоксических средств и/или проведение лучевой терапии в дозе, необходимой для уменьшения опухолевой массы; и

(b) введение указанному субъекту по меньшей мере одного из иммуноконъюгатов по настоящему изобретению в количестве, ингибирующем, задерживающем или предотвращающем рост опухоли и/или распространение опухолевых клеток,

при этом указанный иммуноконъюгат ингибирует, задерживает или предотвращает рост и/или распространение опухолевых клеток, включающих CD138-экспрессирующие клетки.

Цитотоксическое средство по любому из вариантов осуществления настоящего изобретения может быть, в частности, мефаланом, винкристином, доксорубицином, дексаметазоном, циклофосфамидом, этопозидом, цитарабином, цисплатином, талидомидом, преднизоном, талидомидом, бортезомибом, леналидомидом, сорафенибом, ромидепсином или их комбиациями, либо может быть создано на основе антитела.

Настоящее изобретение относится также к способу лечения субъекта, страдающего заболеванием, на которое может оказать благоприятное воздействие подавление миеломных клеток, который включает:

(а) получение по меньшей мере одного из иммуноконъюгатов по настоящему изобретению и

(b) введение указанного иммуноконъюгата субъекту для селективного уменьшения выживания или роста миеломных клеток у указанного субъекта.

Настоящее изобретение относится также к фармацевтической композиции, включающей любые иммуноконъюгаты по настоящему изобретению для ингибирования, задержки и/или предотвращения роста опухоли и/или распространения опухолевых клеток, и один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей.

Фармацевтическая композиция может включать цитотоксические средства, рассмотренные в настоящем описании изобретения.

Настоящее изобретение относится также к набору, в комплект которого входят отдельные контейнеры с фармацевтическими композициями, предназначенными для использования в комбинации для ингибирования, задержки и/или предотвращения роста опухолей и/или распространения опухолевых клеток, при этом в одном контейнере находится эффективное количество вышеуказанной фармацевтической композиции и в другом контейнере находится вторая фармацевтическая композиция, включающая эффективное количество средства, предпочтительно цитотоксического средства, предназначенного для ингибирования, задержки и/или предотвращения роста опухоли и/или распространения опухолевых клеток, и один или несколько фармацевтически приемлемых наполнителей.

Настоящее изобретение относится также к способу ингибирования, задержки и/или предотвращения роста опухоли, включающей CD138-экспрессирующие опухолевые клетки, и/или распространения опухолевых клеток такой опухоли у нуждающегося субъекта, который включает:

(а) получение иммуноконъюгата, включающего

генетически созданное антитело против CD138, присоединнное к эффекторной молекуле при помощи расщепляемого линкера, причем указанная эффекторная молекула имеет стерическое препятствие, и

(b) введение указанному субъекту иммуноконъюгата (а) в количестве, обеспечивающем ингибирование, задержку и/или предотвращение роста опухоли и/или распространение опухолевых клеток, при этом указанный иммуноконъюгат (а) обладает ингибирующей рост опухоли активностью, которая превышает активность иммуноконъюгата без стерического препятствия, примерно на 10%, примерно на 20%, перимерно на 30%, примерно на 40% или больше.

Ингибирующая рост опухоли активность иммуноконъюгата без стерического препятствия, включающего нерасщепляемый линкер, может превышать ингибирующую рост опухоли активность иммуноконъюгата без стерического препятствия, включающего расщепляемый линкер, по меньшей мере примерно на 5%, по меньшей мере примерно на 10%, примерно до 15%.

Указанное генетически созданное антитело против CD138 может по существу состоять из антигенсвязывающей области против CD138 антитела, отличного от человеческого, или может включать антигенсвязывающую область против CD138 антитела, отличного от человеческого, и дополнительную область антитела, по меньшей мере часть которой выделена из человеческого антитела.

Указанный расщепляемый линкер может включать дисульфидную связь. Эффекторная молекула может быть DM4. Иммуноконъюгат может быть частью фармацевтической композиции и может быть введен субъекту по меньшей мере в виде одной дозы в количестве от около 5 мг/м² до около 300 мг/м².

Настоящее изобретение относится к иммуноконъюгату, предназначенному для использования в качестве лекарственного средства, который включает:

(а) генетически созданное антитело против клетки-мишени,

(i) состоящее в основном из антигенсвязывающей области против CD138 антитела, отличного от человеческого; или

(ii) включающее антигенсвязывающую область против CD138, выделенную из антитела, отличного от человеческого, и

дополнительную область антитела, по меньшей мере часть которой выделена из человеческого антитела, и

(b) эффекторную молекулу,

при этом указанный иммуноконъюгат гомогенно связывается с CD138.

Настоящее изобретение относится к другому иммуноконъюгату, предназначенному для использования в качестве лекарственного средства, который включает:

агент против антигена CD138, включающий

выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO:1.

В частности, одним объектом настоящего изобретения является иммуноконъюгат по настоящему изобретению, предназначенный для лечения множественной миеломы. Указанный иммуноконъюгат может быть использован для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения множественной миеломы.

Настоящее изобретение относится также к иммуноконъюгату, используемому для доставки лекарственного средства субъекту, в частности, для ослабления антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности, комплементзависимой цитотоксичности и/или Fc-опосредованного направленного воздействия на FcR печени, при этом указанный иммуноконъюгат включает агент против CD138, включающий выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO:1, и константную область тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части, которая является константной областью изотипа IgG4.

Настоящее изобретение относится также к опухолевым клеткам, используемым при лечении рака у субъекта, которые обрабатывают в культуре клеток иммуноконъюгатом, включающим:

(а) генетически созданное антитело против клетки-мишени,

(i) состоящее в основном из антигенсвязывающей области против CD138 антитела, отличного от человеческого; или

(ii) включающее антигенсвязывающую область против CD138, выделенную из антитела, отличного от человеческого; и

дополнительную область антитела, по меньшей мере часть которой выделена из человеческого антитела, и

(b) эффекторную молекулу,

при этом указанный иммуноконъюгат гомогенно связывается с CD138.

Настоящее изобретение относится также к опухолевым клеткам, используемым при лечении рака у субъекта, которые обрабатывают в культуре клеток иммуноконъюгатом, включающем:

агент против гена CD138, который включает

выделенный полипептид, содежащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO:1.

Настоящее изобретение относится к иммуноконъюгату, предназначенному для ингибирования, задержки и/или предотвращения роста опухоли, содержащей CD138-экспрессирующие опухолевые клетки, и/или распространения опухолевых клеток такой опухоли у субъекта, который включает:

(а) генетически созданное антитело против клетки-мишени,

(i) состоящее в основном из антигенсвязывающей области против CD138 антитела, отличного от человеческого; или

(ii) включающее антигенсвязывающую область против CD138, выделенную из антитела, отличного от человеческого; и

дополнительную область антитела, по меньшей мере часть которой выделена из человеческого антитела, и

(b) эффекторную молекулу,

при этом указанный иммуноконъюгат гомогенно связывается с CD138.

Альтернативно настоящее изобретение относится к иммуноконъюгату, предназначенному для ингибирования, задержки и/или предотвращения роста опухоли, включающей CD138-экспрессирующие опухолевые клетки, и/или распространения опухолевых клеток такой опухоли у субъекта, который включает:

агент против антигена CD138, включающий

выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части, которая по меньшей мере на 70% идентичная SEQ ID NO:1.

Настоящее изобретение далее относится к лекарственному средству, включающему иммуноконъюгат и одно или несколько противораковых средств в виде комбинированного препарата, предназначенного для одновременного, раздельного или последовательного введения при лечении опухоли, содержащей CD138-экспрессирующие клетки, в котором иммуноконъюгат включает:

(а) генетически созданное антитело против клетки-мишени,

(i) состоящее в основном из антигенсвязывающей области против CD138 антитела, отличного от человеческого; или

(ii) включающее антигенсвязывающую область против CD138, выделенную из антитела, отличного от человеческого; и

дополнительную область антитела, по меньшей мере часть которой выделена из человеческого антитела, и

(b) эффекторную молекулу,

при этом указанный иммуноконъюгат гомогенно связывается с CD138 и одно или несколько противораковых средств могут уменьшать опухолевую массу.

Альтернативно настоящее изобретение относится к лекарственному средству, включающему иммуноконъюгат и одно или несколько противораковых средств в виде комбинированного препарата, предназначенного для одновременного, раздельного или последовательного введения при лечении опухоли, содержащей CD138-экспрессирующие клетки, в котором иммуноконъюгат включает:

агент против антигена CD138, включающий

выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO:1,

и одно или несколько противораковых средств могут уменьшать опухолевую массу.

В соответствии с другим объектом изобретения комбинированный препарат, рассмотренный в двух вышеуказанных абзацах, вводят субъекту, прошедшему курс лучевой терапии.

Альтернативным объектом настоящего изобретения является использование иммуноконъюгата для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения у субъекта опухоли, содержащей CD138-экспрессирующие клетки, в котором иммуноконъюгат включает:

(а) генетически созданное антитело против клетки-мишени,

(i) состоящее в основном из антигенсвязывающей области против CD138 антитела, отличного от человеческого; или

(ii) включающее антигенсвязывающую область против CD138, выделенную из антитела, отличного от человеческого; и

дополнительную область антитела, по меньшей мере часть которой выделена из человеческого антитела, и

(b) эффекторную молекулу,

при этом указанный иммуноконъюгат гомогенно связывается с CD138 и лекарственное средство вводят субъекту, прошедшему курс лучевой терапии, для уменьшения опухолевой массы.

Настоящее изобретение далее относится к использованию иммуноконъюгата для приготовления лекарственного средства для лечения у субъекта опухоли, содержащей CD138-экспрессирующие клетки, в котором иммуноконъюгат включает:

агент против антигена CD138, включающий

выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO:1,

и лекарственное средство предназначено для введения субъекту, прошедшему курс лучевой терапии, для уменьшения опухолевой массы.

Рассмотренное в вышеуказанных абзацах лекарственное средство может ингибировать, задерживать и/или предотвращать рост опухоли и/или распространение злокачественных опухолевых клеток у субъекта.

Настоящее изобретение далее относится к иммуноконъюгату, предназначенному для подавления выживания миеломных клеток у субъекта, который включает:

(а) генетически созданное антитело против клетки-мишени,

(i) состоящее в основном из антигенсвязывающей области против CD138 антитела, отличного от человеческого; или

(ii) включающее антигенсвязывающую область против CD138, выделенную из антитела, отличного от человеческого; и

дополнительную область антитела, по меньшей мере часть которой выделена из человеческого антитела, и

(b) эффекторную молекулу,

при этом указанный иммуноконъюгат гомогенно связывается с CD138.

Настоящее изобретение далее относится к иммуноконъюгату, предназначенному для подавления выживания миеломных клеток у субъекта, который включает:

агент против антигена CD138, включающий

выделенный полипептид, содержащий аминокислотную последовательность тяжелой цепи иммуноглобулина или ее части, которая по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO:1.

Рассмотренный в вышеуказанных двух абзацах иммуноконъюгат, в частности, способен селективно уменьшать выживание или рост указанных миеломных клеток у субъекта.

Настоящее изобретение далее относится к иммуноконъюгату, предназначенному для ингибирования, задержки и/или предотвращения роста опухоли, включающей CD138-экспрессирующие опухолевые клетки, и распространения опухолевых клеток такой опухоли у субъекта, при этом иммуноконъюгат включает генетически созданное антитело против CD138, присоединенное к эффекторной молекуле при помощи расщепляемого линкера, и эффекторная молекула имеет стерическое препятствие.

Рассмотренный в вышеуказанном абзаце иммуноконъюгат, в частности, способен проявлять ингибирующую рост опухоли активность, которая превышает активность иммуноконъюгата без стерического препятствия, примерно на 10%, примерно на 20%, перимерно на 30%, примерно на 40% или больше.

Настоящее изобретение относится также к агенту против CD138, который предназначен для использования в способе уменьшения адгезии стромальных клеток к CD138-экспрессирующим опухолевым клеткам в опухолевых клетках субъекта.

Настоящее изобретение далее относится к лекарственному средству, включающему агент против CD138 и другой агент, такой как иммуноконъюгат против клетки-мишени или цитостатическое средство, в виде комбинированного препарата для одновременного (совместного введения), раздельного или последовательного введения в способе уменьшения адгезии стромальных клеток к CD138-экспрессирующим опухолевым клеткам в опухолевых клетках субъекта.

Рассмотренный в вышеуказанном абзаце комбинированный препарат, в частности, способен ингибировать, задерживать и/или предотвращать рост опухолевых клеток у субъекта.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 схематически изображено антитело nBT062 с присоединенными эффекторными молекулами.

На Фиг.2 показана химическая структура ВТ062.

На Фиг.3 показано превращение ансамитоцина Р-3 в майтанзинол (стереохимия опущена для более простого представления).

На Фиг.4 показана типичная схема синтеза DM4.

На Фиг.5 схематически изображена конъюгация антитела (nBT062 с DM4).

На Фиг.6 показан анализ связывания nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1, nBT062-SMCC-DМ1 и антитела nBT062 с клетками ОРМ-2. Клетки подвергали воздействию антитела nBT062 и конъюгатов в разных концентрациях и измеряли среднее значение флуоресценции при помощи анализа методом FACS.

На Фиг.7А-7D показана цитотоксичность in vitro конъюгатов nBT062-DMx в отношении клеток MOLP-8 (CD138⁺) и BJAB (CD138^-). Клетки культивировали на плоскодонных планшетах и инкубировали с иммуноконъюгатами в указанных концентрациях в течение 5 дней. Реагент WST добавляли в течение дополнительных 3 часов для оценки жизнеспособности клеток. На Фиг.7D показан анализ цитотоксической активности иммуноконъюгата nBT062-SPDB-DM4 в присутствии или отсутствии блокирующего антитела (1 мкМ nBT062).

На Фиг.8 показаны объемы опухолей у отдельных мышей, которым вводили (А) PBS, (В) антитело nBT062, (С) свободный DM4 или (D) конъюгат huC242-DM4 ненаправленного действия, образовавшихся в течение определенного периода времени (дни) после инокуляции опухолевыми клетками MOLP-8.

На Фиг.9 показаны объемы опухолей у отдельных мышей, которым вводили (А) PBS, (B) nBT062-SPDB-DM4, (C) B-B4-SPP-DM1 или (D) nBT062-SPP-DM1, образовавшихся в течение определенного периода времени (дни) после инокуляции опухолевыми клетками MOLP-8.

На Фиг.10 показан средний объем опухоли (± стандартное отклонение) ксенотрансплантатов клеток множественной миеломы человека MOLP-8 у мышей SCID CB.17, образовавшейся в течение определенного периода времени (дни) после инокуляции.

На Фиг.11А и В показана противоопухолевая активность nBT062-DMx в отношении CD138⁺ опухолевых клеток MOLP-8 в объемной модели опухоли MOLP-8 у мышей SCID. Объем опухоли выражен в виде среднего значения (± стандартное отклонение) для каждой группы.

На Фиг.12 представлен график противоопухолевой эффективности конъюгатов DMx, содержащих антитело nBT062, в модели SCIDhu/INA-6 в отношении клеток множественной миеломы в среде костного мозга человека. Растворимый рецептор IL-6 человека, продуцируемый клетками множественной миеломы, (shulL-6R), был использован в качестве индикатора опухолевой массы. Треугольник: nBT062-SPP-DM1, квадрат: nBT062-SPDB-DM4, ромб: контрольный наполнитель.

На Фиг.13 показан опосредованный nBT062-SPDB-DM4 лизис опухолевых клеток in vitro. CD138-положительные клетки ОРМ2 и CD138-отрицательные клетки Namawla культивировали с nBT062-SPDB-DM4 в разных концентрациях и измеряли жизнеспособность клеток. Значения ОD₄₅₀ являются мерой жизнеспособности клеток.

На Фиг.14А показана экспрессия CD138 разными клетками ММ, и на Фиг.14В показан микроскопический анализ клеток DOX40 (верхний блок) и клеток ОРМ1 (нижний блок). Экспрессия CD138 показана с правой стороны, и нуклеиновые кислоты показаны с левой стороны.

На Фиг.15А показана цитотоксичность nBT062-SMCC-DM1, nBT062-SPDB-DM4 и nBT062-SPP-DM1 в отношении клеток ММ через 40, 80 и 120 часов. На Фиг.15В показана жизнеспособность клеток ММ, выделенных у трех разных субъектов после лечения nBT062-SPDB-DM4 в течение 2 дней. На Фиг.15С показаны мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС), выделенные у 3 здоровых субъектов, которые культивировали с nBT062-SPDB-DM4 в течение 72 часов до определения жизнеспособности клеток.

На Фиг.16А показан анализ клеточного цикла, при выполнении которого клетки ОРМ1 обрабатывали иммуноконъюгатами в течение 0, 12 или 24 часов и анализировали профили клеточных циклов путем окрашивания PI. На Фиг.16В показаны клетки ОРМ1, которые культивировали в присутствии или отсутствии иммуноконъюгатов в течение 24, 48 или 72 часов. Процентное содержание апоптических клеток определяли путем окрашивания антителом Аро 2.7 и выполнения проточного цитометрического анализа. На Фиг.16С показаны клетки ОРМ1, которые культивировали в присутствии 885 мкг/мл nBT062-SPDB-DM4 в течение указанных периодов времени (левый блок) или с иммуноконъюгатом в разных концентрациях (средний блок). Ингибитор панкаспазы zVAD-fmk блокировал индуцируемую nBT062-SPDB-DM4 каспазу-8, -9 и -3 и расщеплял поли(ADP-рибоза)полимеразу (PARP) в клетках ОРМ1 (правый блок).

На Фиг.17А-17С показано воздействие IL-6, IGF-1 и BMSC на рост и чувствительность клеток ММ к иммуноконъюгатам. На Фиг.17D показаны эксперименты с использованием дексаметазона вместо иммуноконъюгата. На Фиг.17Е показаны результаты эксперимента по адгезии клеток к сокультурам опухолевых клеток и BMSC в присутствии или отсутствии иммуноконъюгатов.

На Фиг.18А показан анализ экспрессии GFP клетками ОРМ1^GFP. На Фиг.18В показано воздействие nBT062-SPDB-DM4, nBT062-SPP-DM1 или контрольного буфера на размеры опухолей в группах мышей SCID, которым инъецировали клетки ОРМ1^GFP в количестве 5×10⁶. На Фиг.18С показано значительно более высокое выживание животных, которым вводили nBT062-SPDB-DM4, (Р <0,0023, пунктирная линия, n=5) по сравнению с контрольной группой, которой вводили только наполнитель (сплошная линия; нормальный физиологический раствор, n=5). На Фиг.18D показано, что nBT062-SPDB-DM4 вызывает апоптоз клеток in vivo.

Подробное описание разных и предпочтительных вариантов осуществления изобретения

Настоящее изобретение относится к иммуноконъюгатам, включающим агенты против CD138, к доставке эффекторных молекул иммуноконъюгатов к мишени и сайтспецифическому высвобождению эффекторных молекул в клетках-мишенях, тканях и органах или рядом с ними. Эффекторные молекулы могут быть активированы отщеплением/диссоциацией от агента против клетки-мишени иммуноконъюгата на сайте-мишени. Настоящее изобретение, в частности, относится к применению указанных иммуноконъюгатов для прекращения роста опухоли in vivo и преодоления или ослабления защитных механизмов, действующих в микросреде костного мозга.

Иммуноконъюгаты по настоящему изобретению можно вводить субъекту, нуждающемуся в терапевтическом лечении, или в клетки, выделенные у такого субъекта. Одна или несколько эффекторных молекул могут высвобождаться из иммуноконъюгата в результате отщепления/диссоциации в клетках-мишенях, тканях и органах или рядом с ними.

В соответствии с одним примером субъекту, страдающему раком, вводят иммуноконъюгат, включающий антитело nВT062 против CD138-экспрессирующих клеток и по меньшей мере одно высокотоксичное лекарственное средство или токсин в качестве эффекторной молекулы. В данном примере терапевтически эффективное количество иммуноконъюгата вводят субъекту внутривенно для концентрирования в раковых клетках. Одна или несколько эффекторных молекул затем высвобождаются из антитела естественным путем. После или во время отщепления эффекторная молекула может быть стабилизирована алкилированием и может диффундировать в окружающие А-клетки, такие как стромальные клетки, не экспрессирующие CD138.

В соответствии со вторым примером субъекту, страдающему раком, вводят иммуноконъюгат, включающий антитело nBT062 против CD138-экспрессирующих клеток, по меньшей мере одно вывокотоксичное лекарственное средство или токсин в качестве эффекторной молекулы и дополнительное цитотоксическое средство. В данном примере терапевтически эффективное количество иммуноконъюгата и цитотоксического средства вводят последовательно. Сначала субъекту внутривенно вводят иммуноконъюгат, который концентрируется в раковых клетках микросреды костного мозга. Иммуноконъюгат преодолевает лекарственную устойчивость, опосредуемую межклеточной адгезией (CAM-DR), и разрушает значительную часть CD138- экспрессирующих опухолевых клеток в микросреде костного мозга. Эффекторные молекулы отделяются от антитела естественным путем и разрушают опухолевые клетки. Иммуноконъюгат по меньшей мере частично предотвращает адгезию опухолевых клеток к стромальным клеткам, некоторые из которых могут быть разрушены диффундирующей эффекторной молекулой. Через 12 часов вводят цитотоксическое средство. Цитотоксическое средство, активность которого обычно по меньшей мере частично уменьшается вследствие САМ-DR, может воздействовать на опухолевые клетки, не ассоциированные со стромальными клетками, и разрушать CD138-экспрессирующие опухолевые клетки, которые не поддаются воздействию иммуноконъюгата.

CD138 или синдекан-1 (определяемый также как SYND1, СИНДЕКАН, SDC, SCD1, АНТИГЕН CD138, номер доступа SwissProt: Р18827 человека) является мембранным гликопротеином, который, как первоначально было указано, присутствует на клетках эпителиального происхождения и затем был обнаружен на гемопоэтических клетках (Sanderson, 1989). CD138 имеет длинный внеклеточный домен, который связывается с растворимыми молекулами (например, факторами роста EGF, FGF, HGF) и нерастворимыми молекулами (например, с компонентами внеклеточного матрикса коллагеном и фибронектином) при помощи цепей, образуемых сульфатом гепарана (Langford, 1998; Yang, 2007), и действует в качестве рецептора внеклеточного матрикса. CD138 также опосредует межклеточную адгезию при помощи гепарин-связывающих молекул, экспрессируемых смежными клетками. Установлено, что CD138 является корецептором факторов роста миеломных клеток (Bisping, 2006). Исследования дифференцировки плазмоцитов показали, что CD138 следует также считать дифференцировочным антигеном (Batаille, 2006).

В случае злокачественного гемопоэза антиген CD138 высоко экспрессирован на большинстве клеток ММ, клетках рака яичника, рака почки, рака желчного пузыря, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака легкого, рака ободочной кишки, клетках лммфомы Ходжкина и неходжскинской лимфомы, хронического лимфолейкоза (CLL) (Horvathova, 1995), острого лимфобластного лейкоза (ALL), острого миелобластного лейкоза (AML) (Seftalioglu, 2003 (a); Deftalioglu, 2003 (b)), клетках солидных тканевых сарком, рака ободочной кишки и других гематологических злокачественных новообра