Антитела человека к cd20 человека и способ их использования

Антитела человека к cd20 человека и способ их использования

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к антителам человека и фрагментам антител, специфичным в отношении CD20 человека, к содержащим их фармацевтическим композициям и к способам лечения.

Уровень техники

CD20 (также известный как антиген ограниченной дифференцировки B-лимфоцитов человека или Bp35; поверхностный антиген B-лимфоцитов B1, Leu-16, BM5, и LF5) представляет собой гидрофобный трансмембранный белок с молекулярной массой ~35 кДа, экспрессирующийся на пре-B и зрелых B-лимфоцитах (Valentine et al. (1989) J Biol Chem 264:11282; Einfield et al. (1988) EMBO J 7:711-717). Аминокислотная последовательность CD20 человека представлена как SEQ ID NO:1 (номер доступа в GenBank NP_690605). Анти-CD20 антитела описаны, например, в US 5736137, WO 2004/056312 и US 2004/0167319.

Способы создания антител, используемых в терапии человека, включают получение химерных антител и гуманизированных антител (см., например, US 6949245). См. также, например, WO 94/02602 и US 6596541, в которых описаны способы получения генетически модифицированных мышей, способных к выработке антител, используемых в терапии человека.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте изобретение относится к антителам человека, предпочтительно, рекомбинантным антителам человека, которые специфически связываются с CD20 человека. Эти антитела характеризуются специфическим связыванием с CD20 человека и опосредуют цитолиз клеток B-клеточной лимфомы, экспрессирующих CD20. Антитела могут быть полноразмерными (например, IgG1 или IgG4 антитела) или могут содержать только антиген-связывающий участок (например, Fab, F(ab')₂ или scFv фрагмент), и могут быть модифицированы с эффектом на активность, например, для устранения или усиления остаточных эффекторных функций (Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164:1925-1933).

Антитело или его антиген-связывающий фрагмент специфически связываются с CD20 человека и способны индуцировать комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) в отношении клеток, экспрессирующих CD20, в присутствии комплемента, где антитело в концентрации приблизительно 10 нМ или меньше индуцирует 50% лизис клеток Daudi и RL в присутствии 5% нормальной сыворотки человека с комплементом. В предпочтительных вариантах осуществления концентрация антитела, которая индуцирует 50% лизис, составляет приблизительно 5 нМ или менее; приблизительно 2 нМ или менее; или приблизительно 1 нМ или менее. В одном из вариантов осуществления антитело или его фрагмент демонстрируют EC₅₀ 0,2 нМ или менее, как измерено на клетках Daudi, или EC₅₀ 0,4 нМ или менее, как измерено с помощью клеток RL. В различных вариантах осуществления антитело или фрагмент антитела способны повышать бессимптомное время выживания от приблизительно 2-х до приблизительно 9-ти раз или более, по сравнению с контрольными животными на мышиной модели лимфомы человека.

Антитело или его фрагмент специфически связываются с CD20 человека и способны индуцировать антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) в отношении клеток, экспрессирующих CD20, в присутствии мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC), где антитело демонстрирует EC₅₀ приблизительно 1 нМ или менее, как измерено на клетках Daudi. В предпочтительных вариантах осуществления антитело демонстрирует EC₅₀ приблизительно 50 пМ или менее; приблизительно 20 пМ или менее; приблизительно 10 пМ или менее. В предпочтительном варианте осуществления антитела, демонстрирующие повышенную активность ADCC, могут содержать сниженные уровни фукозилирования, например, приблизительно 5% фукозы.

В одном из вариантов осуществления антитело или антиген-связывающий участок антитела по изобретению содержат последовательность вариабельной области тяжелой цепи (HCVR), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:3, 19, 23, 27, 43, 47, 51, 67, 71, 75, 91, 95, 99, 115, 119, 123, 139, 143, 147, 163, 167, 171, 187, 191, 195, 211, 215, 219, 235, 239, 243, 259, 263, 267, 283, 287, 291, 307, 311, 315, 331, 335, 339, 355, 359, 363, 379, 383, 387, 395 и 403, или по существу сходную с ней последовательность. В предпочтительном варианте осуществления антитело или фрагмент содержат последовательность HCVR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:339, 195 и 243.

В конкретном варианте осуществления антитело или его антиген-связывающий фрагмент дополнительно содержат последовательность вариабельной области легкой цепи (LCVR), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:11, 21, 25, 35, 45, 49, 59, 69, 73, 83, 93, 97, 107, 117, 121, 131, 141, 145, 155, 165, 169, 179, 189, 193, 203, 213, 217, 227, 237, 241, 251, 261, 265, 275, 285, 289, 299, 309, 313, 323, 333, 337, 347, 357, 361, 371, 381 и 385, или по существу сходную с ней последовательность. В предпочтительном варианте осуществления антитело или фрагмент содержат LCVR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:347, 203 и 251.

В конкретном варианте осуществления антитело или его фрагмент содержат пары последовательностей HCVR/LCVR, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO:3/11, 19/21, 23/25, 27/35, 43/45, 47/49, 51/59, 67/69, 71/73, 75/83, 91/93, 95/97, 99/107, 115/117, 119/121, 123/131, 139/141, 143/145, 147/155, 163/165, 167/169, 171/179, 187/189, 191/193, 195/203, 211/213, 215/217, 219/227, 235/237, 239/241, 243/251, 259/261, 263/265, 267/275, 283/285, 287/289, 291/299, 307/309, 311/313, 315/323, 331/333, 335/337, 339/347, 355/357, 359/361, 363/371, 379/381 и 383/385. В предпочтительном варианте осуществления антитело или его фрагмент содержат пары последовательностей HCVR/LCVR, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO:339/347, 195/203 и 243/251.

Во втором аспекте изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело или его фрагмент. В конкретных вариантах осуществления молекула нуклеиновой кислоты кодирует HCVR, где нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:2, 18, 22, 26, 42, 46, 50, 66, 70, 74, 90, 94, 98, 114, 118, 122, 138, 142, 146, 162, 166, 170, 186, 190, 194, 210, 214, 218, 234, 238, 242, 258, 262, 266, 282, 286, 290, 306, 310, 314, 330, 334, 338, 354, 358, 362, 378, 382, 386, 394 и 402, или по существу сходную с ней последовательность. В другом аспекте изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей LCVR, где нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из SEQ ID NO:10, 20, 24, 34, 44, 48, 58, 68, 72, 82, 92, 96, 106, 116, 120, 130, 140, 144, 154, 164, 168, 178, 188, 192, 202, 212, 216, 226, 236, 240, 250, 260, 264, 274, 284, 288, 298, 308, 312, 322, 332, 336, 346, 356, 360, 370, 380 и 384, или по существу сходную с ней последовательность. В предпочтительном варианте осуществления антитело или фрагмент антитела содержат HCVR, которую кодирует молекула нуклеиновой кислоты, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO:338, 194 и 242, и LCVR, которую кодирует молекула нуклеиновой кислоты, выбранная из группы, состоящей из SEQ ID NO:346, 202 и 250, соответственно.

В третьем аспекте изобретение относится к антителу или его антиген-связывающему фрагменту, содержащему CDR3 тяжелой цепи (HCDR3), которая, в свою очередь, содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:9, 33, 57, 81, 104, 129, 153, 177, 201, 225, 249, 273, 297, 321, 345, 369, 393, 401 и 409; и CDR3 легкой цепи (LCDR3), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:17, 41, 65, 89, 113, 137, 161, 185, 209, 233, 257, 281, 305, 329, 353 и 377. В предпочтительном варианте осуществления антитело или его фрагмент содержат последовательности HCDR3 и LCDR3, выбранные из пар последовательностей HCDR3/LCDR3 SEQ ID NO:345/353, 201/209 и 249/257.

В конкретном варианте осуществления антитело или его фрагмент дополнительно содержат доменную последовательность CDR1 тяжелой цепи (HCDR1), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:5, 29, 53, 77, 101, 125, 149, 173, 197, 221, 245, 269, 293, 317, 341, 365, 389, 397 и 405; доменную последовательность CDR2 тяжелой цепи (HCDR2), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:7, 31, 55, 79, 103, 127, 151, 175, 199, 223, 247, 271, 295, 319, 343, 367, 391, 399 и 407; доменную последовательность CDR1 легкой цепи (LCDR1), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:13, 37, 61, 85, 109, 133, 157, 181, 205, 229, 253, 277, 301, 325, 349 и 373; и доменную последовательность CDR2 легкой цепи (LCDR2), выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO:15, 39, 63, 87, 111, 135, 159, 183, 207, 231, 255, 279, 303, 327, 351 и 375. В предпочтительном варианте осуществления антитело или его фрагмент содержат последовательности CDR тяжелой и легкой цепей, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO:341, 343, 345, 349, 351 и 353; 197, 199, 201, 205, 207 и 209; и 245, 247, 249, 253, 255 и 257, соответственно.

В четвертом аспекте изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело или антиген-связывающие фрагменты по изобретению, где молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие домен HCDR3 и домен LCDR3, выбраны из группы, состоящей из SEQ ID NO:9 и 16; 33 и 41; 57 и 65; 81 и 89; 104 и 113; 129 и 137; 153 и 161; 177 и 185; 201 и 209; 225 и 233; 249 и 257; 273 и 281; 297 и 305; 321 и 329; 345 и 353; и 369 и 377, соответственно.

В пятом аспекте изобретение относится к антителу или антиген-связывающему фрагменту, содержащему домен HCDR3 и домен LCDR3, где домен HCDR3 содержит аминокислотную последовательность по формуле X¹ - X² - X³ - X⁴ - X⁵ - X⁶ - X⁷ - X⁸ -X⁹ - X¹⁰ - X¹¹ - X¹² - X¹³ - X¹⁴ - X¹⁵ - X¹⁶ -X¹⁷ - X¹⁸ - X¹⁹ (SEQ ID NO:412), где X¹=A, V или T; X²=K; X³=D; X⁴=P, F или G; X⁵=S или H; X⁶=Y; X⁷=G; X⁸=S или H; X⁹=G или F; X¹⁰=S или Y; X¹¹=Y, N или S; X¹²=Y, G или H; X¹³=G, L или S; X¹⁴=Y, M или D; X¹⁵=Y, D или V; X¹⁶=G, V или отсутствует; X¹⁷=M или отсутствует; X¹⁸=D или отсутствует; X¹⁹=V или отсутствует; и домен LCDR3 содержит аминокислотную последовательность по формуле X¹ - X² - X³ - X⁴ - X⁵ - X⁶ - X⁷ - X⁸ - X⁹ (SEQ ID NO:415), где X¹=Q; X²=Q; X³=R или S; X⁴=N, Y или F; X⁵=N, D или Y; X⁶=W; X⁷=P; X⁸=L; X⁹=T.

В конкретном варианте осуществления антитело или антиген-связывающий фрагмент дополнительно содержат домены тяжелой и легкой цепей CDR1 и CDR2, где домен HCDR1 содержит аминокислотную последовательность по формуле X¹ - X² - X³ - X⁴ - X⁵ - X⁶ - X⁷ - X⁸ (SEQ ID NO:410), где X¹=G; X²=F или I; X³=T; X⁴=F; X⁵=H, R или Y; X⁶=D; X⁷=Y; X⁸=T или A; домен HCDR2 содержит аминокислотную последовательность по формуле X¹ - X² - X³ - X⁴ - X⁵ - X⁶ - X⁷ - X⁸ (SEQ ID NO:411), где X¹=I; X²=S; X³=W; X⁴=N; X⁵=S; X⁶=G или D; X⁷=S, Y или T; X⁸=I или L; домен LCDR1 содержит аминокислотную последовательность по формуле X¹ - X² - X³ - X⁴ - X⁵ -X⁶ (SEQ ID NO:413), где X¹=Q; X²=S; X³=V или I; X⁴=S; X⁵=S или R; X⁶=Y или N; и домен LCDR2 содержит аминокислотную последовательность по формуле X¹ - X² - X³ (SEQ ID NO:414), где X¹=E, G или V; X²=A; X³=S.

В шестом аспекте изобретение относится к рекомбинантным экспрессионным векторам, несущим молекулы нуклеиновой кислоты по изобретению, и к клеткам-хозяевам, в которые введены такие векторы, а также к способам получения антител или их фрагментов по изобретению путем культивирования клеток-хозяев по изобретению. Клетка-хозяин может быть прокариотической или эукариотической клеткой; предпочтительно, клетка-хозяин представляет собой клетку E. coli или клетку млекопитающего, такую как клетка CHO. В предпочтительном варианте осуществления антитело может быть получено с различными уровнями фукозилирования. Например, клеточная линия CHO может быть выбрана для выработки антитела или фрагмента антитела с уровнем фукозилирования от минимального значения приблизительно 5% до максимального значения приблизительно 95%.

В седьмом аспекте изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит анти-CD20 антитело человека или его фрагмент и фармацевтически приемлемый носитель.

В восьмом аспекте изобретение относится к полному антителу человека или фрагменту антитела, способному связываться с CD20 человека, где значение EC₅₀ составляет менее приблизительно 10 нМ, как измерено в экспериментах связывания с клетками (описано ниже). В предпочтительном варианте осуществления антитело по изобретению имеет значение EC₅₀, равное приблизительно от 10^-8 до приблизительно 10^-12 M или выше, например, по меньшей мере 10^-8 M, по меньшей мере 10^-9 M, по меньшей мере 10^-10 M, по меньшей мере 10^-11 M или по меньшей мере 10^-12 M, при измерении связывания с антигеном, представленным на поверхности клетки.

Настоящее изобретение относится к анти-CD20 антителам с измененной структурой гликозилирования. В некоторых вариантах применения модификация для удаления нежелательных участков гликозилирования может быть эффективна, или отсутствие у антитела фукозной части имеется на олигосахаридной цепи, например, для усиления функции антитело-зависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) (см. Shield et al. (2002) JBC 277:26733). В других вариантах применения модификация гликозилирования может быть проведена для изменения комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC).

В девятом аспекте изобретение относится к антителу или антиген-связывающему фрагменту антитела, как описано выше, которые используют для облегчения течения или подавления заболевания или состояния, опосредованного CD20, у человека. В предпочтительном варианте осуществления заболевание или состояние, на которое направлено лечение, представляет собой неходжкинскую лимфому, ревматоидный артрит, системную красную волчанку, болезнь Крона, хронический лимфоцитарный лейкоз и воспалительные заболевания. В другом варианте осуществления изобретение относится к способу облегчения течения или подавления заболевания или состояния, опосредованного CD20, у человека, который включает введение терапевтически эффективного количества антитела или антиген-связывающего фрагмента антитела, как описано выше. Кроме того, изобретение относится к применению антитела или антиген-связывающего фрагмента антитела по изобретению для получения лекарственного средства, которое используют для смягчения или подавления заболевания или состояния, опосредованного CD20, у человека.

Остальные объекты и преимущества изобретения станут очевидны из нижеследующего подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1. Кривая бессимптомного выживания. Результаты показаны для контрольного Fc человека, контрольных антител I и II и антител: 8G6-5, 9D4-7, 10F2-13 и 7E1-13.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Перед описанием способов по настоящему изобретению следует иметь в виду, что настоящее изобретение не ограничено отдельными способами и описанными экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут изменяться. Также следует иметь в виду, что терминология использована в данном документе только в целях описания частных вариантов осуществления и не является ограничивающей, поскольку объем настоящего изобретения может быть ограничен только формулой изобретения.

Если не определено иначе, все использованные в описании технические и научные термины имеют то же самое значение, в котором они обычно понимаются специалистом в области, к которой относится настоящее изобретение. Хотя любые способы и материалы, сходные или эквивалентные описанным в настоящем описании, можно использовать в практическом осуществлении или тестировании по настоящему изобретению, предпочтительные способы и материалы описаны в данном документе.

Определения

Термин "CD20" включает варианты и изоформы CD20 человека, которые экспрессируются клетками естественным образом. Связывание антитела по изобретению с антигеном CD20 опосредует цитолиз клеток, экспрессирующих CD20 (например, опухолевой клетки). Цитолиз клеток, экспрессирующих CD20, может происходить разными способами, включая комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC) по отношению к клеткам, экспрессирующим CD20, апоптоз клеток, экспрессирующих CD20, фагоцитоз эффекторными клетками клеток, экспрессирующих CD20, или опосредованную эффекторными клетками антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC) по отношению к клеткам, экспрессирующим CD20.

Как используется в настоящем описании, термин "антитело" означает молекулу иммуноглобулина, которая содержит четыре полипептидные цепи, две тяжелые (H) цепи и две легкие (L) цепи, взаимосвязанные дисульфидными связями. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (сокращенную в настоящем описании как HCVR или VH) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи содержит три домена, CH1, CH2 и CH3. Каждая легкая цепь содержит вариабельную область легкой цепи (сокращенную в настоящем описании как LCVR или VL) и константную область легкой цепи. Константная область легкой цепи содержит один домен (CL1). Области VH и VL могут быть дополнительно подразделены на области гипервариабельности, названные областями, определяющими комплементарность (CDR), в которые вкраплены более консервативные области, названные каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из трех CDR и четырех FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

Как используется в настоящем описании, термин "антиген-связывающий участок" антитела (или просто "участок антитела" или "фрагмент антитела") относится к одному или нескольким фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, hCD20). Показано, что эти фрагменты полноразмерного антитела могут выполнять антиген-связывающую функцию антитела. Примеры связывающих фрагментов, охваченных термином "антиген-связывающий участок" антитела, включают (i) фрагмент Fab, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL1 и CH1; (ii) фрагмент F(ab')₂, бивалентный фрагмент, который содержит два фрагмента F(ab)', связанных дисульфидным мостиком у шарнирной области; (iii) фрагмент Fd, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов VL и VH одного плеча антитела; (v) фрагмент dAb (Ward et al. (1989) Nature 241:544-546), который состоит из домена VH; и (vi) выделенная, определяющая комплементарность область (CDR). Кроме того, хотя два домена фрагмента Fv, VL и VH, кодируются разными генами, они могут быть объединены с помощью рекомбинатных способов синтетическим линкером, что обеспечивает возможность их получения в виде единой смежной цепи, в которой области VL и VH спариваются, образуя моновалентные молекулы (известные как одноцепочечный Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также охватываются термином "антиген-связывающий участок" антитела. Другие формы одноцепочечных антител, такие как диатела, также включены в термин (см., например, Holliger et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448).

"CDR" или область, определяющая комплементарность, представляет собой область гипервариабельности, в которую вкраплены более консервативные области, названные каркасными областями (FR). В различных вариантах осуществления анти-hCD20 антитела или фрагмента по изобретению FR могут быть идентичны зародышевой последовательности человека или могут быть естественно или искусственно модифицированы.

Как используется в настоящем описании, термин "поверхностный плазмонный резонанс", относится к оптическому явлению, которое позволяет анализировать взаимодействия в реальном времени за счет обнаружения изменений в концентрации белков внутри биосенсорной матрицы, например, с использованием системы BIACORE™ (Pharmacia Biosensor AB).

Термин "эпитоп" относится к антигенной детерминанте, которая взаимодействует со специфическим антиген-связывающим участком в вариабельной области молекулы антитела, известной как паратоп. Один антиген может иметь более одного эпитопа. Эпитопы могут быть либо конформационными, либо линейными. Конформационный эпитоп образован путем случайного наложения друг на друга аминокислот из различных сегментов одной (или более) линейной полипептидной цепи(цепей). Линейный эпитоп представляет собой эпитоп, образованный дополнительными аминокислотными остатками в полипептидной цепи. В определенных обстоятельствах эпитоп может включать другие части, такие как сахариды, фосфорильные группы или сульфонильные группы антигена.

Термин "по существу идентичный", используемый по отношению к нуклеиновой кислоте или ее фрагменту, указывает, что при оптимальном выравнивании соответствующими нуклеотидными вставками или делециями с другой нуклеиновой кислотой (или ее комплементарной цепью) существует идентичность нуклеотидной последовательности, по меньшей мере приблизительно 95% и, более предпочтительно, по меньшей мере приблизительно 96%, 97%, 98% или 99% нуклеотидных оснований, как измерено любым хорошо известным алгоритмом идентичности последовательности, таким как FASTA, BLAST или GAP, что обсуждается ниже.

Применительно к полипептидам термин "по существу сходный" означает, что две пептидные последовательности при оптимальном выравнивании, таком как выравнивание с помощью программ GAP или BESTFIT, c использованием пропуска весов по умолчанию, разделяют по меньшей мере 95% идентичности последовательности, даже более предпочтительно, по меньшей мере 98% или 99% идентичности последовательности. Предпочтительно, положения остатков, которые не являются идентичными, различаются консервативными аминокислотными заменами. "Консервативная аминокислотная замена" представляет собой замену, при которой аминокислотный остаток замещен другим аминокислотным остатком, имеющим боковую цепь (R-группу) со сходными химическими свойствами (например, заряд или гидрофобность). Как правило, консервативная аминокислотная замена по существу не изменяет функциональные свойства белка. В случае, если две или более аминокислотных последовательностей отличаются друг от друга консервативными заменами, то процент или степень сходства могут быть увеличены для коррекции консервативной природной замены. Способы проведения такой корректировки хорошо известны специалистам в данной области. См., например, Pearson (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-331. Примеры аминокислотных групп, которые имеют боковые цепи со сходными химическими свойствами, включают 1) алифатические боковые цепи: глицин, аланин, валин, лейцин и изолейцин; 2) алифатические гидроксильные боковые цепи: серин и треонин; 3) амидсодержащие боковые цепи: аспарагин и глутамин; 4) ароматические боковые цепи: фенилаланин, тирозин и триптофан; 5) основные боковые цепи: лизин, аргинин и гистидин; 6) кислотные боковые цепи: аспартат и глутамат и 7) серосодержащие боковые цепи: цистеин и метионин. Предпочтительными консервативными аминокислотными заменами являются: валин-лейцин-изолейцин, фенилаланин-тирозин, лизин-аргинин, аланин-валин, глутамат-аспартат и аспарагин-глутамин. Альтернативно, консервативная замена представляет собой любую замену, которая имеет положительное значение в PAM250 матрице логарифмического правдоподобия, раскрытой в Gonnet et al. (1992) Science 256: 1443 45. "Умеренно консервативная" замена означает любую замену с неотрицательным значением в PAM250 матрице логарифмического правдоподобия.

Сходство последовательности полипептидов обычно измеряют с помощью программного обеспечения для анализа последовательностей. Программное обеспечение для анализа белков подбирает сходные последовательности, используя меры сходства, заданные различным заменам, делециям и другим модификациям, включая консервативные аминокислотные замены. Например, программное обеспечение GCG содержит программы, такие как GAP и BESTFIT, которые можно использовать с параметрами по умолчанию для определения гомологии последовательностей или идентичности последовательностей между близкородственными полипептидами, такими как гомологичные полипептиды различных видов организмов, или между белком дикого типа и его мутантом. См., например, GCG Version 6.1. Полипептидные последовательности также можно сравнивать, используя FASTA с параметрами по умолчанию или рекомендованными параметрами; программу в GCG Version 6.1. FASTA (например, FASTA2 и FASTA3) обеспечивает выравнивание и процент идентичности последовательности областей с наилучшим перекрытием между последовательностью по запросу и последовательностью поиска (Pearson (2000) выше). Другим предпочтительным алгоритмом для сравнения последовательности по изобретению с базой данных, содержащей большое число последовательностей различных организмов, является компьютерная программа BLAST, особенно BLASTP или TBLASTN, с использованием параметров по умолчанию. См., например, Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 и Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389 402.

Термин "эффективное количество" означает концентрацию или количество антитела или антиген-связывающего фрагмента антитела, которое приводит к достижению конкретной заявленной цели. "Эффективное количество" анти-CD20 антитела или его антиген-связывающего фрагмента антитела может быть определено эмпирически. Кроме того, "терапевтически эффективное количество" означает концентрацию или количество анти-CD20 антитела или его антиген-связывающего фрагмента, которое эффективно для достижения заявленного терапевтического эффекта. Это количество также может быть определено эмпирически.

Получение антител человека

Способы получения антител человека включают, например, VelocImmune™ (Regeneron Farmaceuticals), технологию XenoMouse™ (Green et al. (1994) Nature Genetics 7:13-21; Abgenix), "минилокусный" подход и фаговый дисплей (и см., например, US 5545807, US 6787637). Технология VelocImmune™ (US 6596541) включает способ создания высокоспецифичных полностью человеческих антител к выбранному антигену. Эта технология включает создание трансгенной мыши с геномом, содержащим вариабельные области тяжелой и легкой цепей человека, функционально связанные с эндогенными локусами константной области мыши таким образом, что мышь в ответ на антигенную стимуляцию продуцирует антитело, которое содержит вариабельную область человека и константную область мыши. ДНК, кодирующую вариабельные области тяжелых и легких цепей антитела, выделяли и функционально связывали с ДНК, кодирующей константные области тяжелой и легкой цепей человека. ДНК затем экспрессировалась в клетках, способных к экспрессии полностью человеческого антитела. В конкретном варианте осуществления данные клетки представляют собой клетки CHO.

Антитела могут быть использованы в терапии скорее для блокирования взаимодействия лиганд-рецептор или ингибирования взаимодействия компонентов рецептора, чем для цитолиза клеток путем фиксации комплемента (CDC) и участия в антитело-зависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC). Константная область антитела важна для способности антитела фиксировать комплемент и опосредовать клеточно-зависимую цитотоксичность. Таким образом, изотип антитела может быть выбран на основании того, желательно ли для антитела опосредовать цитотоксичность.

Иммуноглобулины человека могут существовать в двух формах, что связано с гетерогенностью шарнирного участка. В одной из форм молекула иммуноглобулина содержит стабильную четырехцепочечную конструкцию приблизительно 150-160 кДа, в которой димеры удерживаются вместе за счет внутрицепочечной дисульфидной связи тяжелой цепи. Во второй форме димеры не связаны посредством внутрицепочечных дисульфидных связей, и молекула приблизительно 75-80 кДа сформирована из ковалентно спаренных легкой и тяжелой цепей (полу-антитело). Эти формы крайне трудно разделить даже после аффинной очистки. Частота появления второй формы в различных интактных изотипах IgG обусловлена, но ими не ограничена, структурными различиями, связанными с шарнирной областью изотипа антитела. Единичная аминокислотная замена в шарнирной области IgG4 человека может значительно снизить появление второй формы (Angal et al. (1993) Molecular Immunology 30: 105) до уровней, обычно наблюдаемых при использовании шарнира IgG1 человека. Настоящее изобретение относится к антителам с одной или несколькими мутациями в шарнире, CH2 или CH3 области, которые могут быть желательны, например, при выработке, для улучшения выхода желаемой формы антитела.

Антитела по изобретению получают предпочтительно с использованием технологии VelocImmune™. Трансгенную мышь, у которой вариабельные области тяжелой и легкой цепей эндогенного иммуноглобулина заменены соответствующими вариабельными областями человека, стимулируют интересующим антигеном, и лимфатические клетки (такие как B-клетки) извлекают из мышей, которые экспрессируют антитела. Эти лимфатические клетки могут быть слиты с клеточной линией миеломы для получения бессмертных гибридомных клеточных линий, и такие гибридомные клеточные линии скринируют и отбирают для того, чтобы определить гибридомные клеточные линии, которые вырабатывают антитела, специфичные к интересующему антигену. ДНК, кодирующая вариабельные области тяжелой цепи и легкой цепи, может быть выделена и связана с желаемыми изотипическими константными областями тяжелой цепи и легкой цепи. Такой антительный белок может быть выработан в клетках, таких как клетки CHO. Альтернативно, ДНК, кодирующая антиген-специфичные химерные антитела или вариабельные домены легкой и тяжелой цепей, может быть выделена непосредственно из антиген-специфических лимфоцитов.

Как правило, антитела по настоящему изобретению обладают очень высокой аффинностью, обычно имея значения K_D или EC₅₀ приблизительно от 10^-8 до приблизительно 10^-12 M или выше, например, по меньшей мере 10^-8 M, по меньшей мере 10^-9 M, по меньшей мере 10^-10 M, по меньшей мере 10^-11 M или по меньшей мере 10^-12 M, при измерении связывания с антигеном, представленным на клеточной поверхности.

На начальной стадии выделяют высокоаффинные химерные антитела, содержащие вариабельную область человека и константную область мыши. Как описано ниже, антитела характеризуют и выбирают по желаемым характеристикам, включая аффинность, селективность, эпитоп и т.д. Константные области мыши заменяют желаемыми константными областями человека для получения полностью человеческого антитела по изобретению, например, дикого типа или модифицированные IgG1 или IgG4 (например, SEQ ID NO:416, 417, 418). В то время как выбранная константная область может отличаться в соответствии с конкретным применением, вариабельной области присущи высокоаффинная антиген-связывающая и мишень-специфическая характеристики.

Картирование эпитопа и сопутствующие технологии

Для скрининга антител, которые связываются с определенным эпитопом, использовали стандартный анализ перекрестного блокирования, такой как описан в "Antibodies: A Laboratory Manual" 1988 Cold Spring Harbor Laboratory, Harlow and Lane, eds. Другие способы включают аланиновое сканирование мутантов, пептидный блоттинг (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248:443-63) или анализ расщепления пептидов, как описано в примерах ниже. Кроме того, могут быть использованы способы, такие как вырезание эпитопа, экстракция эпитопа и химическая модификация антигенов (Tomer (2000) Protein Science: 9: 487-496).

Для анализа связывающих характеристик антитела были сконструированы мутантные белки CD20, содержащие выбранные аминокислотные замены. Мутантные белки CD20 содержали замены определенных аминокислот, встречающихся в белке человека, соответствующими аминокислотами, встречающимися в белке мыши. Такой подход помог убедиться в том, что мутантные белки CD20 сохранили свою третичную структуру и, предположительно, любые конформационные эпитопы. Связывание исследуемых антител с этими мутантными белками CD20 сравнивали со связыванием контрольных (известных) антител к CD20, как измерено с помощью FACS. Ни одно из антител по изобретению не показало профиль связывания, который был идентичен (в отношении всех без исключения мутантов) любому из контрольных антител.

Иммуноконъюгаты

Настоящее изобретение относится к анти-CD20 моноклональному антителу человека, конъюгированному с терапевтической частью ("иммуноконъюгат"), такой как цитотоксин, химиотерапевтическое лекарственное средство, иммуносупрессант или радиоактивный изотоп. Цитотоксичные средства включают любое средство, которое вредно для клеток. Примеры подходящих цитотоксичных средств и химиотерапевтических средств для образования иммуноконъюгатов известны в данной области, см., например, WO 05/103081.

Биспецифичность

Антитела по настоящему изобретению могут быть моноспецифическими, биспецифическими или полиспецифическими. Полиспецифические антитела могут быть специфичны к различным эпитопам одного полипептида-мишени или могут содержать антиген-связывающие домены, специфичные для более чем одного полипептида-мишени. См., например, Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147:60-69. Анти-CD20 антитела человека могут быть связаны или ко-экспрессированы с другой функциональной молекулой, например, другим пептидом или белком. Например, антитело или его фрагмент могут быть функционально связаны (например, путем химического спаривания, генетического слияния, нековалентной ассоциации или другим образом) с одной или несколькими другими молекулярными субстанциями, такими как другое антитело или фрагмент антитела, для получения биспецифического или полиспецифического антитела с вторичной специфичностью связывания. Полиспецифическое антитело по изобретению может специфически связываться как с клеткой, экспрессирующей CD20, так и с эффекторной клеткой человека, экспрессирующей полипептид, такой как Fc рецептор человека, и/или компоненты рецепторного комплекса T-клетки. В одном из вариантов осуществления полиспецифическое антитело по изобретению содержит CD20-связывающий участок и цитокин.

Терапевтическое применение

Антитела человека, антиген-связывающие фрагменты антител, иммуноконъюгаты и биспецифические молекулы по изобретению можно использовать в терапевтических способах лечения заболеваний человека, которые сдерживаются или улучшаются за счет ингибирования роста клеток, экспрессирующих CD20, и/или цитолиза клеток, экспрессирующих CD20. Механизм действия, посредством которого успешно осуществляются терапевтические способы по изобретению, включает цитолиз клеток, экспрессирующих CD20, в присутствии эффекторных клеток, например, посредством CDC, апоптоза, ADCC, фагоцитоза или путем комбинации двух или более этих механизмов. Механизм достижения терапевтического эффекта молекул по изобретению может приводить к прямому цитолизу или ингибированию клеток, экспрессирующих CD20, или опосредованно, за счет ингибирования клеток, которые не экспрессируют CD20, например, из-за экспрессии структурно сходных антигенов клеточной поверхности (т.е. без перекрестного реагирования с родственными, но функционально различными антигенами клеточной поверхности). Клетки, экспрессирующие CD20, которые могут быть ингибированы или лизированы с использованием антител человека по изобретению, включают, например, онкогенные B-клетки.

Примеры заболеваний и состояний, на которые может быть направлено лечение или течение которых может быть улучшено с помощью анти-CD20 антител и их фрагментов, включают, но ими не ограничиваются, онкогенные заболевания, такие как B-клеточная лимфома (NHL, лимфобластный лейкоз/лимфома предшественников В-клеток, неоплазии зрелых B-клеток, B-клеточный хронический лимфоцитарный лейкоз/малая лимфоцитарная лимфома, B-клеточный пролимфатический лейкоз, лимфоплазматическая лимфома, лимфома мантийных клеток, фолликулярная лимфома, кожная фолликулярная лимфома, B-клеточная лимфома маргинальной зоны, волосато-клеточный лейкоз, диффузная B-крупноклеточная лимфома, лимфома Беркитта, плазмоцитома, плазмоцитарная миелома, посттрансплантационное лимфопролиферативное нарушение, макроглобулинемия Вальденстрома и анапластическая крупноклеточная лимфома); иммунные заболевания, такие как аутоиммунные заболевания (псориаз, псориатический артрит, дерматит, системная склеродермия и склероз, воспалительное заболевание кишечника, болезнь Крона, язвенный колит, респираторный дистресс-синдром, менингит, энцефалит, увеит, гломерулонефрит, экзема, астма, атеросклероз, дефицит адгезии лейкоцитов, рассеянный склероз, синдром Рейно, синдром Шегрена, юношеский диабет, болезнь Рейтера, болезнь Бехчета, нефрит, вызванный иммунными комплексами, IgA-опосредованная нефропатия, IgM-опосредованные полинейропатии); иммуно-опосредованные тромбоцитопении, острая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура и хроническая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, гемолитическая анемия, миастения гравис, волчаночный нефрит, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, атопический дерматит, пузырчатка, болезнь Грейвса, тиреоидит Хашимото, гранулематоз Вегенера, синдром Оменна, хроническая почечная недостаточность, острый инфекционный мононуклеоз, ВИЧ и заболевания, связанные с вирусом герпеса; тяжелый острый респираторный дистресс-синдром и хореоретинит; заболевания и нарушения, связанные с инфицированием B-клетки вирусом, таким как вирус Эпштейна-Барра.

В конкретном варианте осуществления пациент, которому назначают антитело, дополнительно получает терапию радиацией, принимает химиотерапевтические средства или вещество, которое модулирует (улучшает ил