Протеаза streptomyces

Протеаза streptomyces

Иллюстрации

Показать все

Реферат

РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет по патентной заявке США с серийным № 11/929817 под названием "Протеаза Streptomyces", поданной 30 октября 2007 года.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к сериновым протеазам Streptomyces. В некоторых вариантах осуществления протеаза содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична протеазе 1AG3 Streptomyces дикого типа. Настоящее изобретение также относится к последовательностям выделенных нуклеиновых кислот, также предусматриваются рекомбинантные нуклеиновые кислоты и клетки-хозяева, содержащие рекомбинантные нуклеиновые кислоты. Кроме того, настоящее изобретение относится к моющим и другим композициям, содержащим сериновую протеазу Streptomyces.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Сериновые протеазы представляют собой подгруппу класса разнообразных ферментов, имеющих широкий диапазон специфичности и биологических функций. Несмотря на функциональное разнообразие, каталитический аппарат сериновых протеаз был изучен по меньшей мере в двух генетически отличающихся семействах ферментов, а именно в субтилизинах и в химотрипсин-связанных сериновых протеазах млекопитающих и гомологичных бактериальных сериновых протеазах (например, трипсин и трипсин S. griseus). Эти два семейства сериновых протеаз демонстрируют в значительной степени сходные механизмы катализа (смотрите, например, Kraut, Ann. Rev. Biochem., 46:331-358 [1977]).

Более того, несмотря на несходные первичные структуры, третичные структуры этих двух семейств ферментов сводят вместе консервативные каталитические триады аминокислот. Как субтилизины, так и химотрипсин-связанные сериновые протеазы имеют каталитическую триаду, содержащую аспартат, гистидин и серин. В субтилизин-связанных протеазах относительный порядок этих аминокислот, при считывании от N- к С-концу, представляет собой аспартат-гистидин-серин. Однако в химотрипсин-связанных протеазах, относительный порядок представляет собой гистидин-аспартат-серин. Много исследований было проведено на субтилизинах, главным образом, вследствие их применимости в связанных с очисткой и питанием применений. Дополнительная работа была сфокусирована на неблагоприятных окружающих условиях (например, воздействие окислителей, хелатирующих агентов и/или предельных температур и/или pH), которые могут оказывать неблагоприятное действие на функциональность этих ферментов при различных применениях. Тем не менее, в данной области остается необходимость в ферментных системах, которые могут выдерживать эти условия и сохранять или иметь повышенную активность относительно ферментных систем, известных в настоящее время в данной области.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Предусматривается выделенная сериновая протеаза, а также моющие композиции, содержащие ее. В некоторых вариантах осуществления протеаза идентична протеазе 1AG3 Streptomyces дикого типа (SEQ ID NO:9), а в других вариантах осуществления протеаза является вариантом. В некоторых вариантах осуществления протеаза содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере приблизительно на 80% идентична протеазе 1AG3 Streptomyces. В некоторых вариантах осуществления выделенная сериновая протеаза имеет по меньшей мере одну аминокислотную замену относительно протеазы 1AG3 Streptomyces дикого типа. В некоторых из этих вариантов осуществления выделенная сериновая протеаза имеет измененную субстратную специфичность относительно протеазы 1AG3 Streptomyces и имеет измененную pI, повышенную активность, такую как повышенная устойчивость к кислотам, термостабильность, гидролиз казеином, гидролиз кератином, эффективность очистки и/или стабильность LAS, относительно протеазы 1AG3 Streptomyces дикого типа.

Также предусматривается выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая выделенную сериновую протеазу. В этих вариантах осуществления выделенная нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность, которая: a) гибридизуется с SEQ ID NO:8 в строгих условиях гибридизации; и/или b) по меньшей мере на 70% идентична SEQ ID NO:8.

Также предусматривается рекомбинантный полинуклеотид, содержащий выделенную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полинуклеотид содержит функционально связанные промотор и выделенную нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления промотор является гетерологичным для выделенной нуклеиновой кислоты, поскольку он не является промотором протеазы 1AG3 Streptomyces дикого типа. В некоторых вариантах осуществления промотор представляет собой промотор протеазы 1AG3 Streptomyces дикого типа. В некоторых дополнительных вариантах осуществления рекомбинантная нуклеиновая кислота обеспечивает секрецию выделенной сериновой протеазы из клетки-хозяина (т.е. она содержит участок, кодирующий сигнальную последовательность, который направляет выделенную сериновую протеазу на секрецию). Также предусматривается экспрессирующий вектор, содержащий рекомбинантную нуклеиновую кислоту.

Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, содержащей рекомбинантный полинуклеотид. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин выбрана из Bacillus sp., Streptomyces sp., Aspergillus sp. и Trichoderma sp. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантный полинуклеотид находится в экспрессирующем векторе в клетке, а в других вариантах осуществления он находится в геноме клетки (т.е. он встроен в геном клетки-хозяина). В некоторых вариантах осуществления клетку-хозяина используют в способах получения выделенной сериновой протеазы. В некоторых вариантах осуществления способы включают: культивирование клетки-хозяина в условиях, пригодных для продуцирования выделенной сериновой протеазы. В некоторых альтернативных вариантах осуществления способы дополнительно включают извлечение выделенной сериновой протеазы. В некоторых вариантах осуществления протеаза секретируется в культуральную среду. В некоторых дополнительных вариантах осуществления способы дополнительно включают выделение протеазы из культуральной среды.

Также предусматривается моющая композиция, содержащая выделенную сериновую протеазу. В некоторых вариантах осуществления моющая композиция дополнительно содержит поверхностно-активное вещество. В некоторых вариантах осуществления поверхностно-активное вещество представляет собой алкилсульфат натрия, содержащий группу оксида этилена. В некоторых вариантах осуществления моющая композиция содержит от приблизительно 0,001% до приблизительно 0,5% по массе выделенной сериновой протеазы. В некоторых вариантах осуществления моющая композиция содержит достаточное количество модификатора pH для обеспечения композиции с pH в чистом виде от приблизительно 3 до приблизительно 5, где моющая композиция по существу не содержит материалов, которые гидролизуются при pH от приблизительно 3 до приблизительно 5. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления моющая композиция изготовлена в качестве детергента для стирки, и/или детергента для мытья посуды и/или моющей композиции для твердых поверхностей. В некоторых вариантах осуществления, в дополнение к рассматриваемой протеазе, моющая композиция также содержит по меньшей мере один дополнительный фермент, выбранный из протеаз, амилаз, липаз, маннаназ, пектиназ, кутиназ, оксидоредуктаз, гемицеллюлаз и/или целлюлаз. В некоторых вариантах осуществления моющая композиция дополнительно содержит по меньшей мере один стабилизатор. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления стабилизатором является боракс, глицерин и/или конкурентный ингибитор. В некоторых вариантах осуществления стабилизатор стабилизирует выделенную сериновую протеазу от действия анионных поверхностно-активных веществ. Моющая композиция предусматривается в любой пригодной форме, включая, но не ограничиваясь ими, твердую, жидкую формы, форму аэрозоля и/или геля.

Моющие композиции по настоящему изобретению применимы в способах очистки. В некоторых вариантах осуществления способ включает контактирование объекта с моющей композицией для очистки объекта. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает промывание и/или ополаскивание объекта. В иллюстративных вариантах осуществления объектом является ткань (например, одежда) или предмет столовой посуды (например, блюдо или тарелка).

Также настоящее изобретение относится к корму для животных, содержащему выделенную сериновую протеазу.

ОПИСАНИЕ ФИГУР

На фиг.1 схематично представлена диаграмма, на которой показана организация гена 1AG3.

На фиг.2 представлено выравнивание полипептидных последовательностей 1AG3 (SEQ ID NO:2) и стрептогрисина C (SEQ ID NO:12).

На фиг.3 представлено выравнивание зрелой (т.е. каталитических доменов) протеазы 1AG3 (SEQ ID NO:13) и стрептогрисина C (SEQ ID NO:14). На этой фигуре активный центр аминокислот (his-asp-ser) показан полужирным шрифтом и характерные три дисульфидных мостика указаны соединительными линиями.

На фиг.4 представлено выравнивание протеазы 1AG3 (SEQ ID NO:2) и ASP (SEQ ID NO:15).

На фиг.5 представлено выравнивание зрелой (т.е. каталитических доменов) протеазы 1AG3 (SEQ ID NO:13) и ASP (SEQ ID NO:16).

На фиг.6 представлена карта экспресирующей конструкции pSEA4CT-1AG3.

На фиг.7 представлена кривая "доза-эффект" для протеазы 1AG3, тестированной в жидком детергенте при 20ºС и pH 8,2.

На фиг.8 представлена кривая "доза-эффект" для протеазы 1AG3, тестированной в жидком детергенте при 30ºС и pH 6,0.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем документе представлены новые протеазы, новый генетический материал, кодирующий эти ферменты, и протеолитические белки, полученные из видов Streptomyces, включая варианты белков, полученные из них. В некоторых вариантах осуществления предусматриваются композиции протеаз, полученные из вновь описанных видов Streptomyces, ДНК, кодирующая протеазу, векторы, содержащие ДНК, кодирующую протеазу, клетки-хозяева, трансформированные векторной ДНК, и фермент, продуцируемый клетками-хозяевами. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения также предусматриваются моющие композиции (например, детергентные композиции), композиции кормов для животных и композиции для обработки тканей и кожи, содержащие протеазу(ы), полученную из Streptomyces sp. В альтернативных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к мутантным (т.е. являющимся вариантами) протеазам, происходящим из протеаз дикого типа, описанных в настоящем документе. Эти мутантные протеазы также применимы во множестве применений.

Streptomyces представляют собой грамположительные бактерии, классифицируемые как члены семейства Streptomycetaceae, подотряд Streptomycineae, отряд Actinomycetales, класс Actinobacteria. Streptomyces растут в качестве широко ветвящегося первичного или субстратного мицелия и многочисленного воздушного мицелия, который при созревании имеет характерные споры. Стрептогрисины представляют собой сериновые протеазы, секретируемые в больших количествах широким множеством видов Streptomyces. Аминокислотные последовательности протеаз Streptomyces были определены по меньшей мере для 9 различных видов Streptomyces, включая стрептогрисин C Streptomyces griseus (регистрационный № P52320); щелочную протеазу (EC 3.4.21.-) из Streptomyces sp. (регистрационный № PC2053); щелочную сериновую протеазу I из Streptomyces sp. (регистрационный № S34672), сериновую протеазу из Streptomyces lividans (регистрационный № CAD4208); предполагаемую сериновую протеазу из Streptomyces coelicolor A3(2) (регистрационный № NP_625129); предполагаемую сериновую протеазу из Streptomyces avermitilis MA-4680 (регистрационный № NP_822175); сериновую протеазу из Streptomyces lividans (регистрационный № CAD42809); предполагаемый предшественник сериновой протеазы из Streptomyces coelicolor A3(2) (регистрационный № NP_628830)). Были описаны очищенная нативная щелочная протеаза, имеющая кажущуюся молекулярную массу 19000 дальтон и выделенная из Streptomyces griseus var. alkaliphilus, и моющие композиции, содержащие ее (смотрите, например, патент США № 5646028, включенный в настоящий документ в качестве ссылки). Дополнительный штамм был выделен из образца воды и осадка озерной воды; этот штамм обозначен в настоящем документе как "штамм 1AG3". Температура толщи воды и осадка составляла 19-23ºС, pH 10,5, и проводимость воды составляла 26,1 мС см^-1.

Некоторые из протеазных ферментов, описанных в настоящем документе, обладают высокой стабильностью и протеолитической активностью. Эти ферменты применимы в различных применениях, включая, но не ограничиваясь ими, моющие композиции, корма для животных, композиции для обработки тканей и кожи, и т.д. Настоящее изобретение также относится к способам получения этих ферментов. В некоторых вариантах осуществления протеазы по настоящему изобретению находятся в чистой или относительно чистой форме.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение также относится к нуклеотидным последовательностям, которые пригодны для получения протеаз по настоящему изобретению в рекомбинантных организмах. В некоторых вариантах осуществления рекомбинантное продуцирование обеспечивает способ получения протеаз в количествах, которые являются рентабельными.

Если нет иных указаний, практика этого изобретения вовлекает общепринятые способы, широко используемые в молекулярной биологии, микробиологии и способах рекомбинантных ДНК, которые относятся к данной области. Такие способы известны специалистам в данной области и описаны в ряде книг и справочных изданий. Все патенты, патентные заявки, статьи и публикации, упомянутые в настоящем документе, как выше, так и ниже, включены в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме.

Если в настоящем документе не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, обладают тем же значением, которое обычно подразумевает специалист в области, к которой это изобретение относится. Хотя любые способы и материалы, сходные или эквивалентные способам и материалам, описанным в настоящем документе, применимы для практики этого изобретения, иллюстративные способы и материалы описаны. Таким образом, термины, определенные непосредственно ниже, более полно описаны, исходя из описания в целом. Также, как используют в настоящем документе, форма единственного числа включает форму множественного числа, если контекст явно не указывает на иное. Числовые диапазоны являются включающими числа, определяющие диапазон. Если нет иных указаний, последовательности нуклеиновых кислот представлены слева направо в ориентации от 5' к 3'; аминокислотные последовательности представлены слева направо в ориентации от N- к С-, соответственно. Следует понимать, что это изобретение не ограничивается конкретными описанными способами, протоколами и реагентами, поскольку они могут варьировать, в зависимости от условий, в которых их используют специалисты в данной области.

Для практики этого изобретения используются, если нет иных указаний, общепринятые способы очистки белков, молекулярной биологии, микробиологии, способы рекомбинантных ДНК и секвенирования белков, все из которых находятся в пределах квалификации в данной области.

Более того, заголовки, представленные в настоящем документе, не являются ограничениями различных аспектов или вариантов осуществления изобретения, которые могут существовать, исходя из описания в целом. Таким образом, термины, определенные непосредственно ниже, более подробно определены, исходя из описания в целом. Тем не менее, для облегчения понимания изобретения, ряд терминов определен ниже.

I. Определения

Как используют в настоящем документе, термины "протеаза" и "протеолитическая активность" относятся к белку или пептиду, проявляющему способность гидролизовывать пептиды или субстраты, имеющие пептидные связи. Для измерения протеолитической активности известно множество общепринятых способов, и они знакомы специалистам в данной области. Например, протеолитическую активность, как правило, устанавливают с помощью сравнительных анализов, в которых анализируется способность соответствующих протеаз гидролизовывать коммерческий субстрат. Иллюстративные субстраты, пригодные для анализа протеаз и/или протеолитической активности, включают, но не ограничиваются ими, диметилказеин (Sigma C-9801), бычий коллаген (Sigma C-9879), бычий эластин (Sigma E-1625) и бычий кератин (ICN Biomedical 902111). Колориметрические анализы с использованием этих субстратов хорошо известны в данной области (смотрите, например, WO 99/34011; и патент США № 6376450, оба из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок). Также применим анализ pNA (смотрите, например, Del Mar et al., Anal. Biochem., 99:316-320 [1979]) для определения концентрации активного фермента для фракций, собранных в ходе градиентного элюирования. В этом анализе измеряется скорость, с которой п-нитроанилин высвобождается по мере гидролиза ферментом растворимого синтетического субстрата, сукцинил-аланин-аланин-пролин-фенилаланин-п-нитроанилида (sAAPF-pNA). Скорость образования желтого цвета при реакции гидролиза измеряют при 410 нм на спектрофотометре и она пропорциональна концентрации активного фермента. Кроме того, для определения общей концентрации белка можно использовать измерение поглощения при 280 нм. Отношение активный фермент/общий белок определяет чистоту фермента.

Как используют в настоящем документе, термины штаммовая "протеаза 1AG3" относится к протеазе одного из вариантов осуществления настоящего изобретения. Протеаза дикого типа была выделена из штамма 1AG3 Streptomyces, как описано в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение относится активной форме протеазы, содержащей полипептид из 256 аминокислот. В дополнительных вариантах осуществления протеаза 1AG3 представляет собой вариант или гомолог ASP-протеазы 1AG3.

Термин "гомологи протеазы Streptomyces" относится к встречающимся в природе протеазам, имеющим аминокислотные последовательности, по существу идентичные зрелой протеазе, происходящей из штамма 1AG3 Streptomyces, и/или полинуклеотидные последовательности, которые кодируют такие встречающиеся в природе протеазы, и эти протеазы сохраняют функциональные характеристики сериновой протеазы, кодируемой такими нуклеиновыми кислотами.

"ASP-протеаза", "Asp-протеаза" и "Asp" относятся к сериновым протеазам, описанным в настоящем документе и в PCT с серийными №№ US04/39006 и US04/39066, все из которых включены в настоящий документ в качестве ссылок в полном объеме. В некоторых вариантах осуществления протеаза Asp представляет собой протеазу, обозначаемую в настоящем документе как протеаза 69B4, получаемая из штамма 69B4 Cellulomonas. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления термин "протеаза 69B4" относится к встречающейся в природе зрелой протеазе из штамма 69B4 Cellulomonas (DSM 16035), имеющей по существу идентичные аминокислотные последовательности, как указано в SEQ ID NO:25. В некоторых альтернативных вариантах осуществления настоящее изобретение относится к частям ASP-протеазы.

Термин "гомологи протеазы Cellulomonas" относится к встречающимся в природе протеазам, имеющим аминокислотные последовательности, по существу идентичные зрелой протеазе из штамма 69B4 Cellulomonas, или полинуклеотидные последовательности, которые кодируют такие встречающиеся в природе протеазы, и имеющим функциональные характеристики сериновой протеазы, кодируемой такими нуклеиновыми кислотами. В некоторых вариантах осуществления эти гомологи протеаз обозначают как "целлюломонадины".

Как используют в настоящем документе, термины "вариант 1AG3 Streptomyces", "вариант протеазы Streptomyces" и "вариант протеазы 1AG3" используют для указания на протеазы, которые сходны с протеазой 1AG3 Streptomyces дикого типа, в частности, их функцией, однако имеют мутации в их аминокислотной последовательности, которые делают их отличающимися по последовательности от протеазы дикого типа.

Как используют в настоящем документе, термины "вариант ASP", "вариант протеазы ASP" и "вариант протеазы 69B" используют для указания на протеазы, которые сходны с ASP дикого типа, в частности, их функцией, но имеют мутации в их аминокислотной последовательности, которые делают их отличающимися по последовательности от протеазы дикого типа.

Как используют в настоящем документе, термин "виды Cellulomonas" относится ко всем видам рода "Cellulomonas", которые представляют собой грамположительные бактерии, классифицируемые как члены семейства Cellulomonadaceae, подотряд Micrococcineae, отряд Actinomycetales, класс Actinobacteria. Является признанным, что род Cellulomonas продолжает претерпевать таксономическую реорганизацию. Таким образом, подразумевается, что род включает виды, которые будут переклассифицированы.

Как используют в настоящем документе, термин "виды Streptomyces" относится ко всем видам рода "Streptomyces", которые являются грамположительными бактериями, классифицируемыми как члены семейства Streptomycetaceae, подотряд Streptomycineae, отряд Actinomycetales, класс Actinobacteria. Является признанным, что род Streptomyces продолжает претерпевать таксономическую реорганизацию. Таким образом, подразумевается, что род включает виды, которые будут переклассифицированы.

Как используют в настоящем документе, "род Bacillus" включает все виды рода "Bacillus", как известно специалистам в данной области, включая, но не ограничиваясь ими, B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus и B. thuringiensis. Является общепризнанным, что род Bacillus продолжает претерпевать таксономическую реорганизацию. Таким образом, подразумевается, что род включает виды, которые будут переклассифицированы, включая, но не ограничиваясь ими, такие организмы, как B. stearothermophilus, которые в настоящее время называют "Geobacillus stearothermophilus". Получение устойчивых эндоспор в присутствии кислорода считают определяющим признаком рода Bacillus, хотя эта характеристика также применима к недавно получившим название Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus и Virgibacillus, а также к дополнительным организмам.

Термины "полинуклеотид" и "нуклеиновая кислота", используемые в настоящем документе взаимозаменяемо, относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, либо из рибонуклеотидов, либо из дезоксирибонуклеотидов. Эти термины включают, но не ограничиваются ими, одно-, двух- или трехцепочечную ДНК, геномную ДНК, кДНК, РНК, гибрид ДНК-РНК или полимер, содержащий пуриновые и пиримидиновые основания или другие природные, химически, биохимически модифицированные, неприродные нуклеотидные основания или производные нуклеотидных оснований. Ниже представлены неограничивающие примеры полинуклеотидов: гены, фрагменты генов, хромосомные фрагменты, EST, экзоны, интроны, мРНК, тРНК, рРНК, рибозимы, кДНК, рекомбинантные полинуклеотиды, разветвленные полинуклеотиды, плазмиды, векторы, выделенная ДНК с любой последовательностью, выделенная РНК с любой последовательностью, зонды нуклеиновых кислот и праймеры. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотиды содержат модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и аналоги нуклеотидов, урацил, другие сахара и линкерные группы, такие как фторрибоза и тиоат, и нуклеотидные ответвления. В альтернативных вариантах осуществления последовательность нуклеотидов прерывается ненуклеотидными компонентами.

Как используют в настоящем документе, термины "конструкция ДНК" и "трансформирующая ДНК" используют взаимозаменяемо, и они относятся к ДНК, используемой для введения последовательностей в клетку-хозяина или организм хозяина. ДНК можно создавать in vitro посредством ПЦР или любого другого пригодного способа(ов), известного специалисту в данной области. В конкретных вариантах осуществления конструкция ДНК содержит представляющую интерес последовательность (например, в качестве вводимой последовательности). В некоторых вариантах осуществления последовательность функционально связана с дополнительными элементами, такими как элементы контроля (например, промоторы и т.д.). Кроме того, конструкция ДНК может содержать селективный маркер. Кроме того, она может содержать вводимую последовательность, фланкируемую гомологичными боксами. В следующем варианте осуществления трансформирующая ДНК содержит другие негомологичные последовательности, добавляемые на концы (например, спейсерные или фланкирующие последовательности). В некоторых вариантах осуществления концы вводимой последовательности являются замкнутыми, так что трансформирующая ДНК образует замкнутую окружность. Трансформирующие последовательности могут представлять собой последовательности дикого типа, мутантные или модифицированные последовательности. В некоторых вариантах осуществления конструкция ДНК содержит последовательности, гомологичные хромосоме клетки-хозяина. В других вариантах осуществления конструкция ДНК содержит негомологичные последовательности. После сборки конструкции ДНК in vitro, ее можно использовать для: 1) встраивания гетерологичных последовательностей в требуемую последовательность-мишень или клетку-хозяина и/или 2) осуществления мутагенеза участка хромосомы клетки-хозяина (т.е. замены эндогенной последовательности гетерологичной последовательностью), 3) удаления генов-мишеней; и/или введения заменяющей плазмиды в хозяина.

Как используют в настоящем документе, термины "экспрессирующая кассета" и "экспрессирующий вектор" относятся к конструкциям нуклеиновых кислот, созданным рекомбинантно или синтетически, с серией определенных элементов нуклеиновых кислот, которые позволяют транскрипцию конкретной нуклеиновой кислоты в клетке-мишени. Рекомбинантную экспрессирующую кассету можно включать в плазмиду, хромосому, митохондриальную ДНК, пластидную ДНК, вирус или фрагмент нуклеиновой кислоты. Как правило, часть экспрессирующего вектора, представляющая собой рекомбинантную экспрессирующую кассету, включает, помимо других последовательностей, последовательность нуклеиновой кислоты, подлежащую транскрипции, и промотор. В некоторых вариантах осуществления экспрессирующие векторы обладают способностью включать в себя и экспресировать гетерологичные фрагменты ДНК в клетке-хозяине. Множество прокариотических и эукариотических экспрессирующих векторов являются коммерчески доступными. Выбор соответствующих экспрессирующих векторов относится к знаниям специалистов в данной области. Термин "экспрессирующая кассета" используют в настоящем документе взаимозаменяемо с термином "конструкция ДНК" и его грамматическими эквивалентами. Выбор соответствующих экспрессирующих векторов относится к знанию специалистов в данной области.

Как используют в настоящем документе, термин "вектор" относится к полинуклеотидной конструкции, предназначенной для введения нуклеиновых кислот в один или несколько типов клеток. Векторы включают клонирующие векторы, экспрессирующие векторы, челночные векторы, плазмиды, кассеты и т.п. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотидная конструкция содержит последовательность ДНК, кодирующую протеазу (например, предшественника протеазы или зрелую протеазу), которая функционально связана с пригодной пропоследовательностью (например, секреторной последовательностью, и т.д.), способной осуществлять экспрессию ДНК в пригодном хозяине.

Как используют в настоящем документе, термин "плазмида" относится к замкнутой двухцепочечной (ds) конструкции ДНК, используемой в качестве клонирующего вектора, и которая образует внехромосомный саморпелицирующийся генетический элемент у некоторых эукариот или прокариот, или встраивается в хромосому хозяина.

Как используют в настоящем документе в контексте введения последовательности нуклеиновой кислоты в клетку, термин "введенный" относится к любому способу, пригодному для переноса последовательности нуклеиновой кислоты в клетку. Такие способы введения включают, но не ограничиваются ими, слияние протопластов, трансфекцию, трансформацию, конъюгацию и трансдукцию (смотрите, например, Ferrari et al., "Genetics", Hardwood et al., (eds.), Bacillus, Plenum Publishing Corp, pp. 57-72, [1989]).

Как используют в настоящем документе, термины "трансформированный" и "стабильно трансформированный" относится к клетке, которая имеет ненативную (гетерологичную) полинуклеотидную последовательность, встроенную в ее геном или в качестве эписомальной плазмиды, которая сохраняется в течение по меньшей мере двух поколений.

Как используют в настоящем документе, термин "кодирующая селективный маркер нуклеотидная последовательность" относится к нуклеотидной последовательности, которая способна экспрессироваться в клетках-хозяевах, и где экспрессия селективного маркера придает клеткам, содержащим экспрессируемый ген, способность расти в присутствии соответствующего селективного агента или в отсутствие необходимых питательных веществ.

Как используют в настоящем документе, термины "селектируемый маркер" и "селективный маркер" относятся к нуклеиновой кислоте (например, гену), способной экспрессироваться в клетке-хозяине, которая обеспечивает простоту селекции этих хозяев, содержащих вектор. Примеры таких селективных маркеров включают, но не ограничиваются ими, противомикробные средства. Таким образом, термин "селективный маркер" относится к генам, которые обеспечивают указание на то, что клетка-хозяин захватила представляющую интерес вводимую ДНК или что произошла какая-либо другая реакция. Как правило, селективные маркеры представляют собой гены, которые придают противомикробную устойчивость или метаболическое преимущество клетке-хозяину, позволяя отличить клетки, содержащие экзогенную ДНК, от клеток, в которые не была введена какая-либо экзогенная последовательность в процессе трансформации. "Собственный селективный маркер" представляет собой маркер, который расположен на хромосоме микроорганизма, подлежащего трансформации. Собственный селективный маркер кодирует ген, который отличается от селективного маркера на трансформирующей конструкции ДНК. Селективные маркеры хорошо известны специалистам в данной области. Как указано выше, маркер может представлять собой маркер устойчивости к антибиотикам (например, amp^R; phleo^R; spec^R; kan^R; ery^R; tet^R; cmp^R; и neo^R; сморите, например, Guerot-Fleury, Gene, 167:335-337 [1995]; Palmeros et al., Gene 247:255-264 [2000]; и Tnieu-Cuot et al., Gene, 23:331-341 [1983]). Другие маркеры включают, но не ограничиваются ими, ауксотрофные маркеры, такие как триптофан; и маркеры для детекции, такие как β-галактозидаза.

Как используют в настоящем документе, термин "промотор" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая функционирует, направляя транскрипцию расположенного ниже гена. В некоторых вариантах осуществления промотор является подходящим для клетки-хозяина, в которой ген-мишень подлежит экспрессии. Промотор, вместе с другими транскрипционными и трансляционными регуляторными последовательностями нуклеиновых кислот (также называемыми "последовательностями контроля") необходим для экспрессии данного гена. Как правило, транскрипционные и трансляционные регуляторные последовательности включают, но не ограничиваются ими, промоторные последовательности, участки связывания рибосом, последовательности инициации и терминации транскрипции, и последовательности энхансеров или активаторов.

Нуклеиновая кислота является "функционально связанной", когда она находится в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, ДНК, кодирующая секреторную лидерную последовательность (т.е. сигнальный пептид), функционально связана с ДНК полипептида, если она экспрессируются в качестве пребелка, который участвует в секреции полипептида; промотор или энхансер является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию последовательности; или участок связывания рибосом является функционально связанным с кодирующей последовательностью, если он расположен таким образом, чтобы облегчить трансляцию. Как правило, "функционально связанный" означает, что связанные последовательности ДНК являются смежными, и, в случае секреторной лидерной последовательности, являются смежными и находятся в рамке считывания. Однако энхансеры на должны быть смежными. Связывание осуществляют посредством лигирования в соответствующих участках рестрикции. Если таких участков нет, используют синтетические олигонуклеотидные соединительные элементы или линкеры в соответствии с общепринятой практикой.

Как используют в настоящем документе, термин "ген" относится к полинуклеотиду (например, сегменту ДНК), который кодирует полипептид и включает участки, предшествующие кодирующим областям и следующие после них, а также ко встроенным в них последовательностям (интронам) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами).

Как используют в настоящем документе, термин "гомологичные гены" относится к паре генов из отличающихся, но обычно родственных видов, которые соответствуют друг другу и которые являются идентичными или очень сходными друг с другом. Термин охватывает гены, которые отличаются вследствие видообразования (т.е. развития новых видов) (например, ортологичные гены), а также гены, которые отличаются генетической дупликацией (например, паралогичные гены).

Как используют в настоящем документе, термины "ортолог" и "ортологичные гены" относятся к генам в различных видах, которые эволюционировали из общего предкового гена (т.е. гомологичного гена) вследствие видообразования. Как правило, ортологи сохраняют ту же функцию в процессе эволюции. Идентификация ортолога применима для достоверного предсказания функции гена или вновь отсеквенированных геномов.

Как используют в настоящем документе, термины "паралог" и "паралогичные гены" относятся к генам, которые являются родственными вследствие дупликации в геноме. В то время как ортологи сохраняют ту же функцию в процессе эволюции, у паралогов развиваются новые функции, даже несмотря на то, что некоторые функции часто являются сходными с исходными функциями. Примеры паралогичных генов включают, но не ограничиваются ими, гены, кодирующие трипсин, химотрипсин, эластазу и тромбин, все которых представляют собой сериновые протеазы и встречаются в одних и тех же видах.

Как используют в настоящем документе, "гомология" относится к сходству или идентичности последовательностей. Эту гомологию определяют с использованием стандартных способов, известных в данной области (смотрите, например, Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 [1981]; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol, 48:443 [1970]; Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]; программы такие как GAP, BESTFIT, FASTA и TFASTA в Wisconsin Genetics Software Package (Genetics Computer Group, Madison, WI); и Devereux et al. Nucl. Acid Res., 12:387-395 [1984]).

Как используют в настоящем документе, "аналогичная последовательность" представляет собой последовательность, где функция гена является по существу такой же, как и у гена на основе протеазы 1AG3 Streptomyces. Кроме того, аналогичные гены включают по меньшей мере приблизительно 45%, приблизительно 50%, приблизительно 55%, приблизительно 60%, приблизительно 65%, приблизительно 70%, приблизительно 75%, приблизительно 80%, приблизительно 85%, приблизительно 90%, приблизительно 95%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100% идентичность последовательностей с последовательностью протеазы 1AG3 штамма Streptomyces. Альтернативно, выравнивание аналогичных последовательностей составляет между 70 и 100% генов, находящихся в области протеазы штамма 1AG3 Streptomyces, и/или по меньшей мере между 5-10 генов, находящихся в этой области, выравниваются с генами в хромосоме штамма 1AG3 Streptomyces. В дополнительных вариантах осуществления к последовательности применимо более одного из указанных выше свойств. Аналогичные последовательности определяют известными способами выравнивания последовательностей. Широко используемым способом выравнивания является BLAST, хотя, как указано выше и ниже, существуют другие способы, которые также применимы для выравнивания последовательностей.

Одним из примеров пригодного алгоритма является PILEUP. PILEUP осуществляет множественное выравнивание последовательностей из группы родственных последовательностей с использованием прогрессирующего попарного выравнивания. Он также строит дерево, показывающее кластерную взаимосвязь, используемую для проведения выравнивания. В PILEUP используется упрощение способа про