Способ получения концентрированного иммуноглобулинового препарата для подкожного введения

Способ получения концентрированного иммуноглобулинового препарата для подкожного введения

Реферат

Изобретение относится к медицине, в частности к иммунологии, и может быть использовано для получения лечебных препаратов из плазмы крови, а именно концентрата иммуноглобулина (IgG) для подкожного введения.

Иммуноглобулин для подкожного введения является альтернативой иммуноглобулину для внутривенного введения и используется в качестве терапии возмещения антител, пожизненно, у пациентов с первичным иммунодефицитом. Подкожное введение позволяет поддерживать устойчивый уровень IgG в плазме крови человека. Лечение иммуноглобулином для подкожного введения не требует госпитализации и может быть проведено на дому, так как при этом способе введения препарат хорошо переносится пациентами.

Известен способ получения иммуноглобулинового препарата для подкожного введения, описанный Hagan J.B. с соавт. (J. Clin. Immunonol. 2010, 30: 734-745). Препарат IgG с рН 4,8 стабилизирован 28,8 мг/мл (250 ммоль/л) L-пролина, содержащего 20 мг/л твина 80.

Недостатком препарата является присутствие в препарате большого количества поверхностно-активного вещества твина 80, внесенного при сольвент/детергентной обработке.

Существует несколько методов очистки препарата от сольвента и детергента. Horowitz B., et al. (Inactivation of viruses in labile blood derivatives. I. Disruption of lipid-enveloped viruses by tri(n-butyl)phosphate detergent combinations // Transfusion. - 1985. - 25. - №6. - P.516-522) предлагают удалять ТБФ и холат натрия на сефадексе G25.

В патенте RU 2352358, кл. A61K 39/395, опубликован 20.04.2009. Бюлл. №11 предлагается экстрагировать сольвент и детергент маслом какао с температурой затвердевания не ниже 8°С. Экстракцию маслом проводят при температуре не ниже 37°С, затем смесь охлаждают при 2-8°С и оставляют до полного затвердевания масла, после чего его и образовавшийся осадок удаляют.

Недостатком этих методов является необходимость введения дополнительных методов очистки буфера и масла.

Наиболее близким к заявляемому, по технической сущности и достигаемому результату, выбранным в качестве прототипа, является способ получения иммуноглобулинового препарата из фракции II Кона (патент RU 2192279, кл. A61K 39/395 опубликован 10.11.2002. Бюлл. №31).

Способ осуществляют следующим образом. В качестве сырья используют спиртовую фракцию II Кона (IgG). Готовят раствор с концентрацией белка 0,1-8,0%, рН 6,5-7,8 и подвергают его стерилизующей фильтрации. Раствор выстаивают от 8 часов до 1 месяца, сформировавшийся осадок удаляют центрифугированием или фильтрацией. Далее в раствор добавляют суспензию гидроокиси алюминия из расчета 10-40 мл суспензии на 1 л раствора, инкубируют 3-5 часов при комнатной температуре, затем фильтруют. Затем раствор иммуноглобулина разбавляют водой и проводят ультрафильтрацию с одновременным снижением рН до 4,4-4,8 и концентрированием белка до 5,5-6,0%, после чего препарат подвергают стерилизующей фильтрации и разливают во флаконы.

Недостатком известного способа является низкая концентрация белка (5%), при которой невозможно ввести подкожно эффективную лечебную дозу препарата.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении качества препарата за счет дополнительной нейтрализации пирогенов и максимального удаления примесей сольвента детергента водными растворами при ультрафильтрации.

Указанный результат достигается тем, что в способе получения концентрированного иммуноглобулинового препарата для подкожного введения, включающем очистку фракции II Кона плазмы крови человека от нестабильных белковых примесей и липидов фракционированием в водных растворах, адсорбцию пирогенов гидроокисью алюминия, сольвент/детергентную обработку смесью трибутилфосфата и натрия холата, очистку от вирусинактивирующих реагентов, нейтрализацию пирогенов в присутствии солей, стабилизацию глицином, очистку от сольвента и детергента проводят методами глубинной фильтрации и ультрафильтрации и многократной замены растворителя при ультрафильтрации, с одновременным концентрированием раствора иммуноглобулина и освобождением препарата от фракционирующего агента и солей.

При ультрафильтрации раствор разбавляют 10-кратным объемом воды для инъекций и при рН раствора 6,3-7,5 проводят концентрирование до первоначального объема, затем в растворе устанавливают рН 4,0-5,5 постепенным добавлением 0,1 М соляной кислоты и концентрируют белок до 16,0-18,0%, а после стабилизации глицином корректируют содержание белка до 16,0%.

Нейтрализацию пирогенов проводят формированием комплексов антитело-эндотоксин, добавляя в раствор натрия хлорида до содержания 0,003-0,05%.

Сущность способа заключается в получении стабильного, 16,0% раствора IgG. Сырьем для получения препарата служит фракция II Кона (осадок B иммуноглобулинов). Фракцию II Кона плазмы крови человека очищают от нестабильных белковых примесей и липидов фракционированием в водных растворах путем растворения в воде для инъекций до концентрации белка 0,5-5,0%, рН 6,5-7,8 и стерилизующей фильтрации. Раствор выстаивают от 8 часов до 1 месяца, осадок денатурированных белков, полимеров и нестабильных примесей удаляют центрифугированием или осветляющей фильтрацией. Пирогены адсорбируют гидроокисью алюминия, внося ее в раствор из расчета 10-30 мл на 1 л раствора. Суспензию перемешивают в течение 1-5 часов при комнатной температуре (Анастасиев В.В. с соавт. «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний» изд. Нижегородского государственного университета им. Н.И.Лобачевского; 2004 г. стр.332-340), фильтруют. Затем проводят сольвент/детергентную обработку смесью трибутилфосфата и натрия холата, для создания вирусинактивирующей концентрации до содержания трибутилфосфата (ТБФ) 0,3%, натрия холата 0,2%. Смесь непрерывно перемешивают при температуре 30-37°С в течение 6 часов. Эти реагенты разрушают вирусы с липидной оболочкой. Очистка от сольвента и детергента проводится методами глубинной фильтрации и ультрафильтрации и многократной замены растворителя при ультрафильтрации. Для предотвращения остановки процесса ультрафильтрации иммуноглобулинов, при достижении концентрации белка 16,0% и выше, устанавливают в растворе рН 4,0-5,5, концентрирование белка продолжают до 16,0-18,0%. Препарат стабилизируют глицином в концентрации 0,23-0,3 М. Нейтрализацию пирогенов проводят формированием комплексов антитело-эндотоксин, добавляя в раствор натрия хлорид до содержания 0,003-0,05%. Корректируют содержание белка до 16,0%. После стерилизующей фильтрации препарат разливают в ампулы или бутылки.

Способ осуществляют следующим образом.

Спиртовую фракцию II Кона (IgG) растворяют в воде для инъекций до концентрации белка 0,5-5,0%, рН 6,5-7,8. Данные параметры являются оптимальными, так как снижение концентрации белка ниже 0,5% и рН ниже 6,5 затрудняет формирование осадка нестабильных примесей. Увеличение рН более 7,8 и концентрации более 5,0% может привести к денатурации молекул иммуноглобулинов. Раствор подвергают стерилизующей фильтрации и выстаивают в течение от 8 часов до 1 месяца при 2-8°С. Уменьшение времени выстаивания не позволяет добиться полного осаждения примесей, а увеличение сроков выстаивания более 1 месяца технологически нецелесообразно.

Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием и стерилизующей фильтрацией. Это позволяет добиться удаления примесей денатурированных и нестабильных белков, а также липопротеидов и повысить стабильность раствора. Адсорбцию пирогенов проводят гидроокисью алюминия, добавляя 10-30 мл гидроокиси на 1 л раствора, перемешивают суспензию в течение 1-5 часов при комнатной температуре. Сокращение времени инкубации менее 1 часа не позволяет добиться желаемого результата, увеличение времени более 5 часов является технологически нецелесообразным. Комплекс гель-пироген удаляют осветляющей фильтрацией. Затем проводят сольвент/детергентную обработку смесью трибутилфосфата и натрия холата, для создания вирусинактивирующей концентрации до содержания трибутилфосфата (ТБФ) 0,3%, натрия холата 0,2%, перемешивают в течение 6 часов при температуре 30-37°С.

Очистка раствора от трибутилфосфата и натрия холата в предлагаемом способе проводится методами глубинной фильтрации и ультрафильтрации и многократной замены растворителя при ультрафильтрации с одновременным концентрированием раствора иммуноглобулина и освобождением препарата от фракционирующего агента и солей. В раствор иммуноглобулинов добавляют 10-кратный объем воды для инъекций при рН 6,3-7,5, проводят концентрирование раствора ультрафильтрацией до первоначального объема. Операцию повторяют до 3-5 раз. Такое количество отмывок позволяет максимально очистить препарат от реагентов. При уменьшении количества отмывок не происходит полного удаления примесей, а увеличение количества отмывок приводит к потере целевого продукта. Затем рН раствора корректируют до 4,0-5,5 постепенным добавлением 0,1 М соляной кислоты и концентрируют белок до содержания 16,0-18,0%. Затем в раствор добавляют глицин до концентрации 0,23-03 М и натрия хлорид до 0,003-0,05%. Корректируют содержание белка до 16,0%, проводят стерилизующую фильтрацию и розлив препарата.

Пример 1. 3 кг спиртовой фракции II Кона растворяют в 15 литрах охлажденной до 2-8°С воды для инъекций. Полученный 0,5% раствор белка, рН 6,5 подвергают стерилизующей фильтрации, затем помещают в холодную камеру и выстаивают в течение 8 часов при температуре от 2 до 8°С. Образовавшийся в процессе выстаивания осадок удаляют осветляющей фильтрацией. В раствор добавляют 1,0-1,5%-ной стерильной суспензию гидроокиси алюминия, из расчета 10 мл на 1 л раствора, перемешивают 1 час при комнатной температуре. Комплекс гель-пироген (эндотоксин) удаляют центрифугированием или осветляющей фильтрацией. Затем проводят сольвент/детергентную обработку смесью трибутилфосфата и натрия холата, для создания вирусинактивирующей концентрации до содержания трибутилфосфата (ТБФ) 0,3%, натрия холата 0,2%. Смесь перемешивают в течение 6 часов при температуре 30°С. Раствор разбавляют 10-кратным объемом воды для инъекций и при рН раствора 6,3-7,5 проводят концентрирование до первоначального объема. Операцию повторяют 3 раза. После 10-кратного разбавления в 3-й раз в растворе корректируют рН до 4,0 постепенным добавлением 0,1 М соляной кислоты и продолжают процесс до достижения концентрации белка равной 16,0-18,0%. Затем в раствор добавляют глицин до концентрации 0,23-0,3 М, натрия хлорид до 0,03%. Корректируют содержание белка до 16,0%, проводят стерилизующую фильтрацию и розлив препарата.

Пример 2. Проводят аналогично примеру 1. Спиртовую фракцию II Кона растворяют в воде для инъекций, охлажденной до 2-8°С, до концентрации белка 5,0%. Полученный раствор белка рН 7,8 подвергают стерилизующей фильтрации, затем помещают в холодную камеру и выстаивают в течение 1 месяца при температуре от 2 до 8°С. Образовавшийся в процессе выстаивания осадок удаляют осветляющей фильтрацией. В раствор добавляют 1,0-1,5%-ной стерильной суспензии гидроокиси алюминия, из расчета 30 мл на 1 л раствора, перемешивают 5 часов при комнатной температуре. Комплекс гель-пироген удаляют центрифугированием или осветляющей фильтрацией. Затем проводят сольвент/детергентную обработку смесью трибутилфосфата и натрия холата для создания вирусинактивирующей концентрации до содержания трибутилфосфата (ТБФ) 0,3%, натрия холата 0,2%. Смесь перемешивают в течение 6 часов при температуре 37°С. После охлаждения раствора до комнатной температуры очистку от трибутилфосфата и натрия холата проводят методами глубинной фильтрации и ультрафильтрации и многократной замены растворителя при ультрафильтрации, с одновременным концентрированием раствора иммуноглобулина и освобождением препарата от фракционирующего агента и солей. Раствор разбавляют 10-кратным объемом воды для инъекций и при рН раствора 6,3-7,5 проводят концентрирование до первоначального объема. Операцию повторяют 5 раз. После 10-кратного разбавления в 5-й раз в растворе корректируют рН до 5,5 постепенным добавлением 0,1 М соляной кислоты и продолжают процесс до достижения концентрации белка, равной 16,0-18,0%. Затем в раствор добавляют глицин до концентрации 0,23-0,3 М, натрия хлорид до 0,05%. Корректируют содержание белка 16,0%, проводят стерилизующую фильтрацию и розлив препарата.

Данные показателей качества препаратов сведены в таблицу. Сравнительное изучение иммуноглобулина для подкожного введения препарата с прототипом -иммуноглобулином для внутривенного введения показало, что большая часть показателей иммуноглобулина для подкожного введения была близка к требованиям внутривенных иммуноглобулинов, к которым наиболее высокие требования к очистке, структуре и функциям. Так его прозрачность составляла 0,017-0,02, цветность 0,035-0,05 единицы оптической плотности. Для стабилизации молекулярного состава препарат хранился в растворе при значении рН 4,65-4,8. Содержание белка колебалось от 16,5 до 17,5%. Препараты при электрофорезе на ацетатцеллюлозной пленке содержали 98-99% гамма-глобулиновой фракции, по данным иммуноэлектрофореза имели от 1 до 2 дуги преципитации. В иммуноглобулине для подкожного введения свыше 95,8% составляли мономеры и димеры IgG. Фракция высокомолекулярных белков и полимеров не превышала 0,4%, фрагментов не более 3,4%. В то же время содержание белка было в 4,8 раз выше, чем в прототипе. Минимально допустимый уровень антител к альфа-стафилолизину был не менее 14 МЕ/мл (4 МЕ/мл в прототипе), кори 100 МЕ/мл (25 МЕ/мл в прототипе). Методом ИФА показано, что в прототипе и разработанном препарате отсутствуют HBs-антиген, антитела к вирусам гепатита С и иммунодефицита человека. И тот и другой препараты были очищены от изоагглютининов, их титры не превышали 1:16. В иммуноглобулине для подкожного введения отсутствовал токсичный трибутилфосфат, содержание натрия холата не превышало 36,4 мкг/мл. Для стабилизации иммуноглобулинов для внутривенного введения используют глицин. Содержание его в конечном продукте составляет 0,2 моля/л. Нейтрализацию пирогенов проводят формированием комплексов антитело-пироген, добавляя в раствор натрия хлорид до содержания 0,003-0,05%.

Биологическое тестирование на животных - пирогенности (наличия эндотоксинов) на кроликах, токсичности на морских свинках и белых мышах - показало, что иммуноглобулин апирогенен и нетоксичен.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить качество препарата за счет дополнительной нейтрализации пирогенов и максимального удаления примесей сольвента детергента водными растворами при ультрафильтрации.

Таблица.
Характеристика аналитических показателей качества прототипа и предлагаемого препарата
Показатель	Результаты контроля
Прототип	пример 1	пример 2
Прозрачность	0,01	0,02	0,017
Цветность	0,03	0,05	0,035
рН	4,7	4,8	4,65
Белок (%)	5,4	16,5	17,5
Электрофоретическая однородность (%)	99	99,0	98,0
Молекулярные параметры:
Мономеры и димеры (%);	99,4	97,3	95,8
Полимеры - (%);	0,3	0,4	0,8
Фрагменты - (%).	0,3	2,3	3,4
Фракционный состав	1 дуга	2 дуги	2 дуги
Термостабильность	Стабилен	Стабилен	Стабилен
Специфическая активность:
-антиальфастафилолизин (МЕ/мл),	4	14	14
-антитела к вирусу кори (МЕ/мл)	25	100	100
Осмолярность (мОсмоль/л)	295	278,6	286,0
Анти-А, анти-В	1:16	1:16	1:4
гемагглютинины (титр)	1:8	1:8	1:8
Стабилизатор	Мальтоза 8,6%	Глицин 0,2 моль/л Натрия хлорид 0,003%	Глицин 0,2 моль/лНатрия хлорид 0,05%
Трибутилфосфат (мкг/мл)	1,20	Отсутствует	Отсутствует
Натрия холат (мкг/мл)	76,6	20,1	36.4
Стерильность	Стерилен	Стерилен	Стерилен
Пирогенность	Апирогенен	Апирогенен	Апирогенен
Аномальная токсичность	Атоксичен	Атоксичен	Атоксичен
Поверхностный антиген вируса гепатита В (HBsAg)	Отсутствует	Отсутствует	Отсутствует
Антитела к вирусу гепатита С	Отсутствуют	Отсутствуют	Отсутствуют
Антитела к вирусам иммунодефицита человека (ВИЧ-1, ВИЧ-2)	Отсутствуют	Отсутствуют	Отсутствуют

1. Способ получения концентрированного иммуноглобулинового препарата для подкожного введения, включающий очистку фракции II Кона плазмы крови человека от нестабильных белковых примесей и липидов фракционированием в водных растворах, адсорбцию пирогенов гидроокисью алюминия, сольвент/детергентную обработку смесью трибутилфосфата и натрия холата, очистку от вирусинактивирующих реагентов, нейтрализацию пирогенов в присутствии солей, стабилизацию глицином, отличающийся тем, что очистку от сольвента и детергента проводят методами глубинной фильтрации и ультрафильтрации и многократной замены растворителя при ультрафильтрации, с одновременным концентрированием раствора иммуноглобулина и освобождением препарата от фракционирующего агента и солей.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что при ультрафильтрации раствор разбавляют 10-кратным объемом воды для инъекций и при рН раствора 6,3-7,5 проводят концентрирование до первоначального объема, затем в растворе устанавливают рН 4,0-5,5 постепенным добавлением 0,1 М соляной кислоты и концентрируют белок до 16,0-18,0%, а после стабилизации глицином корректируют содержание белка до 16,0%.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что нейтрализацию пирогенов проводят формированием комплексов антитело-эндотоксин, добавляя в раствор натрия хлорида до содержания 0,003-0,05%.