Пептид foxm1 и включающее его медицинское средство

Пептид foxm1 и включающее его медицинское средство

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к новым пептидам, которые пригодны в качестве вакцин против типов рака, в высокой степени экспрессирующих вилкоголовый фактор с блоком M1 (FOXM1), таких как рак желчевыводящих путей, рак легких и рак поджелудочной железы, и к фармацевтическим средствам, включающим пептиды, для лечения и профилактики опухолей.

Известный уровень техники

Количество смертей от вариантов рака желчевыводящих путей (рака желчного пузыря и холангиокарциномы) в Японии растет и 16586 человек умерло от рака в 2005 г. В большинстве случаев рака желчевыводящих путей никаких субъективных симптомов на ранних стадиях не присутствует. По сравнению с типами рака, которые возникают внутри пищеварительного тракта, такими как рак желудка и рак ободочной кишки, точная визуализация и диагностическая визуализация рака желчевыводящих путей затруднена. Следовательно, раннее обнаружение рака желчевыводящих путей затруднено и часто рак уже прогрессировал и является неоперабельным при выявлении. Кроме хирургического вмешательства для лечения рака желчевыводящих путей проводят лучевую терапию и химиотерапию, но они не являются терапевтически эффективными и, таким образом, создание новых терапевтических методов является неотложной необходимостью.

Смертность от рака легких также увеличивается в Японии и 62063 человека умерли от рака в 2005 г. В настоящее время рак легких составляет 19,0% смертей от рака в Японии и он стал лидирующей причиной смерти от рака с 2000 г. Курение считается главной причиной возникновения рака легких. Кроме курения вдыхание асбеста или радона также рассматривается как причина рака легких. В качестве мер по предотвращению рака легких поощряется прекращение курения и осуществление медицинских осмотров. Однако, хотя она снижается, популяция курящих в Японии в 2005 г. все еще насчитывает приблизительно 30 миллионов. Более того, недавно было показано, что простой рентген грудной клетки и тестирование мокроты, широко применяемые при медицинских обследованиях, не эффективны для раннего выявления рака легких, и, следовательно, они не ведут к снижению смертности от рака. Учитывая представленное выше, предсказывается, что количество смертей от рака легких будет продолжать расти в будущем.

Симптомы рака легких включают кашель, мокроту с кровью, одышку и боль в груди, но в большинстве случаев на ранних стадиях симптомы отсутствуют. Когда появляются симптомы, во многих случаях рак уже прогрессировал. Следовательно, более половины больных являются неоперабельными при первичном обнаружении рака, и он рассматривается как один из неподатливых типов рака. Скорость восстановления после операции не настолько хороша как при других типах рака, и суммарный пятилетний коэффициент выживаемости после хирургического вмешательства мал и составляет только 50%. В последние годы пятилетний коэффициент выживаемости для ранних стадий рака легких повышается благодаря достижениям комплексного лечения с помощью лучевой терапии, химиотерапии и тому подобного с использованием в качестве главного лечения хирургической резекции; однако, улучшение терапевтических эффектов в случае прогрессировавшего рака легких недостаточно и создание новых терапевтических стратегий является неотложной необходимостью.

Количество смертей от рака поджелудочной железы также увеличивается в Японии и 22927 человека умерло от рака в 2005 г. В настоящее время рак поджелудочной железы составляет 7,0% смертей от рака в Японии и занимает пятое место после рака легких, рака желудка, рака ободочной кишки и рака печени. Не существует симптомов, специфичных для рака поджелудочной железы, и во многих случаях, когда появляются симптомы, рак уже прогрессировал. Даже в настоящее время при наличии достижений в диагностической визуализации 40% всех больных раком поджелудочной железы в Японии относятся к прогрессирующим случаям болезни с отдаленными метастазами, и многие больные, как обнаружено, обладают неоперабельным местно прогрессирующим раком. Следовательно, суммарный пятилетний коэффициент выживаемости больных составляет 5% или менее и прогноз после диагноза является очень плохим. Из-за трудности диагностики заболеваемость раком поджелудочной железы как причина смерти от рака постепенно повышается, особенно в промышленно развитых странах. Хотя в настоящее время осуществляется комплексное лечение с помощью лучевой терапии, химиотерапии и тому подобного с использованием в качестве основного лечения хирургической резекции, не существует решающего улучшения терапевтических эффектов, и создание новых терапевтических стратегий является неотложной необходимостью. Различные факторы, такие как привычки образа жизни, включая курение, ожирение, диету, употребление алкоголя и употребление кофе, а также хронический панкреатит, диабет, генетические факторы и тому подобное, как предполагается, связаны с причинами возникновения рака поджелудочной железы.

С другой стороны, последние разработки в молекулярной биологии и иммунологии опухолей показали, что цитотоксические (киллерные) Т-клетки и хелперные Т-клетки узнают пептиды, образованные при деградации белков, которые специфически и в высокой степени экспрессируются в раковых клетках и которые презентируются на поверхности раковых клеток или антигенпрезентирующих клеток с помощью молекул HLA, и вызывают иммунологическую реакцию с разрушением раковых клеток. Более того, многие опухолевые белки-антигены и производные от них пептиды, которые стимулируют такую иммунологическую реакцию для борьбы с раком, идентифицированы, и антигенспецифическая терапия опухолей применяется клинически.

Молекула класса I HLA экспрессируется на поверхности всех имеющих ядро клеток организма. Она связывается с пептидом, появляющимся в результате внутриклеточной деградации белков, продуцируемых в цитоплазме или ядре, и экспрессирует пептид на клеточной поверхности. На поверхности нормальной клетки с молекулами класса I HLA связаны пептиды, происходящие от нормальных аутологичных белков, и они не узнаются и не разрушаются Т-клетками иммунной системы. С другой стороны, в процессе превращения в рак раковые клетки иногда экспрессируют большое количество белков, которые почти не экспрессируются или незначительно экспрессируются в нормальных клетках. Когда молекулы класса I HLA связываются с пептидами, возникшими в результате внутриклеточной деградации белков, специфически и в высокой степени экспрессирующихся в раковых клетках, и затем экспрессируют пептиды на поверхности раковых клеток, Т-клетки-киллеры узнают и разрушают только раковые клетки. С помощью введения таких специфичных для рака антигенов или пептидов индивидууму раковые клетки могут быть разрушены, и рост раковой опухоли может быть подавлен без вреда для нормальных клеток. Это называется иммунотерапией рака с использованием канцероспецифичных антигенов. Молекулы класса II HLA экспрессируются главным образом на поверхности антигенпрезентирующих клеток. Молекулы связываются с пептидами, происходящими от канцероспецифичных антигенов, которые возникают в результате внутриклеточной деградации канцероспецифичных антигенов, включенных в антигенпрезентирующие клетки после поступления из внеклеточного окружения, и затем экспонируют пептиды на поверхности клеток. Хелперные Т-клетки, которые их узнают, активируются и индуцируют или усиливают иммунную реакцию против опухолей с помощью продукции различных цитокинов, которые активируют другие иммунокомпетентные клетки.

Соответственно, если разрабатывается иммунотерапия, которая направлена на антигены, специфически и в высокой степени экспрессирующиеся при типах рака, такая терапия может эффективно уничтожать только типы рака, не вызывая какого-либо вредного эффекта в нормальных аутологичных органах. Предполагается также, что терапия может быть полезна для любых больных с терминальной стадией рака, к которым не могут быть применены другие способы лечения. Кроме того, с помощью введения канцероспецифичного антигена и пептида в виде вакцины заранее индивидуумам с высоким риском развития рака развитие рака может быть предотвращено.

Авторы настоящего изобретения сначала провели широкий геномный анализ экспрессии генов на 27648 генах человека с использованием микроматриц кДНК для исследования экспрессионных профилей этих генов в 25 случаях рака внутрипеченочных желчных протоков и в различных нормальных органах, включая органы в эмбриональной стадии. В результате авторы настоящего изобретения раскрыли, что вилкоголовый фактор с блоком m1 (FOXM1) (GenBank No. поступления NM_202003) в высокой степени экспрессировался в тканях во многих случаях рака внутрипеченочных желчных протоков. Сходно с этим и в дополнение к раку внутрипеченочных желчных протоков FOXM1, как обнаружено, в высокой степени экспрессируется почти во всех случаях рака легких, рака мочевого пузыря и рака поджелудочной железы. Более того, высокая экспрессия FOXM1 была обнаружена в 40% или более случаев широкого спектра типов рака, таких как рак шейки матки, рак яичников, злокачественная лимфома, рак молочной железы, рак желудка, рак пищевода, рак простаты, гепатоцеллюлярная карцинома, рак ободочной кишки и хронический миелоидный лейкоз. Эти факты предполагают, что FOXM1 может служить в качестве канцероспецифического антигена при различных типах рака. FOXM1 экспрессируется в эмбриональной печени и в нормальных органах взрослого человека, он незначительно экспрессируется в органах пищеварительного тракта, таких как желудок, тонкий кишечник и толстый кишечник, тимусе и семенниках; однако, уровень экспрессии существенно ниже по сравнению с опухолевыми участками.

Примеры документов, указывающих на то, что FOXM1 относится к возникновению рака и регуляции клеточной пролиферации, включают непатентные документы 1-10. Однако ни один из этих документов не описывает использование FOXM1 в качестве вакцины против рака.

[Непатентный документ 1] Yoshida Y, Wang I-C, Yoder HM, Davidson NO, Costa RH.: The forkhead box Ml transcription factor contributes to the development and growth of mouse colorectal cancer. Gastroenterology 132: 1420-1431, 2007.

[Непатентный документ 2] Gusarcova GA, Wang I-C, Major ML, Kalinichenko VV, Ackerson T, Petrovi V, Costa RH.: A cell-penetrating ARF peptide inhibitor of FOXM1 in mouse hepatocellular carcinoma treatment. J. Clin. Invest. 117: 99-111, 2007.

[Непатентный документ 3] Radhakrishnan SK, Bhat UG, Hughes DE, Wang I-C, Costa RH, Gartel AL.: Identification of a chemical inhibitor of the oncogenic transcription factor forkhead box Ml. Cancer Res. 66: 9731-9735, 2006.

[Непатентный документ 4] Takahashi К, Furukawa С, Takano A, Ishikawa N, Kato T, Hamaya S, Suzuki C, Yasui W, Inai K, Sone S, Ito T, Nishimura H, Tsuchiya E, Nakamura Y, Daigo Y.: The neuromedin U-growth hormone secretagogue receptor 1b/neurotensin receptor 1 oncogenic signaling pathway as a therapeutic target for lung cancer. Cancer Res. 66: 9408-9419, 2006.

[Непатентный документ 5] Kim I-M, Ackerson Т, Ramakrishna S, Tretiakova M, Wang I-C, Kalin TV, Major ML, Gusarova GA, Yoder HM, Costa RH, Kalinichenko VV.: The forkhead box ml transcription factor stimulates the proliferation of tumor cells during development of lung cancer. Cancer Res. 66: 2153-2161, 2006.

[Непатентный документ 6] Wonsey DR, Folletie M.: Loss of the forkhead transcription factor FoxM1 causes centrosome amplification and mitotic catastrophe. Cancer Res. 65: 5181-5189, 2005.

[Непатентный документ 7] Obama K, Ura K, Li M, Katagiri T, Tsunoda T, Nomura A, Satoh S, Nakamura Y, Furukawa Y: Genome-wide analysis of gene expression in human intrahepatic cholangiocarcinoma. Hepatology 41: 1339-1348, 2005.

[Непатентный документ 8] Laoukili J, Kooistra MRH, Bras A, Kauw J, Kerkhoven RM, Morrison A, Clevers H, Medema RH.: Foxm1 is required for execution of the mitotic programme and chromosome stability. Nature Cell Biol. 7: 126-136, 2005.

[Непатентный документ 9] Kalinichenko VV, Major M, Wang X, Petrovic V, Kuechle J, Yoder HM, Shin B, Datta A, Raychaudhuri P, Costa RH.: Foxm1b transcription factor is essential for development of hepatocellular carcinomas and is negatively regulated by the p19^ARF tumor suppressor. Genes Dev. 18: 830-850, 2004.

[Непатентный документ 10] Wang X, Kiyokawa H, Dennewitz MB, Costa RH.: The forkhead box mlb transcription factor is essential for hepatocyte DNA replication and mitosis during mouse liver regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 16881-16886, 2002.

Раскрытие изобретения

[Задачи, решаемые изобретением]

Целью настоящего изобретения является разработка способов осуществления иммунотерапии, которая подавляет рост рака путем повышения противоракового иммунитета больных раком, в качестве нового терапевтического метода лечения метастазирующего или неподатливого типов рака, лечение которых с помощью хирургического вмешательства, химиотерапии и лучевой терапии затруднено, которые осуществляются в качестве терапевтических методов для рака желчевыводящих путей, рака легких, рака поджелудочной железы и тому подобного. Более конкретно, целью настоящего изобретения является идентификация пептидов, которые происходят от белков, в высокой степени и специфично экспрессируемых при типах рака, и могут индуцировать сильную иммунную реакцию против указанных выше типов рака без индукции неблагоприятных эффектов у больных раком, и к применению этих пептидов для иммунотерапии опухолей. Настоящее изобретение дает возможность применения иммунотерапии у приблизительно 30% японцев, больных указанными выше типами рака, путем идентификации пептидов, которые происходят от белка, в высокой степени и специфично экспрессируемого в указанных выше типах рака, и презентируются Т-клеткам-киллерам с помощью HLA-A2.

[Способы осуществления]

В настоящем изобретении авторы индуцировали специфичные для пептида FOXM1 Т-клетки-киллеры путем стимуляции in vitro CD8-позитивных Т-клеток-киллеров человека с помощью их совместного культивирования с дендритными клетками, происходящими от моноцитов периферической крови человека, пульсированными пептидами FOXM1 человека, которые обладают HLA-A2-связывающим мотивом. Будет или нет происходить индукция Т-клеток-киллеров, специфичных для каждого пептида FOXM1, проверяли с помощью определения γ-интерферона (IFN-γ), продуцируемого Т-клетками-киллерами, активированными в результате узнавания пептида, презентируемого с помощью HLA-A2, с использованием теста ELISPOT. В результате были идентифицированы новые пептиды FOXM1, которые являются потенциальными кандидатными антигенами-мишенями, применимыми для иммунотерапии. Более того, было установлено, что CTL, отвечающие на FOXM1, индуцированные с использованием указанных выше пептидов, обладают специфической цитотоксичностью против раковых клеток, экспрессирующих эндогенные молекулы FOXM1 и HLA-A2, и что CTL узнают клетки-мишени способом, ограниченным классом I HLA.

Более конкретно, в настоящем изобретении предлагается следующее:

[1] пептид (А) или (В) ниже:

(A) пептид, включающий любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:1-3;

(B) пептид, который включает любую аминокислотную последовательность из SEQ ID NO:1-3, где одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены и где пептид проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки;

[2] пептид по [1], где вторая аминокислота с N-конца представляет собой лейцин или метионин;

[3] пептид по [1], где С-концевая аминокислота представляет собой валин или лейцин;

[4] средство для индукции иммунитета против рака, которое включает один или более пептидов по [1] в качестве активного ингредиента;

[5] средство для лечения и/или профилактики рака, которое включает один или более пептидов по [1] в качестве активного ингредиента;

[6] средство для индукции антигенпрезентирующей клетки, которое проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, где указанное средство включает один или более пептидов по [1] в качестве активного ингредиента;

[7] средство для индукции антигенпрезентирующей клетки, который проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, где указанное средство включает один или более полинуклеотидов, кодирующих пептид по [1], в качестве активного ингредиента;

[8] средство для индукции цитотоксической (киллерной) Т-клетки, где указанное средство включает один или более пептидов по [1] в качестве активного ингредиента;

[9] антитело против пептида по [1];

[10] цитотоксическая (киллерная) Т-клетка, хелперная Т-клетка или включающая их популяция иммуноцитов, которые индуцируются с использованием пептида по [1];

[11] антигенпрезентирующая клетка, которая презентирует комплекс, включающий пептид по [1] и антиген HLA;

[12] антигенпрезентирующая клетка по [11], которая индуцируется средством по [6] или [7];

[13] экзосома, которая презентирует комплекс, включающий пептид по [1] и антиген HLA;

[14] экзосома по [13], где антиген HLA представляет собой HLA-A2 (HLA-A*0201);

[15] способ индукции антигенпрезентирующей клетки, которая проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, который включает стадию контактирования антигенпрезентирующей клетки с пептидом по [1];

[16] способ индукции антигенпрезентирующей клетки, которая проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки, который включает стадию введения полинуклеотида, кодирующего пептид по [1], в антигенпрезентирующую клетку;

[17] способ индукции цитотоксической (киллерной) Т-клетки, который включает стадию контактирования Т-клетки с пептидом по [1].

В настоящем изобретении также предлагается следующее:

[18] способ индукции иммунитета против рака, который включает стадию введения пептида по [1] индивидууму;

[19] способ лечения и/или профилактики рака, который включает стадию введения пептида по [1] индивидууму;

[20] применение пептида по [1] для получения средства для индукции иммунитета против рака;

[21] применение пептида по [1] для получения средства для лечения и/или профилактики рака;

[22] пептид по [1] для индукции иммунитета против рака;

[23] пептид по [1] для лечения и/или профилактики рака.

Краткое описание фигур

На фиг.1 представлены результаты теста ELISPOT и теста цитотоксичности. CD8-позитивные Т-клетки выделяли из периферической крови HLA-A2-позитивных здоровых индивидуумов и больных раком молочной железы. Т-клетки-киллеры, полученные в результате стимуляции происходящих из моноцитов дендритных клеток, пульсированных каждым пептидом FOXM1, проверяли с помощью метода ELISPOT для определения реагируют ли они специфически на пептиды FOXM1 и продуцируют ли IFN-γ. Более того, с помощью теста цитотоксичности проверяли, будут или нет экспрессирующие FOXM1 клетки специфически повреждаться ограниченным HLA-A2 образом. Клетки Т2-А2 использовали в качестве клеток-мишеней в методе ELISPOT. Клетки Т2-А2 представляют собой клеточную линию, полученную путем введения гена HLA-A2 в линию клеток Т2 мыши с дефицитом экспрессии гена ТАР. Благодаря дефициту ТАР в клетках Т2-А2 комплекс, образованный молекулой HLA-A2 и экзогенно добавленным пептидом, экспрессируется на клеточной поверхности только тогда, когда пептид обладает способностью связываться с молекулой HLA-A2. Для оценки цитотоксической активности использовали клетки Раnс-1, которые являются HLA-A2-позитивными и экспрессируют FOXM1, и клетки РК-8, которые являются HLA-A2-негативными и FOXM1-позитивными. В результате Т-клетки-киллеры от двух здоровых индивидуумов, индуцированные с использованием пептидов FOXM1 362-370, 373-382 и 640-649, продуцировали IFN-γ в результате узнавания пептидов 362-370, 373-382 и 640-649, связанных с HLA-А2 и экспрессируемых на клетках Т2-А2. Более того, Т-клетки-киллеры от больных раком молочной железы, которые были индуцированы с использованием указанных выше пептидов, проявляли сильную цитотоксическую активность против клеток panc-1, но не проявляли цитотоксической активности против клеток РК-8. Таким образом, индуцированные Т-клетки-киллеры, как обнаружено, проявляют сильную цитотоксическую активность против раковых клеточных линий в результате специфического узнавания FOXM1 ограниченным HLA-A2 образом. Из представленного выше выяснено, что пептиды FOXM1 362-370, 373-382 и 640-649 могут индуцировать специфические в отношении FOXM1 Т-клетки-киллеры человека ограниченным HLA-A2 образом и что такие Т-клетки-киллеры могут повреждать экспрессирующие FOXM1 раковые клетки.

Способ осуществления изобретения

Если не указано иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют такое же значение, что и обычно понимаемое специалистом в той области техники, к которой принадлежит настоящее изобретение.

Пептиды по настоящему изобретению представляют собой эпитопы, ограниченные HLA-A2, который является аллелем HLA, часто обнаруживаемым в популяциях японцев и людей белой расы. Используя связывающее сродство к HLA-A2 в качестве индекса, отбирали кандидатные пептиды, связывающие HLA-A2, происходящие от FOXM1. Т-клетки-киллеры от двух здоровых индивидуумов, которые были индуцированы с использованием пептидов FOXM1 362-370, 373-382 и 640-649 продуцировали IFN-γ в результате узнавания пептидов FOXM1 362-370 (YLVPIQFPV (SEQ ID NO:1)), FOXM1-373-382 (SLVLQPSVKV (SEQ ID NO:2)) и FOXM1-640-649 (GLMDLSTTPL (SEQ ID NO:3)), связанных с HLA-A2 и экспрессируемых на клетках Т2-А2. Т-клетки-киллеры от больных раком молочной железы, которые были индуцированы с использованием указанных выше пептидов, проявляли сильную цитотоксическую активность против клеток раnс-1, но не проявляли цитотоксической активности против клеток РК-8. Таким образом, индуцированные Т-клетки-киллеры, как показано, специфически узнают FOXM1 ограниченным HLA-A2 образом и проявляют сильную цитотоксическую активность против раковых клеточных линий. Соответственно, обнаружено, что любой из пептидов FOXM1-362-370 (YLVPIQFPV (SEQ ID NO:1)), FOXM1-373-382 (SLVLQPSVKV (SEQ ID NO:2)) и FOXM1-640-649 (GLMDLSTTPL (SEQ ID NO:3)) может индуцировать специфические в отношении FOXM1 Т-клетки-киллеры человека ограниченным HLA-A2 образом и что такие Т-клетки-киллеры могут повреждать экспрессирующие FOXM1 раковые клетки. FOXM1, как показано, в высокой степени экспрессируется почти во всех случаях рака легких, рака мочевого пузыря и рака поджелудочной железы, сходно и в дополнение к раку внутрипеченочных желчных протоков. Более того, FOXM1 в высокой степени экспрессируется в 40% или более случаев широкого спектра типов рака, таких как рак шейки матки, рак яичников, злокачественная лимфома, рак молочной железы, рак желудка, рак пищевода, рак простаты, гепатоцеллюлярная карцинома, рак ободочной кишки и хронический миелоидный лейкоз. Эти факты показывают, что FOXM1 пригоден в качестве мишени для иммунотерапии различных типов рака.

(1) Пептиды по настоящему изобретению и включающие их средства для индукции иммунитета против рака

Пептид по настоящему изобретению является любым из от (А) до (D) ниже:

(A) пептид, содержащий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-3;

(B) пептид, который содержит любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-3, где одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены и где пептид проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки;

(C) пептид по (В), в котором вторая аминокислота с N-конца представляет собой лейцин или метионин; и

(D) пептид по (В), в котором С-концевая аминокислота представляет собой валин или лейцин.

В настоящем документе «пептид, который проявляет активность, индуцирующую цитотоксические (киллерные) Т-клетки», означает «пептид, обладающий индуцирующей Т-клетки активностью, который стимулирует Т-клетки-киллеры (цитотоксические Т-клетки/CTL)».

Пептид по настоящему изобретению является пептидом (эпитопным пептидом), содержащим менее 40 аминокислот, предпочтительно менее 20 аминокислот, более предпочтительно менее приблизительно 15 аминокислот, и включающим любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-3 и проявляющим активность в виде индукции Т-клеток-киллеров. Альтернативно, пептиды по настоящему изобретению (эпитопные пептиды) могут включать пептид, содержащий любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-3, где одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены до тех пор, пока сохраняется способность индуцировать Т-клетки-киллеры. Количество замененных, удаленных, вставленных и/или добавленных остатков обычно составляет пять аминокислот или менее, предпочтительно четыре аминокислоты или менее, более предпочтительно три аминокислоты или менее, даже более предпочтительно одну аминокислоту или две аминокислоты.

Варианты пептидов (т.е. пептиды, содержащие аминокислотные последовательности, полученные в результате модификации исходных аминокислотных последовательностей путем замены, делеции, вставки и/или добавления одного, двух или нескольких аминокислотных остатков), как известно, сохраняют исходную биологическую активность (Mark DF et al., (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:5662-6; Zoller MJ and Smith M, (1982) Nucleic Acids Res 10:6487-500; Dalbadie-McFarland G et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA 79:6409-13). Аминокислотная модификация предпочтительно сохраняет свойства исходных аминокислотных боковых цепей. Примеры свойств аминокислотных боковых цепей представлены ниже: аминокислоты с гидрофобными боковыми цепями (A, I, L, M, F, Р, W, Y, V); аминокислоты с гидрофильными боковыми цепями (R, D, N, С, Е, Q, G, Н, K, S, Т); и боковые цепи, обладающие следующими функциональными группами или характеристиками в целом: алифатические боковые цепи (G, А, V, L, I, P); боковые цепи, содержащие гидроксильные группы (S, Т, Y); боковые цепи, содержащие атом серы (С, М); боковые цепи, содержащие карбоновые кислоты и амиды (D, N, Е, Q); боковые цепи, содержащие основания (R, K, Н); и боковые цепи, содержащие ароматические кольца (Н, F, Y, W). Буквы в скобках представляют собой однобуквенные коды аминокислот.

В предпочтительном варианте осуществления пептиды по настоящему изобретению (иммуногенные пептиды) представляют собой нонапептиды (9-членные) или декапептиды (10-членные).

Для получения пептидов с высоким связывающим сродством и активностью, индуцирующей Т-клетки-киллеры, аминокислотная последовательность пептида - части природного FOXM1 может быть модифицирована путем замены, делеции, вставки и/или добавления одной, двух или нескольких аминокислот. В настоящем документе термин «несколько» относится к пяти или менее, предпочтительно к трем или менее, более предпочтительно к двум или менее. Более того, так как известна упорядоченность пептидных последовательностей, которые обладают высоким сродством к антигенам HLA (Kubo RT, et al., (1994) J. Immunol., 152, 3913-24; Rammensee HG, et al., (1995) Immunogenetics. 41:178-228; Kondo A, et al. (1995) J. Immunol. 155:4307-12), пептиды по настоящему изобретению (эпитопные пептиды) могут быть модифицированы на основе упорядоченности для того, чтобы повысить их сродство к антигенам HLA. Например, пептиды с высоким связывающим сродством к HLA-A2 могут быть получены путем замены второй аминокислоты с N-конца на лейцин или метионин. Сходно, пептиды с высоким связывающим сродством к HLA-A2 могут быть также получены путем замены С-концевой аминокислоты на валин или лейцин.

Когда последовательность эпитопного пептида идентична части аминокислотной последовательности эндогенного или экзогенного белка, обладающего отличной функцией, могут вызываться побочные эффекты, такие как аутоиммунные нарушения или аллергические симптомы против конкретного вещества. Для того чтобы избежать таких побочных эффектов модифицированный эпитопный пептид не должен быть идентичным аминокислотным последовательностям известных белков. Для этой цели необходимо осуществить поиск гомологии с использованием доступных баз данных для подтверждения того, что не существует эндогенного или экзогенного белка с отличной функцией, который имеет 100% гомологию с модифицированным эпитопным пептидом. С помощью этой процедуры можно избежать рисков, обусловленных указанной выше модификацией аминокислотной последовательности для повышения связывающего сродства к антигенам HLA и/или повышения активности, индуцирующей Т-клетки-киллеры.

Хотя указанные выше пептиды, обладающие высоким связывающим сродством к антигенам HLA, как предполагается, являются высокоэффективными в качестве вакцин против рака, кандидатные пептиды, отобранные с использованием в качестве показателя высокое связывающее сродство, необходимо проверить, обладают ли они действительно активностью, индуцирующей Т-клетки-киллеры. Активность, индуцирующая Т-клетки-киллеры, может быть подтверждена с помощью: индукции антигенпрезентирующих клеток, обладающих антигеном МНС человека (например, В-лимфоцитов, макрофагов и дендритных клеток), и более конкретно индукции дендритных клеток, происходящих от мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека; стимуляции их интересующим пептидом; затем смешивания их с CD8-позитивными клетками; и измерения цитотоксической активности в отношении клеток-мишеней. В качестве реакционной системы могут быть использованы трансгенные животные, которые экспрессируют антиген HLA человека (как описано, например, в BenMohamed L, et al. (2000) Hum. Immunol. 61 (8): 764-79, относящихся к этому статьях, книгах и адресах связи). Например, клетки-мишени могут быть помечены радиоактивным изотопом ⁵¹Cr или тому подобным, и цитотоксическая активность может быть рассчитана по радиоактивности, высвобождаемой из клеток-мишеней. Альтернативно, клетки-мишени могут быть проверены с помощью: измерения IFN-γ, продуцируемого и секретируемого Т-клетками-киллерами в присутствии антигенпрезентирующих клеток, обладающих иммобилизованным пептидом; и визуализации зоны продукции IFN-γ в культуральной среде с использованием моноклонального антитела против IFN-γ.

Как показано в примерах, данные по тестированию активности пептидов, индуцирующей Т-клетки-киллеры, продемонстрировали, что пептиды, обладающие высоким связывающим сродством к антигену HLA, не обязательно обладают высокой индуцирующей активностью. Однако нонапептиды, содержащие любую из аминокислотных последовательностей FOXM1-362-370 (YLVPIQFPV (SEQ ID NO:1)), FOXM1-373-382 (SLVLQPSVKV (SEQ ID NO:2)) и FOXM1 640-649 (GLMDLSTTPL (SEQ ID NO:3)) проявили особенно высокую активность, индуцирующую Т-клетки-киллеры.

Как описано выше, в настоящем изобретении предлагаются пептиды, проявляющие активность, индуцирующую Т-клетки-киллеры, более конкретно, пептиды, содержащие любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-3 и их варианты (т.е. аминокислотные последовательности, в которых одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены). Предпочтительно, аминокислотные последовательности пептидов, содержащие девять аминокислот любой из SEQ ID NO:1-3, или их варианты не идентичны последовательностям других эндогенных белков. Особенно пептиды с высоким связывающим сродством к HLA-A2 могут быть получены путем замены второй аминокислоты с N-конца на лейцин или метионин и/или путем замены С-концевой аминокислоты на валин или лейцин.

Пептиды по настоящему изобретению могут включать модификации, такие как гликозилирование, окисление боковой цепи и фосфорилирование, до тех пор, пока пептиды не потеряют свою активность, индуцирующую Т-клетки-киллеры. Другие модификации включают, например, D-аминокислоты и другие аминокислотные аналоги, которые могут быть использованы для повышения периода полужизни пептидов в сыворотке.

Методы получения и продукции пептидов по настоящему изобретению особенно не ограничены. Они могут представлять собой химически синтезированные пептиды или рекомбинантные пептиды, продуцируемые с помощью методов рекомбинации генов.

Химически синтезированные пептиды по настоящему изобретению могут быть синтезированы в соответствии с методами химического синтеза, такими как метод Fmoc (флуоренилметилоксикарбонильный метод) и метод t-Boc (трет-бутилоксикарбонильный метод). Пептиды по настоящему изобретению могут быть также синтезированы с использованием различных имеющихся в продаже пептидных синтезаторов.

Пептиды по настоящему изобретению могут быть получены в виде рекомбинантных белков с помощью получения ДНК, обладающих нуклеотидными последовательностями, кодирующими пептиды или их варианты или гомологи, и введения их в подходящую экспрессионную систему.

Используемые экспрессионные векторы могут быть предпочтительно любыми векторами, которые могут автономно дуплицироваться в клетках-хозяевах или могут быть включены в хромосому клеток-хозяев и содержат промотор в положении, подходящем для разрешения экспрессии гена, кодирующего пептид. Трансформированные клетки, обладающие геном, кодирующим пептид по настоящему изобретению, могут быть получены путем введения указанного выше экспрессионного вектора хозяину. Хозяин может представлять собой любое из бактерий, дрожжей, животных клеток и клеток насекомых, и экспрессионный вектор может быть введен хозяину с использованием известных способов в зависимости от хозяина.

В настоящем изобретении рекомбинантные пептиды могут быть выделены путем культивирования трансформированных клеток, полученных, как описано выше, продукции и накопления пептидов в культуре и получения пептидов по настоящему изобретению из культуры.

Когда трансформированной клеткой является прокариот, такой как Е.coli, или эукариот, такой как дрожжи, культуральная среда для этих микроорганизмов может быть либо природной, либо синтетической средой, до тех пор, пока она содержит источник углерода, источник азота, неорганические соединения и тому подобное, что может быть использовано микроорганизмами и позволяет эффективно культивировать трансформированную клетку. Условия культивирования могут быть условиями, традиционно используемыми для культивирования микроорганизмов. После культивирования пептиды по настоящему изобретению могут быть выделены из культуры трансформированных клеток и очищены с использованием общепринятых методов выделения и очистки пептидов.

Пептиды, содержащие аминокислотную последовательность, в которой одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены или добавлены в любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-3, могут быть подходящим образом продуцированы или получены специалистом в данной области техники на основе информации о последовательности нуклеотидов в ДНК, кодирующей любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-3. Конкретно, ген, который кодирует пептид, содержащий аминокислотную последовательность, в которой одна, две или несколько аминокислот заменены, удалены, вставлены и/или добавлены в любую из аминокислотных последовательностей SEQ ID NO:1-3, и проявляющий активность, индуцирующую Т-клетки-киллеры, может быть получен с помощью любых методов, известных специалистам в данной области техники, таких как химический синтез, методы генной инженерии и мутагенез. Например, пригоден метод сайт-направленного мутагенеза, который является одним из методов генной инженерии, так как с его помощью можно вводить конкретную мутацию в конкретное положение. Он может быть осуществлен в соответствии с методами, описанными в руководствах Molecular Cloning: A laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY., 1989 (обозначаемом в настоящем документе далее как Molecular Cloning, 2^nd Ed.) и Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1-38, John Wiley & Sons (1987-1997) (обозначаемом в настоящем документе далее как Current Protocols in Molecular Biology) и т.д.

Описанные выше пептиды по настоящему изобретению могут индуцировать иммунитет против рака, как показано в примерах ниже. Следовательно, в настоящем изобретении предлагаются средства для индукции иммунитета против рака, включающие один или более пептидов по настоящему изобретению в качестве активных ингредиентов.

Индуцирующие иммунитет средства по настоящему изобретению могут быть получены в виде смешанного состава, объединяющего с два или более эпитопных пептида. Индуцирующие иммунитет средства, приготовленные путем объединения множественных типов пептидов, могут представлять собой коктейль или могут быть совместно связаны с использованием стандартных методов. Эпитопные пептиды, предназначенные для объединения, могут представлять собой пептиды, обладающие различными аминокислотными последовательностями, происходящими от одного и того же гена, или могут представлять собой пептиды, обладающие аминокислотными последовательностями, происходящими от разных генов. Когда вводят пептиды по настоящему изобретению, вводимые пептиды презентируются на антигенах HLA антигенпрезентирующих клеток с высокой плотностью, и затем индуцируются Т-клетки-киллеры, которые специфически взаимодействуют с комплексами, образованными между вводимыми пептидами и антигенами HLA. Альтернативно, путем контактирования дендритных клеток, отобранных у индивидуума, с пептидами по настоящему изобретению (или путем пульсирования дендритных клеток, отобранных у индивидуума, пептидами по настоящему изобретению) могут быть получены антигенпрезентирующие клетки, которые презентируют пептиды по настоящему изобретению на своей клеточной поверхности. С помощью введения этих антигенпрезентирующих клеток обратно индивидууму в организме и