Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета

Иммуноферментная тест-система для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии.

Для современного животноводства важное экономическое значение имеют наиболее распространенные вирусные респираторно-кишечные инфекции телят и патология репродуктивных органов взрослого поголовья скота, связанные с бесплодием, ранней эмбриональной смертностью и абортами, снижением молочной продуктивности, понижением репродуктивных функций, задержкой в росте, повышением риска возникновения вторичных бактериальных инфекций и увеличением отхода, особенно среди молодняка.

В развитии этих форм патологий крупного рогатого скота доминирующими являются возбудители вирусной природы, относящиеся к различным таксономическим группам. Среди этой обширной группы вирусов малоизвестными и малоизученными являются реовирусы.

Реовирусы крупного рогатого скота относятся к роду Orthoreovirus семейства Reoviridae. Вирионы - сферические частицы диаметром 75-80 нм, с двумя капсидами: наружным и внутренним. Геном реовирусов состоит из 10 сегментов двухнитевой РНК. Название реовирусы (reo - начальные буквы слов respiratory - enteric - orphans) происходит от того, что они имеют выраженный тропизм к органам дыхания и пищеварения (Sabin A.B., 1959).

Реовирусы довольно устойчивы к физико-химическим воздействиям: не теряют своей инфекционности при нагревании их до 500С в присутствии MgCl2. На холоду пробы могут сохраняться при -200С от 8-10 мес. до 2 лет. При 40С вирус сохраняет свои инфекционные свойства в течение 2 мес. Пятикратное и выше размораживание и оттаивание не оказывает влияния на инфекционность реовирусов (Ритова, В.В., Трофимов Н.М., 1977). Они переносят широкий спектр рН (от 2,2 до 8,0), но полностью инактивируются 70% этиловым спиртом или 3% формалином при 56 0С в течение 30 минут (Stanley N.F., Dorman D.C., Pansford I., 1953).

Впервые о реовирусах, как о патогенных агентах, сообщил Sabin в 1959 году, выделив реовирус типа I от ребенка с симптомакомплексом диареи и носовых истечений. По результатам РВН и РТГА у человека и млекопитающих до сих пор обнаруживалось три родственных серотипа. Прототипным реовирусом типа I стал вирус ECHO-10 (штамм Lang). Реовирусы типов I, II и III выделены от крупного рогатого скота, лошадей, собак, кошек, мышей. По данным гибридизации РНК, вирусы серотипов I и II гомологичны на 70%, а степень гомологии между ними и вирусами серотипа II составляет лишь 10% (Gaillard R.K., Ioklik W.K., 1982). Реовирусной инфекцией поражаются многие виды животных и человек, независимо от возраста. Чаще всего инфекция носит инаппарантный, латентный характер и сопровождается длительным вирусоносительством и вирусовыделением. Реовирусы человека и животных, относящиеся к одному типу, неразличимы серологически и близко родственны по биологическим свойствам. Штаммы реовирусов человека и животных вызывают одинаковые изменения, размножаются в одних и тех же культурах ткани и вызывают аналогичные реакции у естественных хозяев. Возможны заболевания людей при заражении бычьим реовирусом 1-го типа и телят при заражении любым из серотипов вируса человека.

Реовирусную инфекцию крупного рогатого скота впервые регистрировали в США, Бельгии, ФРГ, Франции и других странах. В этих странах выявлен высокий процент серопозитивных животных. Так, например, в ФРГ доказано участие реовирусов в поражении респираторного тракта телят и установлена определенная роль их в патологии плода и новорожденных. При исследовании в РТГА сывороток крови 155 телят и парных сывороток от 62 взрослых животных, полученных из 24 хозяйств с диагнозом «грипп», было показано, что реовирусом крупного рогатого скота I-го типа реагируют 70% исследованных животных, с реовирусом II-го типа - 16% и III-го типа - 5%. В трех из 24 стад крупного рогатого скота серологическим исследованием парных сывороток было подтвежден соучастие реовирусов при остром течении инфекции (Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я. и др. 1998; Wizigmann G., Reinhardt G., 1971).

Серологические исследования в РТГА 194 проб сывороток крови телят, в период острого течения респираторной энзоотии, проведенные в институте вирусологии Венского университета, используя в качестве антигена в РТГА реовируса типа I (штамм Lang), показали, что у 54% обследованного поголовья животных были обнаружены антитела. Причем 39 сывороток реагировали в разведении 1:32, 20 - в разведении 1:64, 12 - в разведении 1:128 и 5 - в разведении 1:256 и выше. Эти данные указывали на то, что доминирующим серотипом является реовирус типа I (Böckmann I., 1976).

Накопилось достаточно убедительных данных, свидетельствующие об этиологической роли реовирусов в патологии респираторно-кишечных инфекций молодняка крупного рогатого скота. Так, Rosen L., Abinanti F.R., Hovis I.F. (1963), при исследовании в США 154-и случаев инфекционного процесса у телят первые 2 года жизни, диагностировали у 109 животных из трех ферм реовирусные инфекции, вызванные всеми тремя типами реовирусов. Из них также преобладал тип I.

По данным Rosen L.(1962), Böckmann I., (1976), реовирусы способны обусловливать пневмоэнтериты у телят в первые 3 месяца жизни, проявляющиеся клинически диареей, ринитом, лихорадкой и пневмонией, в то же время у взрослых животных реовирусная инфекция протекает латентно и сопровождается снижением удоев у молочных коров. При обследовании скота в штате Мэриленд (США) почти каждый теленок к годовалому возрасту был инфицирован одним из серотипов бычьего реовируса (Rosen L.(1964). На основании проведенных исследований Dawson P.S. (1966) пришел к выводу, что клинически выраженная форма течения наблюдалась редко, однако соучастие реовирусов было установлено в 29 случаев из 111 регистрированных энзоотии респираторных инфекций телят.

Следует заметить, что при экспериментальном заражении телят-гнотобионтов всеми тремя серотипами наблюдалась лихорадка, кашель, истечения из носовой полости, а гистологически была обнаружена интерстициальная пневмония (Lamont P.H. et al., 1968).

Несмотря на слабую изученность реовирусной инфекции, имеются сообщения о введении реовирусного антигена в качестве компонента в поливалентную инактивированную вакцину, состоящую из вируса ПГ-3, адено- и реовирусов (Сульбо Ж., Петермани X. и др., 1973). Вакцину предлагают использовать для телят с 6-8- недельного возраста, а при отсутствии молозивных антител иммунизируют животных в недельном возрасте. Продолжительность иммунитета - около года (Perreau P., 1973).

Следует также заметить, что авторами заявляемого изобретения в условиях лаборатории вирусологии ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» разработана «Ассоциированная вакцина против парвовирусной, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота». Вакцина предназначена для специфической профилактики респираторно-кишечных инфекций молодняка и патологий репродуктивных органов взрослого поголовья скота.

Обобщая приведенный материал, следует констатировать, что в естественных условиях у крупного рогатого скота реовирусная инфекция с ярким клиническим признаком проявляется не всегда и реовирусы, в основном, участвуют в формировании острых смешанных вирусных респираторно-кишечных инфекций телят, особенно в присутствии стрессовых факторов.

Известно, что реовирусам свойственна выраженная антигенная активность: в ответ на реовирусную инфекцию появляются нейтрализующие антитела и антитела, подавляющие реакцию гемагглютинации. Все реовирусы млекопитающих обладают гемагглютинирующим свойствами по отношению к эритроцитам человека. Температурные условия при постановке РГА не влияют на титр гемагглютинина, так же как и рН в пределах от 6,0 до 8,0.

По данным зарубежных исследователей ретроспективный диагноз на реовирусную инфекцию устанавливают путем исследований парных сывороток, взятых с интервалом 3-4 недели, путем исследований их в РТГА с реовирусом типа I. Повышение титров антигемагглютининов во вторых пробах в 4 и более раза считается диагностическим. При латентной реовирусной инфекции в стаде процент животных, имеющих антитела, колеблется от 40 до 80% (Brudaker M.M., 1964; Moreno-Lopez I. 1979; Wizigmann G., Reinhardt G., 1971).

Из литературных источников известно, что, лабораторная диагностика реовирусной инфекции крупного рогатого скота осуществляется путем выделения вируса в культуре клеток и полученные результаты должны быть подтверждены обнаружением прироста антигемагглютининов или вируснейтрализующих антител в период реконвалесценции по сравнению с сыворотками крови, взятыми в острой стадии болезни.

Для выделения возбудителя используют, главным образом, фекалии, носовые и конъюнктивальные смывы, кровь, легкие и лимфатические узлы. Материал обрабатывают по общепринятой методике, подготавливая для заражения культур клеток. Выделенный цитопатогенный агент проверяют на наличие гемагглютинирующей активности по отношению к эритроцитам человека и, если таковая имеется, идентифицируют в РТГА, используя эталонные сыворотки трех серотипов реовируса. Часто серологически диагностируют смешанные инфекции: ПГ-3, ВД-БС, реовирусная инфекция и хламидиоз (Thomas L., Collins A., 1974).

Однако до настоящего времени в Российской Федерации какие-либо исследования по изучению роли реовирусов в патологии крупного рогатого скота не проводились, многие аспекты этой болезни, в частности, источники и пути передачи, вирусоносительство и вирусовыделение у естественно инфицированного крупного рогатого скота не изучены, а также широта и степень распространения реовирусной инфекции оставались вне поля зрения ветеринарной службы страны. Очевидно, что решение таких вопросов, как особенности эпизоотологии болезни и постинфекционного иммунитета, задачи, связанные с разработкой методов и средств лабораторной диагностики и, специфической профилактики реовирусной инфекции крупного рогатого скота, требует серьезного внимания.

С учетом этого положения, с целью выявления степени распространения реовирусной инфекции среди поголовья крупного рогатого скота в регионе Среднего Поволжья, нами был осуществлен серомониторинг в отношении данной инфекции путем исследования в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) 1031 сыворотки крови, полученной из 16 хозяйств 6 районов Республики Татарстан, в которых имели место респираторно-кишечные заболевания телят и нарушение функций репродуктивных органов маточного поголовья. В качестве антигена использовали концентрированный ультрацентрифугированием инактивированный реовирус типа I штамм «Reo 1 Lang», полученный на культуре клеток Vero, с гемагглютинирующей активностью 1:512-1:1024. Из результатов проведенных исследований представленых в таблице 1 следует, что наиболее высокие титры антител в пределах 1:160-1:320 обнаруживаются как у глубокостельных коров и телок случного возраста, так и у телят. Эти данные указывают на активность реовирусной инфекции у обследованного поголовья скота. Следовательно, обобщение и анализ полученных результатов показал, что достаточно высокий процент выявления положительных реакций в диагностических титрах (1:40 и выше) у взрослого поголовья (58,9%) и у телят до трехмесячного возраста (31,5%) свидетельствует о фактах циркуляции реовируса типа I среди обследованного поголовья скота в 16 хозяйствах 6 районов Татарстана и о перспективности дальнейших широкомасштабных исследований этой неизученной в РФ вирусной инфекции.

В настоящее время ветеринарная служба РФ не располагает современными методами и средствами лабораторной диагностики, в том числе и какими-либо наборами для серологического мониторинга в отношении этой малоизвестной реовирусной инфекции крупного рогатого скота, способной поражать многих видов животных и человека, независимо от возраста и участвующая в формировании чаще всего смешанных инфекций. Поэтому проблема создания иммуноферментной тест-системы стала весьма актуальной.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаки, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Из выявленных аналогов - прототипа определили реакцию торможения гемагглютинации по Rosen L. 1962, как наиболее близкого по совокупности признаков по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемой тест-системы ИФА, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Во всех зарубежных странах серологическую диагностику реовирусной инфекции крупного рогатого скота и идентификацию выделенных штаммов реовирусов осуществляют по реакции торможения гемагглютинации, используя преимущественно антиген штамма «Reo 1 Lang» реовируса типа I. При помощи реакции торможения гемагглютинации практически во всех случаях естественной и экспериментальной реовирусной инфекции животных и человека удается выявить 4-х кратное или более высокое нарастание титра гомологичных антител в парных сыворотках крови

Известным решением, принятым за прототип, заявляемого метода серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета иммуноферментной тест-системой, является реакция торможения гемагглютинации (Rosen L., 1969; - Diagnostic procedures for viral and Rickettsial infections, c.285-291: Москва «Медицина», 1974 перевод с англ.).

Сущность РТГА заключается в нейтрализации гемагглютинирующих свойств вируса специфическими антителами, содержащимися в сыворотке крови, в результате чего склеивания (агглютинации) эритроцитов не происходит и они оседают на дно, образуя плотный осадок в виде пуговки

Компоненты реакции:

- антиген реовируса;

- 0,5% взвесь эритроцитов О группы человека;

- 25% взвесь каолина;

- контрольная положительная сыворотка;

- контрольная отрицательная сыворотка.

РТГА проводят микрометодом по методике описанной Rosen L. (1972) против 4 гемагглютинирующих единиц антигена реовируса. Перед постановкой РТГА сыворотки разводят 1:5, прогревают в водяной бане (для удаления термолабильных гемагглютининов) при +58°С в течение 30 минут, обрабатывают равным объемом 25% взвеси каолина в течение 20 минут. Надосадок, после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 10 минут, используют в реакции торможения гемагглютинации.

Недостатками прототипа - известного метода серологической диагностики реовирусной инфекции, являются:

- влияние неспецифических ингибиторов гемагглютинации, для устранения которых требуется предварительная обработка сывороток;

- сравнительно невысокая чувствительность реакции, что затрудняет выявление низких концентраций антител;

- нестабильность ингредиентов реакции, главным образом нативных эритроцитов, срок хранения которых непродолжителен (3-4 дня);

- трудоемкость и длительность данного метода, требующего для постановки одного рабочего дня, что ограничивает возможность одновременного исследования большого количества образцов сывороток крови;

- частые расхождения результатов РТГА при обследовании одних и тех сывороток в разных лабораториях из-за различий в процедуре постановки и учета реакции.

Указанные недостатки прототипа устраняются предлагаемым изобретением.

Совершенно очевидно, что современная диагностическая служба должна опираться на такие высокоспецифичные и чувствительные методы диагностики, которые позволяли бы получать воспроизводимые, достоверные и максимально качественные результаты в пределах метода, не требующих сложного инструментального оснащения, обеспеченные стандартными реагентами и признанные пригодными для проведения широкомасштабных исследований в условиях практических ветеринарных лабораторий. Этим требованиям в значительной степени отвечает твердофазный иммуноферментный анализ.

Целью изобретения является разработка иммуноферментной тест-системы как наиболее чувствительного и достоверного метода, предназначенного для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета.

Указанная цель достигается тем, что заявляемая тест-система содержит специфический антиген реовируса типа I штамма «Reo 1 Lang-ДЕП», инактивированный 0,08%-ным раствором 1,2-аминоэтилазиридина, представляющий собой специфический белок в концентрации 5-10 мкг/см³, адсорбированный на поверхности полистироловых лунок в карбонатно-бикарбонатном буфере с мертиолятом в конечной концентрации 0,1-0,2 мг/см³, контрольную положительную сыворотку, полученную к антигену реовируса типа I с активностью в ИФА 1:3200-1:6400, контрольную отрицательную сыворотку, конъюгат антивидовой, калий фосфорнокислый однозамещенный, калий фосфорнокислый двухзамещенный, натрий хлористый, хромоген (орто-фенилендиамин), перекись водорода, стоп-реагент и панели для постановки реакции иммуноферментного анализа. Основное преимущество предлагаемого изобретения состоит в том, что в качестве антигена используется штамм «Reo 1 Lang-ДЕП», относящийся к первому серотипу, который активно циркулирует среди поголовья скота во всех странах мира, в том числе и на территории РФ.

Согласно «Инструкции по применению тест-системы ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и определения уровня поствакцинальных антител», один комплект тест-системы рассчитан для проведения на одном планшете одновременного анализа 46 исследуемых проб сывороток крови в одном разведении (в двух повторах) и 2 контрольных сывороток (в двух повторах) или 20 исследуемых проб сывороток крови (в четырех разведениях) и 2 контрольных сывороток (в четырех разведениях). Одна тест-система рассчитана на исследование 230 проб сывороток крови в одном разведении и 100 проб в четырех разведениях.

Следовательно, заявляемое изобретение обладает существенными отличиями и характеризуется новой совокупностью признаков, позволяющей получить более высокий ожидаемый эффект, в отличие с тем результатом, который был получен при использовании метода серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота - прототипа.

Технико-экономическая эффективность:

- безопасность (используется инактивированный антиген);

- удобство работы (автоматизация промежуточных стадий реакций);

- использование прибора - спектрофотометра «Bio-Rad Model 680», с помощью которого за несколько секунд можно измерить поглощение света в 96 лунках планшета и получить объективные показатели оптической плотности исследуемых проб сыворотки крови, что позволяет значительно увеличить число проводимых анализов и упростить методическую процедуру выполнения ИФА.

Диагностические параметры и показатели качества разработанной тест-системы ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета соответствуют требованиям стандартов МЭБ (Руководство по диагностике и производству вакцин, издание МЭБ, 2004, с.21-29).

В состав предлагаемой тест-системы ИФА входят:

1. Полистироловые 96 луночные микропланшеты для иммуноферментного анализа, адсорбированные очищенным антигеном реовируса типа I, штамм «Reo 1 Lang-ДЕП», в концентрации 5-10 мкг/см³ - 5 шт.

2. Контрольная положительная сыворотка, лиофилизированная (К⁺), объем 0,5 см³, рабочее разведение 1:400, титр в ИФА 1:3200-1:6400-2 амп. №1

3. Контрольная отрицательная сыворотка, лиофилизированная (К^-), объем 1 см³, рабочее разведение 1:400-2 фл. №2

4. Адсорбционный 0,01М карбонатно-бикарбонатный буферный раствор (0,01 М КББ рН 9.6), содержащий мертиолят в конечной концентрации 0,1-0,2 мг/см³.

5. 10-кратный концентрат фосфатно-буферного раствора с Твином-20 для промывки планшетов (ФБР-Т), 100 см³ - 2 фл. №3

6. Буфер для разведения конъюгата (БРК), объем 10 см³ - 1 фл. №4

7. Антитела диагностические против иммуноглобулинов G (IgG) крупного - рогатого скота, меченые пероксидазой хрена (Конъюгат), объем 0,2 см³ - 1 амп. №5

8. Фостфатно-цитратный буфер (ФЦБ), объем 10 см³ - 5 фл. №6

9. Хромоген, орто-фенилендиамин (ОФД), 4 мг - 5 фл. №7

10. Перекись водорода (H₂O₂) 3% р-р, объем 10 см³ - 1 фл. №8

11. 1М Серная кислота (Стоп-реагент), объем 50 см³- 1фл. №9

Приготовление компонентов набора.

1. Приготовление рабочих буферов

1.1. Адсорбционный 0,01М карбонатно-бикарбонатный буферный раствор (КББ рН 9,6), содержащий мертиолят в конечной концентрации 0,1-0,2 мг/см³, предназначен для растворения и сорбции антигена в лунке планшетов. Из маточного раствора берут 5 см³, добавляют еще 95 см³ дист. воды и 10-20 мг мертиолята. Этот раствор используют в реакции (0,01 М КББ рН 9.6).

1.2. Фосфатно-буферный раствор с Твином-20 предназначен для разведения контрольных, исследуемых сывороток и промывки панелей. Содержимое флакона с 10-кратным концентратом фосфатно-буферного раствора с Твином-20 доводят дистиллированной водой до 1000 см³. Рабочий раствор буфера представляет собой прозрачный раствор с рН 7,2-7,4.

1.3. Буфер для разведения конъюгата, представляет собой прозрачный фосфатно-буферный раствор без Твина с рН 7,2-7,4

1.4. Рабочий хромоген-субстратный раствор. Раствор готовят непосредственно перед использованием. Для этого 4 мг ОФД растворяют в 10 см³ фосфатно-цитратного буфера и добавляют 0,14 см³ 3% раствора перекиси водорода. Раствор должен быть прозрачным и иметь светло-желтый цвет.

2. Приготовление антигена

В заявляемой тест-системе ИФА, предназначенной для выявления и количественного определения антител к реовирусу крупного рогатого скота, специфический антиген готовят используя реовирус штамм «Reo 1 Lang».

Штамм «Reo 1 Lang» реовируса, был получен в 1979 году профессором Гаффаровым Х.З. из ЦВЛ МСХ Великобритании и принятый заявителем в качестве производственного, обладает высокой биологической, антигенной и иммуногенной активностью, сохраняет свои нативные иммунобиологические свойства после инактивации, в нативном виде и после инактивации, отличаются высокой продуктивностью в чувствительных биологических системах культивирования, признан пригодным для изготовления высокочувствительных и специфичных диагностикумов.

Реовирус - РНК-содержащий вирус. Вирионы - сферические частицы диаметром 75-80 нм, с двумя капсидами: наружным и внутренним. Геном реовирусов состоит из 10 сегментов двухнитевой РНК. Штамм «Reo 1 Lang-ДЕП» реовируса, устойчив к эфиру, 1%-ной перекиси водорода, 1%-ному фенолу, 3%-ному формальдегиду, стабилен в широком интервале значений рН от 2,2 до 8,0, инактивируются 70% этиловым спиртом или 3% формалином при 56 0С в течение 30 минут. Вирус агглютинирует эритроциты человека 0-группы. В естественных условиях к вирусу восприимчив крупный рогатый скота.

Штамм «Reo 1 Lang-ДЕП» реовируса типа I крупного рогатого скота депонирован в лаборатории музей штаммов микроорганизмов особо опасных болезней (ООБ) ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» 9 декабря 2009 года, регистрационный номер 2. Местом хранения штамма определена «Лаборатория музей штаммов микроорганизмов ООБ ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ», 420075, г. Казань, Научный городок-2.

Реовирус репродуцируют в перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки (Vero) и/или в перевиваемой культуре клеток почек поросенка (РК-15), реовируссодержащий материал подвергают трехкратному замораживанию и размораживанию с последующим осветлением путем низкоскоростного центрифугирования (3000 об/мин) в течение 30 минут, инактивируют 0,08%-ным раствором 1,2-аминоэтилазиридина. С целью концентрирования антигена супернатант отбирают и подвергают дальнейшему центрифугированию при 30000 об/мин в течение 1 ч. Концентрированный антиген очищают ультрацентрифугированием при 30000 об/мин в течение 2 ч на 10-20-30% градиенте плотности сахарозы.

Пример 1. В заявляемой тест-системе антиген реовируса готовят следующим образом: реовирус репродуцируют в перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки (Vero) и/или в перевиваемой культуре клеток почек поросенка (РК-15) до накопления вируса в титре 1:32-1:128 ГАЕ. Для заражения реовирусом отбирают матрасы с полным монослоем клеток Vero и/или РК-15, удаляют ростовую среду, вносят в каждый матрас по 5 см вирусного материала. Инкубируют в термостате в течение часа. После этого, не удаляя вирусный материал, вносят поддерживающую среду в объеме 150-200 см и культуру помещают в термостат. Характерность цитопатогенного действия реовируса на культуру клеток Vero и/или РК-15 (зернистость, округление и разрушение клеток) контролируют путем микроскопии матров в течение 72-96 часов после заражения, трижды замораживают при -20°С, затем с каждого матраса отбирают пробы по 5 см³ для посева на стерильность и определения титра в РГА.

Затем реовируссодержащий материал подвергают трехкратному замораживанию и размораживанию с последующим осветлением путем низкоскоростного центрифугирования (3000 об/мин) в течение 30 минут. Инактивируют вирус 0,08%-ным раствором 1,2-аминоэтилазиридина. С целью концентрирования антигена супернатант отбирают и подвергают центрифугированию при 30000 об/мин в течение 2 ч. Концентрированный антиген очищают ультрацентрифугированием при 30000 об/мин в течение 2 ч на 10-20-30% градиенте плотности сахарозы.

Осадок ресуспендируют в карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,6-9,8), содержащем мертиолят в конечной концентрации 0,1-0,2 мг/см³ и используют в качестве антигена реовируса для сенсибилизации лунок полистироловых планшет. Оценку степени очистки и концентрирования антигена устанавливают по гемагглютинирующей активности, определяемой в РГА, и по показателям оптической плотности белка вирусного антигена на спектрофотометре СФ-46 ЛОМО при длинах волн 235 и 280 нм с поправкой на разведение в кювете по следующей формуле:

По формуле:

О П 2 3 5 − О П 2 8 0 2 , 5 1 × 3 0

где

-ОП₂₃₅; ОП₂₈₀ - оптическая плотность при длине волны 235 и 280 нм, соответственно;

- 30 - разведение исследуемого образца в кювете (1:30).

По результатам шахматного титрования антигена и контрольных сывороток устанавливают в ИФА оптимальную рабочую концентрацию реовирусного антигена, которая в данном случае равняется 5-10 мкг/см³.

3. Приготовление контрольных сывороток

Изготовление контрольной положительной типоспецифической сыворотки против штамма «Reo 1 Lang-ДЕП» реовируса типа I осуществляют путем гипериммунизации клинического здорового молодняка крупного рогатого скота 6-8-месячного возраста, концентрированной, очищенной и инактивированной вирусной суспензией с гемагглютинирующей активностью не ниже 1:256-1:512.

Через 14-16 дней после последнего введения вируса у животных из яремной вены берут пробы крови, получают сыворотку и ставят реакцию торможения гемагглютинации (РТГА) и ИФА.

Сыворотку с антигемагглютинирующим титром в РТГА не ниже 1:1280 и в ИФА - 1:3200-1:6400 расфасовывают в ампулы по 0,5 мл и лиофилизируют.

Пример 2. Изготовление контрольной положительной типоспецифической сыворотки против штамма «Reo 1 Lang-ДЕП» реовируса типа I осуществляют путем гипериммунизации клинического здорового молодняка крупного рогатого скота 6-8-месячного возраста, концентрированной, очищенной и инактивированной вирусной суспензией с гемагглютинирующей активностью не ниже 1:256-1:512.

До начала иммунизации животных из яремной вены берут кровь и сыворотку проверяют на наличие антигемагглютининов к реовирусу крупного рогатого скота. В случаях отсутствия в них специфических антител, животные считаются пригодными для гипериммунизации.

Для получения иммунных сывороток используют вирусный антиген, депонированный в неполном адъюванте Фрейнда, которого готовят путем тщательного смешивания 15 см³ вазелинового масла и 5 см³ обезвоженного ланолина. Полученную смесь подвергают дробной стерилизации в водяной бане 3 дня подряд по 60 минут. Смесь антигена с адъювантом (в равном объеме) подогревают в водяной бане до +37°С, тщательно перемешивают и вводят подкожно в дозе по 2 см³. В последующем гипериммунизацию животных проводят путем трехкратного внутривенного введения инактивированной культуральной вирусной суспензии, очищенной от клеток, в возрастающих дозах 10 см³, 20 см и 30 см³ соответственно с интервалом между введениями 14-16 суток.

С целью предупреждения анафилактической реакции, начиная со второго цикла иммунизации, животному вводят по 2 см³ вируса подкожно за 40 минут до введения основной дозы вируса.

Через 14-16 дней после последнего введения вируса у животных из яремной вены берут пробы крови, получают сыворотку и ставят реакцию торможения гемагглютинации.

Производственное крововзятие допускается при наличии антител в сыворотке крови продуцента к реовирусу крупного рогатого скота не ниже 1:1280-1:2560 в РТГА. Первое крововзятие от продуцентов по объему не должно превышать 0,6 литра крови на 100 кг массы животного, а в последующем - 1,6 литра на 100 кг массы.

Кровь из яремной вены в стерильные цилиндры, смоченные физиологическим раствором, ставят в термальную комнату на 30-40 минут при температуре +37-38°С, после чего сыворотки обводят и цилиндры оставляют на 18 часов при температуре +4-6°С для отстаивания сыворотки. Затем сыворотку отбирают, добавляют мертиолят в соотношении 1:10000, определяют титр антител в РТГА и ИФА с гомологичным антигеном.

Сыворотка с антигемагглютинирующим титром в РТГА не ниже 1:1280 и в ИФА - 1:3200-1:6400 расфасовывают в ампулы по 0,5 см³ и лиофилизируют.

4. Приготовление отрицательной контрольной сыворотки

Крупный рогатый скот выдерживают в карантине в течение 2 месяцев, и исследуют сыворотки крови в ИФА. У клинически здоровых неиммунизированных животных, не содержащих при исследовании в ИФА специфических антител к реовирусу первого серотипа, проводят стерильное взятие крови из яремной вены из расчета 600 см³ крови на 100 кг массы животного. Кровь выдерживают 30 мин в термостате при +37°С, затем обводят и отстаивают при 4°С. Отстоявшуюся сыворотку сливают во флаконы в стерильных условиях, расфасовывают во флаконы по 1 см³ и лиофилизируют.

Пример 3. Стандартизация основных условий проведения исследований, заявляемой тест-системой ИФА

Влияние концентрации антигена реовируса крупного рогатого скота на результаты ИФА исследуют при содержании его 30, 15, 5, 10, 3, мкг/см³. Результаты исследований показали, что максимальное значение коэффициента специфичности отмечается при адсорбции антигена реовируса КРС в концентрации 5-10 мкг/см³. Использование других его концентраций приводит к снижению специфичности реакции.

При разработке иммуноферментных наборов, в которых для исследования используется одно разведение исследуемой сыворотки, важным является подбор условий сорбции иммунной сыворотки на сенсибилизированном антигеном планшете. Для этого в иммобилизированные антигеном лунки планшета вносят контрольные сыворотки в разведениях от 1:100 до 1:12800. Конъюгат используют в рабочем разведении 1:5000, которое определяют в предварительных экспериментах методом «шахматного» титрования.

Оптимальной концентрацией антигена и рабочими разведениями компонентов иммуноферментной тест-системы считают их конечные значения, обеспечивающие в лунках с положительной контрольной сывороткой ОП490 составляло не менее 0,7, а в лунках с отрицательным - не более 0,2. Данным условиям отвечают следующие параметры реакции: концентрация антигена - 5-10 мкг/см³, разведения контрольных сывороток - 1:400 и рабочее разведение конъюгата 1:5000. Оптимальным временем для адсорбции антигена была 18-ти часовая его инкубация при +4±1°С, для сывороток это время составляет 2 ч при +37±1°С.

Пример 4. Определение позитивно-негативного порога тест-системы ИФА.

Для учета и интерпретации результатов, полученных тест-системой ИФА, определен позитивно-негативный порог тест-системы, который находится в диапазоне <16% - ≥25%. В дальнейшем все пробы, значение Ксв. для которых было меньше ПНП, считали отрицательными, а пробы со значением Ксв. равным или превышающим этот показатель положительными.

Пример 5.

Чувствительность и специфичность тест-системы определяли на основании корреляции результатов исследований сывороток крови в РТГА и ИФА (таблица 2).

Результаты, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о том, что диагностическая чувствительность разработанной тест-системы по отношению к РТГА составила 111:115×100%=96,5%; диагностическая специфичность 68:73×100%=93,1%; совпадаемость результатов двух методов 179:188×100%=95,2%.

В тоже время, при исследовании сывороток крови в ИФА и РТГА, полученных от заведомо негативных (клинически здоровые контрольные животные из благополучного по данному заболеванию хозяйства, n=90) и заведомо позитивных (подопытные животные, привитые «Ассоциированной вакциной против парво-, реовирусной, герпесвирусной типа I инфекций и вирусной диареи-болезни слизистых оболочек крупного рогатого скота инактивированной эмульсионной», n=90) коров, наблюдалась 100%-я совпадаемость результатов. В первом случае, все результаты исследований были отрицательными, во втором - положительными.

Воспроизводимость тест-системы ИФА определяли в 5-и повторностях как в рамках одной планшеты (набора ИФА), так и между разными наборами ИФА одной серии и наборами разных серий. Величина коэффициента вариации значений Ксв. при исследовании положительных проб (n=15) тест-системой ИФА разных серий не превышала 6,3%, а при исследовании отрицательных (n=13) - 7,4%, что соответствует рекомендуемым параметрам и не превышает 10%. При этом коэффициент корреляции результатов при исследовании положительных проб составил 0,9, а при исследовании отрицательных - 0,95.

Пример 6. Иллюстрация применения тест-системы ИФА

6.1. Подготовка биологического материала для исследования. Для анализа используют сыворотку крови крупного рогатого скота. Если анализ проводят в течение 24 ч после отбора, образцы биоматериала хранят при температуре +4°С. При более длительном хранении образцы замораживают при температуре -20°С. Перед исследованием замороженные образцы быстро (в течение 5-10 мин) нагревают в водяной бане при температуре +37°С. В случае выпадения осадка эритроцитов или белка пробы обязательно осветляют центрифугированием 10 мин при 2000g. Многократное замораживание и оттаивание образцов не допускается. Не использовать объединенные сыворотки от разных животных. Гемолизированные и проросшие сыворотки исследованию не подлежат.

6.2. Подготовка биологических компонентов тест-системы ИФА.

Контрольные отрицательную и положительную сыворотки (амп. или фл.) №1 и №2 растворяют в ФБР-Т и разводят 1:400.

Содержимое ампулы №5 с антивидовым иммунопероксидазным конъюгатом перед употреблением разводят необходимое количество в 5000 раз, например к 0,01 см³ конъюгата добавляют 50 см³ БРК.

6.3. Все исходные компоненты набора стабильны до истечения срока годности.

6.4. Проведение иммуноферментного анализа.

Иммуноферментный анализ (ИФА) проводят в непрямом твердофазном варианте с использованием компонентов, входящих в тест-систему ИФА для серологической диагностики реовирусной инфекции крупного рогатого скота и контроля напряженности поствакцинального иммунитета.

Перед началом работы планшет двукратно промывают рабочим раствором ФБР-Т в объеме 0,15 см³ на лунку.

При исследовании в одном разведении исследуемые и контрольные сыворотки используют в разведении 1:400 фосфатно-буферным раствором с твином (ФБР-Т) №4. Например, к 3,99 см³ ФБР-Т добавляют 0,01 см³ исследуемой сыворотки.

В лунки E12-F12 вносят по 0,1 см³ К+ в рабочем разведении 1:400.

В лунки G12-H12 вносят по 0,1 см³ К- в рабочем разведении 1:400.

В остальные лунки планшета вносят по 0,1 см³ исследуемой пробы (ИП) сыворотки в разведении 1:400 (по две лунки на каждый образец сыворотки) по схеме 1.

При исследовании в 4-х разведениях исследуемые и контрольные сыворотки используют в разведении 1:800.

Например, к 7,99 см³ ФБР-Т добавляют 0,01 см³ исследуемой сыворотки.

Предварительно во все лунки планшета вносят по 0,1 см³ ФБР-Т. В лунку A11 вносят по 0,1 см³ К+ в р