Композиция реагентов для постановки ксантиноксидазной реакции

Композиция реагентов для постановки ксантиноксидазной реакции

Реферат

Изобретение относится к медицинской биохимии, аналитической химии, а именно к созданию реагентов, для проведения и определения активности ферментативной реакции в клинической лабораторной диагностике.

Ксантиноксидаза (КФ: 1.17.3.2) - фермент, катализирующий превращение гипоксантина в ксантин и далее в мочевую кислоту, а также окисление ряда птеридинов, альдегидов и имидазолов (Мецлер Д., 1976). Активное изучение ксантиноксидазы началось в связи с открытием ее супероксидобразующей, канцерогенной и апопто генной активностей. Кроме того, показано, что ксантиноксидаза является главной системой генерирования активных форм кислорода в живых организмах (Маеда X., 1998). В последнее десятилетие определение активности ксантиноксидазы все чаще используется с диагностической целью при различных патологических состояниях.

Известен способ определения активности ксантиноксидазы в сыворотке крови у детей (Полиорганная мембранная патология. Ред. Ю.Е.Вельтищев и др. М 1991; С.165-167) в котором используется композиция реагентов включающая: раствор карбоната натрия, раствор ЭДТА и раствор нитротетразолиевый синий (красящий раствор)и воду.

В пробирку последовательно добавляют 2,6 мл раствора карбоната натрия, 0,1 мл раствора ЭДТА и 0,2 мл раствора нитротетразолиевого синего. В опытную пробирку добавляют 0,1 мл ксантина. Сыворотку (предварительно прогретую в термостате) добавляют в реакционную смесь непосредственно перед измерением, которое осуществляют в течение 1 мин на спектрофотометре при длине волны 560 нм. Разница между исследуемой и контрольной пробой является показателем активности ксантиноксидазы.

Недостатком известной смеси реагентов является невозможность использования в виде готовой смеси; поскольку используемые реагенты нестабильны, смесь требуюет приготовления непосредственно перед применением.

Наиболее близким к заявленному техническому решению является известный и широко применяемый набор реагентов, используемый для определения активности ксантиноксидазы в методе S.Hashimoto (Shigebumi Hashimoto «A new spectrophotometric Assay Method of Xantineoxidase in Grude Homodenate» Analytical biochemistry, 1974, 62, с.426-435), содержащий фосфатный буфер (pH 7.4, 150 µмоль), 0,6 мМ оксонат калия, ксантин (0.2 µмоль), трихлоруксусную кислоту (20%).

Недостатками известного набора реагентов являются:

- сложность постановки реакции с использованием известного набора реагентов, поскольку их необходимо использовать в несколько этапов;

- высокая токсичность, поскольку трихлоруксусная кислота является токсичным веществом, поэтому она не может быть включена в реагентную смесь изначально, поскольку изучаемый фермент будет ингибирован;

- ограниченные возможности использования, поскольку для последующего анализа необходимо использовать дорогостоящее оборудование (УФ-спектрофотометр), вследствие чего известный реагент невозможно использовать в условиях стандартно оснащенной клинико-диагностической лаборатории;

- невозможность серийного производства.

Техническим результатом изобретения являются:

- упрощение применения при постановке реакции;

- снижение токсичности;

- расширение возможности использования в условиях стандартно оснащенной клинико-диагностической лаборатории;

- возможность серийного производства.

Технический результат достигается тем, что композиция реагентов для постановки ксантиноксидазной реакции, содержит калий фосфорнокислый двузамещенный, соляную кислоту, воду, субстрат (сочетание субстратов) выбранных из группы - птеридины, альдегиды, цистеин, а также дополнительно содержит полиэфирный гетерополимер выбран из группы - акриловый, олефиновый, силоксановый, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Калий фосфорнокислый двузамещенный	3-4
Кислота соляная	0,1-0,2
Субстрат	0,003-0,01
Полиэфирный гетерополимер	40-60
Вода	остальное

В композиции реагентов для постановки ксантиноксидазной реакции, субстрат, выбранный из группы: пурины (пурин, 2,6-дигидропурин (ксантин), 1-метилксантин, 6-меркаптопурин, гипоксантин(6-оксипурин), аденин); птеридины (птеридин, 2,6-диоксиптеридин, гистидин), цистеин, 6-деоксиацикловир, аллопуринол; альдегиды (алифатические альдегиды (алкенали, алканали, 2-бутеналь, 2-ноненаль, 4-гидрокси-2-ноненаль), ароматические альдегиды (бензальдегид, ванилин), и воду, согласно изобретения, дополнительно содержит полиэфирный гетерополимер выбранный из группы: акриловый, олефиновый, силоксановый.

Использование полиэфирного гетерополимера в качестве разделительного геля, позволяет существенно упростить постановку реакции, поскольку реакция может быть проведена в один этап, так как во время центрифугирования кровь разделяется на твердую и жидкую фракции, при этом твердая фракция осаждается под гелем, а жидкая, которую разделительный гель пропускает сквозь себя, остается сверху. В связи с тем, что исследуемый фермент (ксантиноксидаза) функционирует преимущественно в клетках, этот механизм обеспечивает стабильность состава плазмы и останавливает ферментативную реакцию. При этом исключается необходимость использования для остановки реакции токсичной трихлоруксусной кислоты, или подобных реагентов, необходимых для осаждения белка. Поэтому использование для разделения компонентов крови и остановки реакции полиэфирного гетерополимера позволяет сделать композицию нетоксичной.

Реакция может быть проведена при помощи химически стабильной, композиции реагентов, что позволяет производить ее серийно и поставлять в лаборатории непосредственно в готовом для постановки реакции виде, например, в пробирках, где полиэфирный гетерополимер до начала центрифугирования находится в нижней части пробирки в виде слоя, не смешанного с другими компонентами композиции.

Заявляемая композиция реагентов позволяет определять активность ксантиноксидазы в цельной гепаринизированной крови, а при необходимости - в другом биоматериале, и может применяться для определения активности ксантиноксидазы с использованием как сложного оборудования исследовательского уровня, современных биохимических анализаторов, так и недорогого легкодоступного фотометрического оборудования поскольку для регистрации накопления продукта реакции, в отличие от аналога (где используется спектрофотометрическое определение по поглощению монохроматического ультрафиолетового света депротеинатами исследуемых образцов, требующий оборудования исследовательского уровня), могут быть использованы стандартные методы определения мочевой кислоты, которые выполняются с применением любого доступного фотометрического оборудования, поскольку регистрация накопления продукта реакции осуществляется в видимой области спектра.

При концентрации компонентов буферной смеси (калий фосфорнокислый двузамещенный и соляную кислоту,) вне указанных диапазонов (3-4% и 0,1-0,2% соответственно) нарушается стабильность исследуемого фермента и/или применяемого субстрата, скорость реакции замедляется. Буферная смесь предназначена для поддержания в реагентной композиции оптимального значения водородного показателя (pH), что необходимо для нормального протекания ферментативной реакции и для обеспечения стабильности субстрата, входящего в состав композиции.

Субстрат для ксантиноксидазы выбран из группы: пурины (пурин, 2,6-дигидропурин (ксантин), 1-метилксантин, 6-меркаптопурин, гипоксантин(6-оксипурин), аденин); птеридины (птеридин, 2,6-диоксиптеридин, гистидин), цистеин, 6-деоксиацикловир, аллопуринол; альдегиды (алифатические альдегиды (алкенали, алканали, 2-бутеналь, 2-ноненаль, 4-гидрокси-2-ноненаль), ароматические альдегиды (бензальдегид, ванилин), поскольку перечисленные субстраты специфично взаимодействуют с ферментом (ксантиноксидазой), что делает возможным оценку его активности (по скорости образования продуктов, копродуктов, а также по скорости убыли субстрата). Субстраты могут быть использованы как в виде монореагента, так и в сочетании. Выбор конкретного субстрата или нескольких субстратов для включения их в композицию, а также их концентраций (в границах установленного диапазона) осуществляется в зависимости от предполагаемого способа регистрации скорости ферментативной реакции (по скорости образования продуктов, копродуктов, по скорости убыли субстрата, спектрофотометрическая регистрация, флюорометрическая регистрация, хроматографическая регистрация, уриказный метод и т.п.). При низкой или избыточной концентрации субстрата снижается аналитическая чувствительность определения активности фермента.

Полиэфирный гетерополимер выбран из группы: акриловый, олефиновый, силоксановый поскольку именно данные вещества обладают физико-химическими свойствами, которые не препятствуют протеканию ферментативной реакции (поэтому могут находиться в составе композиции изначально), эффективно отделяют красные кровяные клетки от плазмы крови при центрифугировании (что позволяет остановить ферментативную реакцию после ее проведения), не являются токсичными. Включение в состав реагента полиэфирного гетерополимера в массовой доле 40-60% необходимо для остановки ферментативной реакции с применением центрифуги и получения образцов для определения активности фермента. Увеличение или снижение массовой доли полиэфирного гетерополимера снижает качество получаемых при центрифугировании образцов и разделения компонентов крови.

Пример использования композиции реагентов

В стеклянную или пластиковую пробирку, содержащую в качестве стабилизатора гепарин, забирают 1,0 мл крови, перемешивают. Материал стабилен в течение 48 часов при 4°C.

Для исследования активности ксантиноксидазы необходимо 0,6 мл цельной крови, предлагаемый реагент и стандартный набор реактивов и оборудования для определения содержания мочевой кислоты в сыворотке крови уриказным методом.

Ход исследования

Пример конкретного состава композиции для постановки ксантиноксидазной реакции:

Соотношение компонентов, мас.%:

Калий фосфорнокислый двузамещенный	3-4
Кислота соляная	0,1-0,2
2,6-дигидропурин	0,003-0,004
Полиэфирный гетерополимер	40-60
Вода	остальное

1) Инициация ферментативной реакции.

В полиэтилентерфталатовую пробирку, содержащую реагентную композицию вносят 0,3 мл цельной крови. Параллельно готовится «холостая проба». Состав, объем и соотношение реагентов полностью идентично опытной пробе за исключением 2,6-дигидропурина. Содержимое пробирок перемешивают.

2) Инкубация. Осуществляется в течение 90 минут при 37°C в термостате.

3) Получение образцов для определения содержания мочевой кислоты. Центрифугирование 15 минут при 4000 об/мин. Надосадочную жидкость используют для дальнейшего анализа.

5) Определение содержания мочевой кислоты в опытной и «холостой» пробах с использованием стандартных тест-систем.

Активность ксантиноксидазы рассчитывается как разность содержания мочевой кислоты между опытной и «холостой» пробами, и выражается в мкМ/мин/л или в международных единицах активности (mU/ml).

В отличие от аналога из реагентной композиции исключен оксонат калия, предназначенный для ингибирования уриказы - фермента, содержащегося в тканях некоторых животных и препятствующий накоплению продукта ксантиноксидазной реакции - мочевой кислоты. В тканях человека (в том числе и в крови) данный фермент не содержится, поэтому нет необходимости включать в состав реагентной смеси ее ингибитор (оксонат калия). Кроме того, наличие оксоната калия в реагентной смеси сделает невозможным регистрацию продукта при помощи стандартного уриказного метода.

Композиция реагентов для постановки ксантиноксидазной реакции, содержащая калий фосфорнокислый двузамещенный, соляную кислоту, субстрат, воду, отличающаяся тем, что субстрат (сочетание субстратов) выбраны из группы - птеридины, альдегиды, цистеин, а также дополнительно содержит полиэфирный гетерополимер, выбранный из группы - акриловый, олефиновый, силоксановый, при следующем соотношении компонентов, мас.%:

Калий фосфорнокислый двузамещенный	3-4
Кислота соляная	0,1-0,2
Субстрат	0,003-0,01
Полиэфирный гетерополимер	40-60
Вода	Остальное