Композиции для личной гигиены, обеспечивающие усиленное ощущение холода

Композиции для личной гигиены, обеспечивающие усиленное ощущение холода

Реферат

Область техники

Настоящее изобретение относится к композициям для личной гигиены, таким как композиции для ухода за полостью рта и для ухода за кожей, содержащим систему отдушки/ароматизатора, включающую одно или несколько холодящих веществ, у которых приятное ощущение прохлады, создаваемое холодящим веществом, усиливается вследствие более быстрого начала действия, большей интенсивности или более сильного воздействия и/или большей продолжительности действия, тем самым повышая привлекательность и приемлемость композиций для потребителей. В случае продуктов для ухода за полостью рта особенно важны характеристики вкуса и ощущения во рту не только с точки зрения приемлемости для потребителя, но также для обеспечения предрасположенности к соблюдению режима применения, поскольку использование таких продуктов может предусматривать достаточно длительное время пребывания во рту и повторное использование для максимальной эффективности.

Известный уровень техники

Продукты для ухода за полостью рта, такие как средства для чистки зубов и зубные эликсиры, широко используются потребителями в составе их гигиенических процедур ухода за полостью рта. Хорошо известно, что продукты для ухода за полостью рта могут обеспечивать для потребителей как терапевтические, так и косметические гигиенические полезные эффекты. Терапевтические полезные эффекты включают профилактику кариеса, которая типично обеспечивается путем использования различных фтористых солей; профилактику гингивита благодаря использованию антимикробного агента, такого как триклозан, фторид олова(2) или эфирные масла; или борьбу с гиперчувствительностью путем использования таких ингредиентов, как хлорид стронция или нитрат калия. Косметические полезные эффекты, обеспечиваемые продуктами для ухода за полостью рта, включают борьбу с образованием зубного налета и зубного камня, удаление и предотвращение образование пятен на зубах, отбеливание зубов, освежение дыхания и общее улучшение воспринимаемого ощущения во рту, которые можно в общих чертах охарактеризовать как эстетические характеристики ощущения во рту. Зубной камень и зубной налет наряду с поведенческими и экологическими факторами приводят к образованию пятен на зубах, значительно влияющих на эстетический вид зубов. Поведенческие и экологические факторы, влияющие на склонность зубов к окрашиванию, включают регулярное употребление продуктов на основе кофе, чая, колы или табака, а также использование определенных продуктов для ухода за полостью рта, содержащих ингредиенты, способствующие образованию пятен, таких как катионные антимикробные средства и соли металлов,

Таким образом, ежедневный уход за полостью рта в домашних условиях требует использования продуктов со многочисленными ингредиентами, действующими по разным механизмам, для обеспечения полного спектра терапевтических и эстетических полезных эффектов, включая противокариозный, антимикробный, противогингивитный, против зубного налета, против зубного камня и антиэрозионный, а также против неприятного запаха, для создания ощущения свежения во рту, для удаления пятен, для борьбы с образованием пятен и отбеливания зубов. Для того, чтобы продукты для ухода за полостью рта для ежедневного использования, такие как средства для чистки зубов и полоскания, обеспечивали полный уход за полостью рта, необходимо объединять активные вещества и добавки, многие из которых имеют тот недостаток, что они вызывают отрицательные эстетические эффекты при использовании, в частности, неприятный вкус и ощущения, и способствуют образованию пятен. Неприятные вкус и ощущения во рту были описаны как имеющие один или несколько из горького, металлического, вяжущего, соленого, вызывающего онемение, острого, жгучего, покалывающего и даже раздражающего аспектов. Типичные ингредиенты для использования при уходе за полостью рта, ассоциированные с такими эстетически отрицательными свойствами, включают антимикробные агенты, такие как цетилпиридиний хлорид, хлоргексидин, соли олова и цинка; отбеливающие агенты для зубов, такие как пероксиды; агенты против зубного камня, такие как пирофосфат, триполифосфат и гексаметафосфат; и эксципиенты, такие как пищевая сода и поверхностно-активные вещества. Для смягчения эстетически нежелательных эффектов этих ингредиентов в продукты для ухода за полостью рта типично вводят вкусовые вещества, подсластители и холодящие вещества для создания как можно более приятного вкусового ощущения. В частности, желательно, чтобы продукты для ухода за полостью рта обеспечивали освежающее холодящее ощущение во время и после использования.

Таким образом, в одном аспекте, настоящее изобретение предусматривает композиции для ухода за полостью рта, содержащие систему ароматизатора, включающую традиционные вкусовые компоненты в комбинации с одним или смесью холодящих химических веществ, в которых холодящее и освежающее ощущение, создаваемое холодящим веществом (веществами) потенцируется по показателям начала действия, интенсивности или силы воздействия и/или продолжительности.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение касается продуктов личной гигиены, предназначенных для использования на коже, волосах, в полости рта и на других слизистых поверхностях, и композиций отдушки или ароматизатора для использования в таких продуктах личной гигиены, содержащих одно или несколько холодящих веществ с повышенной активностью. В одном варианте исполнения, изобретение предусматривает композиции для ухода за полостью рта, содержащие:

(a) композицию ароматизатора, содержащую одно или несколько холодящих веществ, отличных от ментола и, необязательно, один или несколько дополнительных вкусовых ингредиентов,

(b) источник ионов кальция или транспортный агент кальция, достаточный для потенцирования и/или модулирования холодящего и освежающего ощущения, создаваемого холодящим веществом (веществами), и

(c) приемлемый для полости рта носитель. При введении в полость рта, композиции для ухода за полостью рта обеспечивают немедленное возникновение холодящего ощущения, которое длится более примерно 15 минут, тем самым обеспечивая продолжительное ощущение чистоты и свежести во рту и способствуя соблюдению пользователем схемы применения и повторному использованию композиций.

Эти и другие признаки, аспекты и преимущества настоящего изобретения будут очевидны квалифицированным специалистам в данной области техники из приведенного далее детального описания.

Детальное описание изобретения

Хотя описание изобретения заканчивается формулой изобретения, конкретно излагающей и четко заявляющей изобретение, считается, что настоящее изобретение будет лучше понятным из приведенного ниже описания.

Все процентные доли и соотношения, используемые тут и далее, приводятся в пересчете на вес композиции в целом, если не указано иное. Все процентные доли, соотношения и уровни содержания ингредиентов, указываемые тут, основаны на действительном количестве ингредиента, и не включают растворители, наполнители или другие материалы, с которыми ингредиент может быть объединен в коммерчески доступном продукте, если не указано иное.

Все измерения, описываемые тут, выполняются при 25°С, если не указано иное.

В данном описании, слово "включающий" и его варианты означают, что могут быть добавлены другие стадии и другие компоненты, не влияющие на конечный результат. Такие термины охватывают термины "состоящий из" и "состоящий по существу из".

В используемом тут значении, слово "содержать" и его варианты должны рассматриваться как неограничивающие, так чтобы перечисление элементов списка не означало исключения других подобных элементов, которые также могут быть пригодными для использования в материалах, композициях, устройствах и способах по настоящему изобретению.

В используемом тут значении, слова "предпочтительный", "предпочтительно" и варианты относятся к вариантам исполнения изобретения, позволяющим получить определенные полезные эффекты в определенных обстоятельствах. Однако другие варианты исполнения также могут быть предпочтительными в таких же или в других обстоятельствах. Кроме того, перечисление одного или нескольких предпочтительных вариантов исполнения не подразумевает, что другие варианты исполнения являются непригодными, и не направлено на исключение других вариантов исполнения из объема изобретения.

Под "композицией для ухода за полостью рта" подразумевается продукт, который при использовании в обычном порядке не проглатывается целенаправленно с целью системного введения конкретных терапевтических агентов, а удерживается в полости рта в течение периода времени, достаточного для вхождения в контакт по существу со всеми поверхностями зубов и/или тканей полости рта с целью проявления активности в полости рта. Композиция для ухода за полостью рта может находиться в различных формах, включая зубную пасту, средства для чистки зубов, зубной гель, поддесневой гель, зубной эликсир, мусс, пенку, аэрозоль для полости рта, леденцы, жевательную таблетку, жевательную резинку или продукт для ухода за зубными протезами. Композиция для ухода за полостью рта может также быть включена в полоски или пленки для прямого нанесения на или прикрепления к поверхностям полости рта.

Термин "средства для чистки зубов", в используемом тут значении, включает пасту, гель или жидкие композиции, если не указано иное. Композиция средства для чистки зубов может быть однофазной композицией или может быть комбинацией двух или больше отдельных композиций средств для чистки зубов. Композиция средства для чистки зубов может находиться в любой желательной форме, такой как композиция с внутренними полосками, с поверхностными полосками, многослойная, с гелем, окружающим пасту, или любая их комбинация. Каждая композиция средства для чистки зубов в средстве для чистки зубов, содержащем две или больше отдельных композиции средств для чистки зубов, может содержаться в физически отделенном отсеке дозирующего устройства и дозироваться параллельно.

Термин "дозирующее устройство", в используемом тут значении, означает любой насос, тубу или контейнер, пригодные для дозирования композиций, таких как средства для чистки зубов.

Термин "зубы", в используемом тут значении, относится к природным зубам, а также искусственным зубам или зубным протезам.

Термин "приемлемый для полости рта носитель или эксципиенты" включает безопасные и эффективные материалы и обычные добавки, используемые в композициях для ухода за полостью рта, включая, без ограничений, источники фторид-ионов, антикалькулезные агенты или агенты против зубного камня, буферы, абразивы, такие как диоксид кремния, бикарбонатные соли щелочных металлов, загущающие материалы, увлажняющие вещества, воду, поверхностно-активные вещества, диоксид титана, ароматизаторы, подсластители, ксилит, красящие вещества и их смеси.

Активные и другие ингредиенты, пригодные для использования по настоящему изобретению, могут быть категоризированы или описаны тут по их косметическому и/или терапевтическому полезному эффекту или по их предполагаемому механизму действия или функции. Однако следует понимать, что активные и другие ингредиенты, пригодные для использования по настоящему изобретению, могут, в некоторых случаях, обеспечивать несколько косметических и/или терапевтических полезных эффектов или функций или действовать по нескольким механизмам. Поэтому приведенные тут классификации проведены для удобства и не предназначены для ограничения ингредиента конкретно указанной функцией (функциями) или перечисленными активностями.

В данном описании, термины "твердые отложения" и "зубной камень" используются взаимозаменяемо и относятся к минерализованным биопленкам зубного налета.

Существенные и необязательные компоненты композиций по настоящему изобретению описаны в следующих параграфах.

Холодящее вещество (вещества)

Холодящие вещества или соединения, обладающие физиологическим холодящим эффектом, особенно на ротовых и других слизистых поверхностях и коже, являются обычными ингредиентами различных продуктов, включая пищевые композиции и продукты личной гигиены, и композиций отдушки или ароматизатора для использования в таких продуктах. Примеры пищевых композиций включают кондитерские изделия, конфеты, шоколад, жевательную резинку, напитки и стоматологические лекарственные средства. Композиции для местного применения на коже, волосах и слизистых поверхностях включают лосьоны или кремы, очищающие средства для кожи, шампуни и кондиционеры, влажные салфетки и полотенца и косметические продукты, такие как губные помады и крема-основы. Конкретным классом композиций для местного применения, к которому относится настоящее изобретение, являются средства для ухода за полостью рта и горлом, которые включают продукты в форме порошка, пасты или жидкости, и которые после применения удерживаются в течение времени, достаточного для контакта с поверхностью и внутренней слизистой оболочкой полости рта или носа или глотки. Такие продукты включают, например, жидкости для полоскания рта, леденцы для зубов и горла, растворы для полоскания горла, жевательную резинку, средства для чистки зубов или зубные пасты, зубочистки, зубные таблетки и порошки и растворы для местного применения для использования в стоматологии, а также сиропы от кашля, жевательные антациды и препараты, улучшающие пищеварение.

Приятное холодящее ощущение, создаваемое холодящими веществами, способствует повышению привлекательности и приемлемости продуктов. В частности, продукты для ухода за полостью рта, такие как средства для чистки зубов и жидкости для полоскания рта, составляются с использованием холодящих веществ, потому что они обеспечивают эффекты освежения дыхания и ощущение чистоты, прохлады, свежести во рту.

В настоящее время надежно установлено, что ощущения, такие как прохлада или холод, могут быть отнесены к активации рецепторов периферических нервных волокон раздражителем, таким как низкая температура или химическое холодящее вещество, вырабатывающих электрохимические сигналы, поступающие в мозг, который затем интерпретирует, организует и интегрирует поступающий сигнал(ы) в восприятие или ощущение. Разные классы рецепторов вовлечены в восприятие раздражителей низких температур или химических холодящих веществ чувствительных нервных волокон млекопитающих. Среди этих рецепторов был идентифицирован важный кандидат, принимающий участие в восприятии холода, названный холод- и ментол-чувствительным рецептором (CMR1) или TRPM8. Номенклатура TRPM8 для рецептора происходит от его определения как неселективного катионного канала семейства рецепторов преходящих потенциалов (TRP), который активируется раздражителями, включающими низкие температуры, ментол и другие химические холодящие вещества. Однако точные механизмы, лежащие в основе восприятия приятного холодящего ощущения на коже или поверхностях полости рта в настоящее время точно не определены. Хотя было продемонстрировано, что рецептор TRPM8 активируется ментолом и другими холодящими веществами, нет полного понимания того, какие другие рецепторы могут быть задействованы и в какой степени эти рецепторы должны стимулироваться или, возможно, подавляться, для того, чтобы общее воспринимаемое ощущение было приятным, холодящим и освежающим. Например, ментол широко используется в качестве холодящего агента, но ментол может также вызывать другие ощущения, включая покалывание, жжение, пощипывание и острую боль, а также мятный запах и горький вкус. Таким образом, можно предположить, что ментол воздействует на многие различные рецепторы, включая рецепторы холода, тепла, боли и вкуса. Однако сложно определить, как выделить именно те активности рецептора, которые приводили бы к конкретному ощущению, такому как приятная прохлада, без нежелательных ощущений, таких как горечь или раздражение. Также непонятно, каким образом контролировать активность холодящих веществ или других сенсорных агентов, так чтобы использование определенного сенсорного агента вызывало только желательное ощущение. Настоящее изобретение, таким образом, основано на открытии агентов, которые могут быть использованы для усиления и/или модулирования активности сенсорных материалов или веществ, вызывающих ощущения (sensates), в частности, холодящих соединений, таких как описанные ниже.

Было описано большое количество холодящих соединений природного или синтетического происхождения. Наиболее хорошо известным соединением является ментол, особенно I-ментол, который встречается в природных условиях в масле перечной мяты, особенно, Mentha arvensis L. и Mentha viridis L. Из изомеров ментола, I-изомер наиболее широко распространен в природе и типично представляет собой материал под названием ментол, обладающий холодящими свойствами. I-Ментол имеет характерный запах перечной мяты, чистый свежий вкус и создает холодящее ощущение при нанесении на кожу и слизистые поверхности. Другие изомеры ментола (неоментол, изоментол и неоизоментол) обладают до некоторой степени подобными, но не идентичными запахом и вкусом, то есть, некоторые из них имеют неприятные нотки, описанные как землистые, камфорные, затхлые. Наибольшее различие между изомерами заключается в их силе холодящего действия. L-Ментол обеспечивает наиболее сильное охлаждение, то есть имеет самый низкий порог холодящего ощущения, равный примерно 800 ppb (частей/миллиард), то есть концентрацию, при которой холодящий эффект может быть четко распознан. Другие изомеры при таком уровне содержания не создают холодящего эффекта. Например, сообщается, что d-неоментол имеет порог холодящего ощущения, равный примерно 25000 ppb, a I-неоментол - примерно 3000 ppb [R.Emberger and R.Hopp, "Synthesis and Sensory Characterization of Menthol Enantiomers and Their Derivatives for the Use in Nature Identical Peppermint Oils", Specialty Chemicals (1987), 7(3), 193-201]. Эти исследования продемонстрировали выдающиеся сенсорные свойства I-ментола по показателям прохлады и свежести и влияние стереохимии на активность таких молекул.

Многие из синтетических холодящих веществ являются производными или структурно родственны ментолу, то есть, содержат циклогексановый фрагмент и дериватизированы функциональными группами, включая карбоксамидные, кеталевые, сложноэфирные, простые эфирные и спиртовые. Примеры включают п-ментанкарбоксамидные соединения, такие как N-этил-п-ментан-3-карбоксамид, известный коммерчески как "WS-3", и другие материалы этого ряда, такие как WS-5 (N-этоксикарбонилметил-п-ментан-3-карбоксамид), WS-12 [N-(4-метоксифенил)-п-ментан-3-карбоксамид] и WS-14 (N-трет-бутил-п-ментан-3-карбоксамид). Примеры сложных ментанкарбоновых эфиров включают WS-4 и WS-30. Примером синтетического карбоксамидного холодящего вещества, структурно не родственного ментолу, является N,2,3-триметил-2-изопропилбутанамид, известный как "WS-23". Дополнительные примеры синтетических холодящих веществ включают спиртовые производные, такие как 3-(I-ментокси)пропан-1,2-диол, известный как ТК-10, изопулегол (под торговой маркой Coolact Р) и п-ментан-3,8-диол (под торговой маркой Coolact 38D), все доступные от фирмы Takasago; ментонглицеринацеталь, известный как MGA; ментиловые сложные эфиры, такие как ментилацетат, ментилацетоацетат, ментиллактат, известный как Frescolat®, поставляемые фирмой Haarmann and Reimer, и мономентилсукцинат, под торговой маркой Physcool, производства фирмы V.Mane. TK-10 описан в патенте США №4459425, на имя Amano et al. Другие спиртовые и простые эфирные производные ментола описаны, например, в GB 1315626 и в патентах США №№4029759; 5608119; и 6956139. WS-3 и другие карбоксамидные холодящие агенты описаны, например, в патентах США №№4136163; 4150052; 4153679; 4157384; 4178459 и 4230688. Дополнительные N-замещенные п-ментанкарбоксамиды описаны в WO 2005/049553A1, включая N-(4-цианометилфенил)-п-ментанкарбоксамид, N-(4-сульфамоилфенил)-п-ментанкарбоксамид, N-(4-цианофенил)-п-ментанкарбоксамид, N-(4-ацетилфенил)-п-ментанкарбоксамид, N-(4-гидроксиметилфенил)-п-ментанкарбоксамид и N-(3-гидрокси-4-метоксифенил)-п-ментанкарбоксамид. Другие N-замещенные п-ментанкарбоксамиды включают аминокислотные производные, такие как раскрытые в WO 2006/103401 и в патентах США №№4136163; 4178459 и 7189760, такие как этиловый сложный эфир N-((5-метил-2-(1-метилэтил)циклогексил)карбонил)глицина и этиловый сложный эфир М-((5-метил-2-(1-метилэтил)циклогексил)карбонил)аланина. Ментиловые сложные эфиры, включая сложные эфиры аминокислот, таких как глицин и аланин, раскрыты, например, в ЕР 310299 и в патентах США №№3111127; 3917613; 3991178; 55703123; 5725865; 5843466; 6365215; 6451844; и 6884903. Кеталевые производные описаны, например, в патентах США №№5266592; 5977166 и 5451404. Дополнительные агенты, структурно не родственные ментолу, но описанные как создающие аналогичный физиологический холодящий эффект, включают альфа-кетоенаминовые производные, описанные в патенте США №6592884 включая 3-метил-2-(1-пирролидинил)-2-циклопентен-1-он (3-МРС), 5-метил-2-(1-пирролидинил)-2-циклопентен-1-он (5-МРС) и 2,5-диметил-4-(1-пирролидинил)-3(2Н)-фуранон (DMPF); ицилин (также известный как AG-3-5, химическое название 1-[2-гидроксифенил]-4-[2-нитрофенил]-1,2,3,6-тетрагидропиримидин-2-он), описанный Wei et al., J. Pharm. Pharmacol. (1983), 35:110-112. Обзоры по холодящей активности ментола и синтетических холодящих веществ включают H.R.Watson, et al., J. Soc. Cosmet. Chem. (1978), 29, 185-200, и R.Eccles, J. Pharm. Pharmacol., (1994), 46, 618-630.

Идеально, холодящее вещество должно создавать ощущение прохлады или свежести, аналогичное вызываемому ментолом, но без определенных недостатков, ассоциированных с ментолом, таких как модификация вкуса, горькое послевкусие, неприятный вкус, сильный запах и ощущения жжения или раздражения, особенно в высоких концентрациях. Желательно, чтобы холодящие соединения практически не обладали отличительным запахом или вкусом, в то же время обеспечивая приятное свежее ощущение прохлады увеличенной продолжительности, так чтобы эффект мог ощущаться через значительный промежуток времени после использования, например, более 15 минут. Ментол обычно обеспечивает начальное сильное холодящее действие, но его эффект является в определенной степени преходящим, поскольку ощущение прохлады резко ослабевает через несколько минут после использования. В отличие от него, ряд холодящих соединений с более продолжительным действием могут не обеспечивать немедленного ощущения прохлады, то есть, через несколько секунд после применения, особенно при использовании в низких количествах. Таким образом, продолжает существовать потребность в средствах потенцирования активности химических холодящих веществ путем ускорения начала проявления холодящего ощущения, интенсификации холодящего ощущения, особенно в низких концентрациях, и создания более длительно действующего ощущения прохлады и свежести, чем обеспечиваемое ментолом.

Настоящее изобретение относится к открытию таких средств потенцирования и/или модулирования активности холодящего агента, описанных ниже.

Потенцирование/модулирование холодящей активности

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что увеличение потока или мобилизация ионов кальция в рецепторных клетках повышает активность холодящих веществ по показателям начала действия, интенсивности или силы воздействия и продолжительности. Это открытие является особенно неожиданным с учетом предшествующих сообщений о роли кальция в увеличении активности тепловых рецепторов и угнетении активности холодовых рецепторов [Н.Hensel and К. Schafer, "Effects of Calcium on Warm and Cold Receptors", Pflugers Arch. (191 A) 352: 87-90]. Последующие электрофизиологические исследования тепловых и холодовых рецепторов в носовой области кошки, проведенные Schafer и др., продемонстрировали, что уменьшение концентрации внешнего кальция вокруг рецепторов, вызванное введением EDTA - хелатирующего агента кальция, - приводит к увеличению активности холодовых рецепторов. Также сообщалось, что снижение концентрации кальция усиливает активность холодовых рецепторов [J. Neurophysiol. (1982) 47: 1017-1028; Physiol. Res. (1992) 41: 71-75]. Кроме того, сообщалось, что внутривенная инъекция растворов кальция человеку вызывает ощущение рассеянного тепла [J.Hirschsohn and H.Maendl Wien. Arch. Inn. Med. (1922) 4: 379-414]. По результатам этих исследований можно ожидать, что эффектом кальция должно быть ингибирование холодящей активности и усиление активности агентов, создающих ощущение тепла. Поэтому сделанное нами открытие потенцирующего действия кальция на холодящую активность является непредсказуемым и неожиданным.

Как продемонстрировано в сенсорных исследованиях, описанных ниже, потенцирующее действие ионов кальция зависит от ряда факторов, включая концентрацию ионов кальция и холодящего вещества, химическую природу холодящего вещества (веществ) и солюбилизацию холодящего вещества (веществ) в процессе использования. Было также обнаружено, что потенцирующий эффект ионов кальция на холодящие вещества, особенно на синтетические ментановые производные, дополнительно усиливается в присутствии ментола. Без желания ограничиваться теорией, укажем, что, как считается, ментол обеспечивает такой усиливающий эффект вследствие его способности непосредственно стимулировать определенные терморецепторы и открывать такие ионные каналы для мобилизации ионов кальция.

Исследования сенсорной оценки холодящей активности проводились с использованием методологии, разработанной на основании методики, описанной М.С.Meilgaard, et al. Sensory Evaluation Techniques. 4^th Ed. (2007). В одних исследованиях, панель из 11 обученных сенсорных экспертов оценивала холодящее ощущение, испытываемое после чистки щеткой зубов с использованием средства, содержащего холодящее вещество (вещества), с последующим полосканием водным средством для полоскания, содержащим источник ионов кальция. Члены экспертной группы чистили зубы щеткой, используя 1,5 грамма тестируемого средства для чистки зубов (содержащего холодящее вещество) или контроля (без холодящего вещества), и затем сплевывали. После сплевывания средства для чистки зубов, члены экспертной группы оценивали интенсивность охлаждения, присваивая ей числовое значение от 0 (отсутствие охлаждения) до 60 (интенсивное охлаждение). Члены экспертной группы затем полоскали рот 15 мл водного средства для полоскания (с кальцием или без него) и сплевывали. После сплевывания средства для полоскания, члены экспертной группы оценивали интенсивность охлаждения по такой же шкале от 0 до 60. Оценку производили в моменты времени 5, 15, 30, 45, 60 минут и т.д. При каждой оценке, членов экспертной группы инструктировали делать вдох через сжатые губы и оценивать общее холодящее ощущение. В этом тесте, численная оценка в 7,5 балла указывает на заметное или ощутимое охлаждение. Результаты приведены в Таблице 1 ниже.

Таблица 1.
Балльная оценка холодящего ощущения в различные моменты времени после применения
Холодящее вещество в пасте, ppm	Ca+2, ppm	Ca+2/холодящее вещество	0 мин.	5 мин.	15 мин.	30 мин.	45 мин.	60 мин.
75 ppm G-180	0	0	21,1	23,7	22,9	15,0	11,0	5,8
75 ppm G-180	271	3,6	17,5	18,3	20,7	16,8	13,3	8,4
75 ppm G-180	542	7,2	18,8	25,0	29,2	24,4	18,6	14,1
150 ppm G-180	0	0	16,7	16,0	25,7	19,5	10,0	1,5

150 ppm G-180	271	1,8	12,1	22,5	26,0	17,1	11,2	0
150 ppm G-180	542	3,6	15,1	21,9	27,2	24,8	18,2	8,0
1000 ppm WS-3	0	0	26,2	25,4	11,3	0	0	0
1000 ppm WS-3	271	0,3	23,8	21,4	10,8	2,4	0	0
1000 ppm WS-3	542	0,5	23,6	14,0	0	0	0	0
1500 ppm WS-3	0	0	18,1	29,4	12,7	0	0	0
1500 ppm WS-3	271	0,2	20,0	29,8	9,5	1,1	0	0
1500 ppm WS-3	542	0,4	19,3	23,7	5,0	2,7	0	0
1500 ppm ментола	542	0,4	18,0	17,5	4,4	0	0	0
1500 ppm ментола + 150 ppm G180	271	1,8	19,8	28,0	29,7	22,9	16,2	9,2
1500 ppm MGA	0	0	16,5	13,6	4,4	0	0	0
1500 ppm MGA	723	0,5	20,7	18,3	7,0	1,4	0	0
800 ppm WS-23	0	0	15,4	7,4	3,0	0	0	0
800 ppm WS-23	723	0,9	18,8	4,9	1,0	0	0	0
800 ppm WS-5	0	0	29,2	22,4	8,3	1,0	0	0
800 ppm WS-5	723	0,9	30,8	22,2	8,4	2,2	0	0
1000 ppm ментиллактата	0	0	23,0	12,7	2,3	0	0	0
1000 ppm ментиллактата	723	0,7	23,5	12,4	2,2	0	0	0
Холодящее вещество G-180 поставлялось фирмой Givaudan в виде 7,5% раствора в масле кудрявой мяты.

В общем, обеспечение присутствия ионов кальция приводило к потенцирующему эффекту, особенно, в отношении интенсивности и продолжительности охлаждения. Этот эффект особенно заметен для холодящих веществ, обозначенных MGA, химически - ментонглицеринацеталь, и холодящего вещества G-180, химически - N-(4-цианометилфенил)-п-ментанкарбоксамид, поставляемого фирмой Givaudan в виде 7,5% раствора в ароматизированном масле, таком как кудрявой мяты или перечной мяты. Добавление ионов кальция усиливало холодящий эффект для формулы 75 ppm G-180 до эффекта, соответствующего формуле 150 ppm G-180, что может позволить составлять композиции продуктов с более низкими уровнями содержания холодящего вещества. Этот результат особенно важен для таких холодящих веществ, как G-180, которое члены экспертной группы описали как создающее "жгучее" ощущение, особенно при использовании с повышенными уровнями содержания. Эффект кальция, по-видимому, является дозазависимым, причем более высокий уровень содержания кальция дает большее усиление охлаждения в концентрациях, испытанных для G-180. Однако как показывают данные, эффект также зависит от уровня содержания и химической структуры холодящего вещества, а также от весового соотношения кальция и холодящего вещества. Для ряда исследованных холодящих веществ не наблюдалось сколько-нибудь значительного потенцирующего эффекта кальция при использованных уровнях содержания холодящего вещества и кальция. Считается, что потенцирующий эффект кальция будет более заметным при низких уровнях содержания холодящего вещества и оптимизированном соотношении кальция к холодящему веществу. При высоких уровнях содержания холодящего вещества, кальций может обеспечивать скорее модулирующий эффект, такой как смягчение резких, жгучих, едких или горьких ощущений от холодящего вещества (веществ). Весовое соотношение кальция к холодящему веществу составляет по меньшей мере примерно 0,5 к 1, предпочтительно, по меньшей мере 1:1 или выше.

Усиливающий эффект кальция также наблюдался для MGA при уровне содержания 1500 ppm; то есть, охлаждение наблюдалось в момент времени 15 минут или больше. Для ментола при уровне содержания 1500 ppm аналогичный усиливающий эффект кальция не наблюдался. В отличие от этого, кальций увеличивал продолжительность холодящего эффекта при использовании G-180 до 60 минут. Однако объединение ментола с кальцием и G-180 увеличивало интенсивность охлаждения и длительность холодящего ощущения, особенно при повышенных величинах соотношения кальция к холодящему веществу. При этом ментол действует как потенцирующий агент.

Добавление внешнего источника ионов кальция является одним из способов увеличения потока ионов кальция в рецепторных клетках. Источником ионов кальция может быть любое физиологически приемлемое соединение кальция, включая неорганические или органические соли, такие как галогениды (хлорид, бромид, йодид, фторид), нитрат, нитрит, фосфат, пирофосфат, полифосфат, сульфат, карбонат, гипохлорит, формиат, ацетат, цитрат, лактат, малеат, глюконат, тартрат, глицерофосфат, бутират, изобутират, оксалат, пептид, фосфопептид, или оксиды или гидроксиды. Источник ионов кальция может быть водорастворимым, малорастворимым или нерастворимым и может обеспечивать минимальный уровень содержания, равный от по меньшей мере примерно 10 ppm ионов кальция до примерно 10000 ppm для проявления потенцирующей активности. Предпочтительно, добавленный источник кальция обеспечивает по меньшей мере примерно 50 ppm ионов кальция, предпочтительнее, от по меньшей мере примерно 150 ppm до примерно 500 ppm. Уровень содержания источника ионов кальция, конечно, также зависит от вторичных соображений, таких как эстетические характеристики и стабильность композиций. Некоторые соединения кальция могут изменять общий вкус композиций, например, на описанный как "меловой", и потому будут нежелательными в количествах, создающих такие эффекты.

Другим средством, которое, как было обнаружено, увеличивает поток ионов кальция в рецепторах, является добавление агентов, солюбилизирующих кальций, таких как фосфатные соединения, например фитат, полифосфат и органофосфаты. Считается, что такие соединения функционируют как носитель или агент транспортировки кальция, переносящие внешний кальций к рецепторам или помогающие транспорту ионов кальция, высвобождаемых из внутриклеточных запасов кальция при активации холодящим веществом. В описанных ниже исследованиях сравнивалось влияние различных компонентов композиций для ухода за полостью рта на внутриклеточные уровни содержания иона кальция (Са⁺²) в рецепторах TRPM8.

В этих исследованиях, клетки НЕК-23 (почка эмбриона человека), стабильно трансфицированные TRPM8 человека, выращивали в 15 мл питательной среды [высокоглюкозная DMEM (модифицированная по Дульбекко среда Игла) с добавкой 10% FBS (сыворотка плода коровы), 100 мкг/мл пенициллина/стрептомицина, 5 мкг/мл бластициндина и 100 мкг/мл зеоцина) в колбе на 75 см² в течение 3 дней при 37°С в инкубаторе для культур клеток млекопитающего, установленном на 5% СO₂. Клетки отделяли добавлением 2 мл буфера трипсин-EDTA (GIBCO® 25200, Invitrogen) в течение примерно 2-3 мин. Трипсин инактивируют добавлением 8 мл питательной среды. Клетки переносят в пробирку на 50 мл и центрифугируют при 850 об/мин в течение 3 минут для удаления среды. После центрифугирования на дне пробирки образуется осадок клеток, отделившихся от раствора супернатанта. Супернатант отбрасывают и клеточный осадок суспендируют в 1 мл свежей питательной среды, к которой прибавляют 5 мкл (12,5 мкг) индикатора кальция Fluo-4 AM (Molecular Probes, Inc.) и инкубируют в течение 30 мин при осторожном встряхивании (Fluo-4 представляет собой флуоресцентный краситель, используемый для количественного определения клеточных концентраций Ca²⁺ в диапазоне значений от 100 нМ до 1 мкМ). По истечении 30 минут добавляют 45 мл буфера для анализа [I×HBSS (сбалансированный солевой раствор Хенка), 20 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота)] для смывания клеток, и полученную смесь затем центрифугируют при 850 об/мин в течение 3 минут для удаления избытка буфера и индикатора кальция Fluo-4 AM. Клетки осадка ресуспендируют в 10 мл буфера для анализа и аликвоты 90 мкл (ок. 50000 клеток) на лунку помещают на 96-луночный планшет для анализов, содержащий 10 мкл тестируемого соединения (1 мМ в буфере для анализа, конечная концентрация 100 мкМ) или контрольного буфера и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут. Через 30 минут планшет помещают в планшет-ридер с флуорометрической визуализацией (FLIPR фирмы Molecular Devices) и регистрируют базовую флуоресценцию (длина волны возбуждения 488 нм и длина волны излучения 510 нм). Анализ FLIPR является принятым способом детектирования изменений внутриклеточной концентрации кальция. Затем прибавляют 20 мкл 37,5 мкМ агониста TRPM8 холодящего вещества G-180 в буфере для анализа (конечная концентрация 6,25 мкМ) и регистрируют флуоресценцию. Для определения прямого эффекта воздествия тестируемых соединений на TRPM8, флуоресценцию измеряют немедленно после прибавления каждого соединения. Результаты приведены в Таблице 2 ниже. Из испытанных соединений холодящее вещество G-180 активировало рецептор TRPM8, на что указывает значительное увеличение потока ионов кальция по сравнению с контролем. В одном тесте наблюдалось позитивное модулирование активности G-180 для фитиновой кислоты, на что указывает 23,36% увеличение флуоресце