Пептиды направленного действия на vegfr-1/nrp-1

Пептиды направленного действия на vegfr-1/nrp-1

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение создано при финансовой поддержке правительства США за счет грантов CA103056 и CA100632 Национального Института Здоровья. Таким образом, правительство США имеет определенные права на настоящее изобретение.

По данной заявке испрашивается приоритет предварительной заявки США №60/954750, зарегистрированной 8 августа 2007 года, описание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение затрагивает области молекулярной медицины и мишень-ориентированной доставки терапевтических средств. В частности, настоящее изобретение имеет отношение к идентификации новых пептидных последовательностей, которые селективно воздействуют на VEGFR-1 и NRP-1 как на терапевтические мишени для лечения и выявления неоваскулярных и ангиогенных VEGF-ассоциированных нарушений, включая, в числе прочего, рак, ожирение, диабет, астму, артрит, цирроз и глазные болезни.

ПРЕДПОСЫЛКИ

Кровеносные сосуды являются неотъемлемой частью организма, доставляющей кислород и питательные вещества почти ко всем органам и тканям. Большинство сосудов образуется во время эмбриогенеза, а во взрослом организме формирование новых кровеносных сосудов (процесс, названный ангиогенезом) ограничено и, в основном, происходит во время заживления раны и нормального менструального цикла у женщин. Это благоприятствует проведению терапии, поскольку ряд заболеваний прогрессирует только в случае индуцирования ими формирования новых кровеносных сосудов; рак, ожирение, диабет, астма, артрит, цирроз и глазные болезни причисляются к большинству заболеваний, течение которых, по-видимому, можно замедлить или остановить с помощью ингибиторов ангиогенеза.

Сосудистый эндотелиальный ростовой фактор (VEGF) является основной молекулой, контролирующей ангиогенез, и три анти-VEGF лекарственных препарата были утверждены Управлением по контролю продуктов питания и лекарственных средств США для лечения определенных типов рака с хорошим, но не идеальным, терапевтическим эффектом (Kamba and McDonald, 2007). Таким образом, разработка лекарственных средств нового поколения, избирательно воздействующих на VEGF-опосредованный сигнальный путь, очевидно, внесет значительный вклад в регламентацию методов лечения различных заболеваний. VEGF является ключевым регулятором ангиогенеза и стимулирует деление и миграцию эндотелиальных клеток путем связывания с тирозинкиназным рецептором VEGF (VEGFR-1 и -2) на клеточной поверхности и с нейрофилинами (NRP). Поскольку VEGFR-2 является основным медиатором внутриклеточной митогенной активности VEGF, большинство лекарственных препаратов в клинике на сегодняшний день нацелены на прямое или опосредованное воздействие на этот специфический рецептор. С другой стороны, VEGFR-1 и NRP-1 первоначально рассматривались в качестве ловушки или акцептора VEGF (VEGFR-1) или модулятора активности VEGFR-2 (NRP-1). Однако исследования последних нескольких лет свидетельствуют об обратном. Оба рецептора играют значительную роль в ангиогенезе (Carmeliet et al., 2001; Autiero et al., 2003; Luttun et al., 2004; Kaplan et al., 2005; Wu et al., 2006; Pan et al., 2007) и являются важными мишенями при терапии ангиогенеза. Например, моноклональные антитела, направленные против VEGFR-1 и NRP-1, демонстрируют выдающиеся результаты при их использовании в качестве противоопухолевых средств, особенно в сочетании с химиотерапией (Wu et al., 2006; Pan et al., 2007).

Многие анти-VEGF лекарственные препараты, такие как бевацизумаб (Авастин®) и ранибизумаб (Люцентис®), используются в клинической практике и обладают определенной долей эффективности при лечении и управлении течением неоваскулярных нарушений, включая различные типы рака, а также неоваскулярные возрастные нарушения, возрастную дегенерацию желтого пятна. К сожалению, при проведении такой неспецифической анти-VEGF терапии были выявлены значительные побочные эффекты, включая, в частности, токсический эффект на сердечную мышцу (например, боль в груди, приступ стенокардии, микроинсульты, острая сердечная недостаточность и инфаркт миокарда, кровоизлияние, протеинурия, гипертензия, застойная сердечная недостаточность, артериальная тромбоэмболия и перфорация желудочно-кишечного тракта). Исследования связывают данные побочные эффекты с тем фактом, что лекарственные средства этого класса, то есть лекарственные препараты, которые напрямую воздействуют на сосудистый эндотелиальный ростовой фактор (VEGF-A; VEGF₁₆₅) в отличие от селективного воздействия на рецепторы, могут отрицательно воздействовать на нормальные VEGF-опосредованные сигнальные пути (Betsholtz et al., 2006). VEGF-A занимает особое положение среди многих молекул, вовлеченных в регуляцию образования кровеносных сосудов. Во время эмбриогенеза этот фактор контролирует множество процессов, начиная от распространения недифференцированных клеток-предшественников сосудов до контроля пролиферации и миграции эндотелиальных клеток, реструктурирования сосудов, артериовенозного разграничения (Ferrara, 2004). Должный уровень белка VEGF-A абсолютно критичен для развития сосудов, поскольку уменьшение его экспрессии наполовину или увеличение таковой в два раза фатальны для эмбриона мыши.

Токсичность, связанная с VEGF-ориентированной терапией, по-видимому, обусловлена исчезновением нормального капиллярного русла и клеток сердца наравне с VEGF, который необходим для нормальной функции клеток и васкуляризации. Примечательно, что VEGF-зависимые капилляры схожи по своим характеристикам в том, что они проявляют высокую экспрессию рецепторов VEGF, таких как рецепторы типа 2 и 3 (VEGFR-2 и VEGFR-3, соответственно), и имеют небольшую экспрессию рецептора VEGFR-1 или она вовсе отсутствует. Однако, VEGFR-1 рецепторы экспрессируются в тканях, являющихся соответствующими мишенями при определенном заболевании, включая сосуды сетчатки глаза и сосуды опухоли. Таким образом, было бы целесообразным разработать лекарственные анти-VEGF препараты, избирательно воздействующие на рецепторы VEGFR-1, со сниженной токсичностью, но сохраняющие желаемую терапевтическую активность. Настоящее изобретение нацелено на создание пептидных лигандов селективно направленных на VEGFR-1.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение преодолевает недостатки предыдущего уровня техники путем предоставления способов и композиций для селективного воздействия на VEGFR-1 и NRP-1 (в дальнейшем именуемые «VEGFR-1/NRP-1») путем использования мотива LPR (Leu-Pro-Arg) и более предпочтительного _D(LPR). Селективное направленное действие на VEGFR-1/NRP-1 путем использования мотива LPR пригодно, например, для лечения рака или других заболеваний, ассоциированных с ангиогенезом или ростом сосудов, таких как ожирение, диабет, астма, артрит, цирроз и глазные болезни.

В определенных вариантах осуществления изобретение касается выделенных LPR пептидов, а именно пептидов направленного действия, в состав которых входит непрерывная LPR-последовательность, например, расположенная на амино- или карбокси-конце пептида или внутри него. Хотя расположение LPR-последовательности в конце пептида является наиболее предпочтительным, предполагается, что внутреннее расположение LPR обеспечит, тем не менее, возможность направленного действия на VEGFR-1/NRP-1. Для удобства в приготовлении и использовании такой вариант осуществления изобретения нацелен на выделенные пептиды из 10 или менее аминокислот, содержащие как минимум непрерывную аминокислотную последовательности Leu Pro Arg. Ввиду этого, даже более короткие пептиды размером в 7 или 5 аминокислот или еще меньше и даже сам по себе LPR трипептид наиболее предпочтительны. Таким образом, пептиды направленного воздействия по настоящему изобретению могут содержать 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 аминокислот, в которых непрерывная LPR последовательность или таковая в SEQ ID NO:1 расположена внутри.

В других вариантах осуществления изобретения авторы предлагают на рассмотрение специфические пептиды, содержащие LPR последовательности, которые могут быть созданы в циклической форме как, например, пептиды, имеющие цистеиновый остаток («С») на обоих концах и превращающиеся, где это необходимо, в циклическую форму путем образования дицистеина (т.е. цистина). Примером такого пептида является Cys Leu Pro Arg Cys (SEQ ID NO:1). Такие циклические пептиды могут иметь огромное значение, поскольку дисульфидная связь в пептидах придает им выраженную устойчивость к химическому, температурному или ферментативному распаду. Такие циклические пептиды могут иметь особое значение в терапевтических и диагностических способах применения, где имеет место сниженная доступность, подверженность протеолизу и короткое время полу-жизни in vivo.

В других вариантах осуществления изобретения рассматривается использование D-аминокислот для приготовления всех или части вышеупомянутых пептидов. Пептиды, состоящие из D-аминокислот, имеют определенные преимущества перед теми, которые содержат L-аминокислоты, в том, что использование D аминокислот придает пептидам направленного действия, в большинстве случаев, устойчивость к действию протеаз и пептидаз. В частности, с этой точки зрения, предпочтительны пептиды направленного действия, состоящие целиком из D-аминокислот, такие как _D(Leu Pro Arg) и _D(Cys Leu Pro Arg Cys) (SEQ ID NO:1).

В определенных вариантах осуществления изобретения вышеупомянутые LPR молекулы могут быть функционально связанными со второй молекулой или веществом. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения связь между молекулами является ковалентной, примерами которой являются химический конъюгат (образован посредством химического линкера) или слитые конструкты (образованы путем слияния кодирующей области вышеупомянутого пептида с кодирующей областью целевого белка или пептида, необходимого для взаимодействия с VEGFR-1/NRP-1, без сдвига рамки считывания). В случае мишень-ориентированных пептидов или белков, пептиды направленного действия могут быть расположены вблизи или непосредственно на амино- или карбокси-конце (то есть в пределах первых или последних 20 аминокислот) белка или пептида, подлежащего взаимодействию с мишенью.

В различных вариантах осуществления изобретения вторая молекула или вещество является диагностическим средством, лекарственным средством, химиотерапевтическим средством, радиоизотопом, анти-ангиогенным средством, про-апоптотическим средством, цитотоксическим средством, пептидом, белком, гормоном, ростовым фактором, цитокином, антибиотиком, антителом или его фрагментом или одноцепочечным антителом, визуализирующим веществом, фактором выживаемости, анти-апоптотическим средством, антагонистом гормона или антигеном. Эти молекулы или вещества представляют собой практически любую молекулу, которая может оказывать терапевтический или диагностический эффект при лечении рака, может быть присоединена к LPR молекуле направленного действия и/или назначена пациенту в рамках изобретения.

Исходя из этого, в случае, если молекулы, подлежащие, взаимодействию, являются про-апоптотическими веществами, типичными их представителями являются этопозид, церамид, сфингомиелин, Bcl-2, Bax, Bid, Bik, Bad, каспаза-3, каспаза-8, каспаза-9, fas, fas лиганд, fadd, fap-1, tradd, faf, rip, рипер, апоптин, интерлейкин-2 превращающий фермент, аннексин V, (KLAKLAK)₂ (SEQ ID NO:2); (KLAKKLA)₂ (SEQ ID NO:3); (KAAKKAA)₂ (SEQ ID NO:4); или (KLGKKLG)₃ (SEQ ID NO:5). Следует отметить, что как и для всех пептидов по настоящему изобретению, вышеупомянутые последовательности могут быть представлены либо в D-, либо в L-форме. Например, для проапоптотических пептидов (например, SEQ ID NO:2-5) обе D- и L-формы, по-видимому, имеют схожую проапоптотическую активность, при этом D-форма имеет значительно более продолжительное время полу-жизни вследствие ее относительной протеиназной устойчивости. Хотя на практике в некоторых случаях, преимущественной является L-форма в связи с потенциально сниженными токсическими побочными эффектами (вследствие ее более короткого времени полужизни).

Кроме того, в вариантах осуществления изобретения, где молекулы, подлежащие взаимодействию, являются анти-ангиогенными веществами, типичными их представителями являются тромбоспондин, ангиостатин как, например, ангиостатин 5, ангиотензин, пептиды ламинина, пептиды фибронектина, ингибиторы активатора плазминогена, ингибиторы тканевой металлопротеиназы, интерфероны, цитокин как, например, интерлейкин 12, тромбоцитарный фактор 4, IP-10, Gro-β, 2-метоксиэстрадиол, белок, связанный с пролиферином, карбоксиамидотриазол, CM101, маримастат, пентозанполисульфат, ангиопоэтин 2 (Регенерон), гербимицин А, PNU145156E, фрагмент пролактина 16K, линомид, талидомид, пентоксифиллин, генистеин, TNP-470, эндостатин как, например, эндостатины XVII и XV, паклитаксел, доцетаксел, полиамины, протеасомный ингибитор, ингибитор киназ, сигнальный пептид, аккутин, цидофовир, винкристин, блеомицин, AGM-1470, миноциклин, C-концевой гемопексиновый домен матриксной металлопротеиназы-2, крингл домен 5 плазминогена человека, слитый белок эндостатина и ангиостатина, слитый белок эндостатина и крингл домена 5 плазминогена человека, монокин, индуцируемый интерфероном гамма (Mig), слитый белок Mig и IP10, растворимый FLT-1 (fins-подобный тирозинкиназный рецептор 1), киназный инсерционный домен-содержащий рецептор (KDR), фактор пигментного эпителия, интерферон-альфа, ингибитор сигнального пути (SU5416, SU6668, SUGEN, Южный Сан-Франциско, Калифорния).

В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения, где молекулы, подлежащие взаимодействию, являются цитокинами, типичными их представителями являются интерлейкин 1 (IL-1), IL-2, IL-5, IL-10, IL-11, IL-12, IL-18, IL-24, интерферон-γ (INF-γ), INF-α, INF-β, фактор некроза опухолей как, например, TNF-α, или GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор).

Вышеупомянутые примеры являются только репрезентативными и не предполагают исключение других проапоптотических веществ, анти-ангиогенных веществ или цитокинов, известных в данной области техники.

В других вариантах осуществления изобретения выделенные пептиды могут быть присоединены к макромолекулярному комплексу. В предпочтительных вариантах осуществления изобретения макромолекулярным комплексом является вирус, бактериофаг, бактерия, липосома, микрочастица, наночастица (например, золотая наночастица), магнитный шарик, дрожжевая клетка, клетка млекопитающих или бактериальная клетка. В случае вирусов особенно предпочтительны бактериофаг, лентивирус, паповавирус, аденовирус, ретровирус, AAV, вирус осповакцины, вирус герпеса. Эти примеры являются только репрезентативными и макромолекулярные комплексы в рамках настоящего изобретения могут включать фактически любой комплекс, который может быть присоединен к пептиду направленного действия и назначен пациенту. В других предпочтительных вариантах осуществления изобретения выделенный пептид может быть присоединен к эукариотическим экспрессионным векторам, среди которых более предпочтительным является вектор для генной терапии.

В следующем варианте осуществления изобретения выделенный пептид может быть присоединен к твердым носителям, среди которых более предпочтительны магнитные шарики, шарики сефарозы, агарозные шарики, нитроцеллюлозная мембрана, нейлоновая мембрана, матрикс колоночной хроматографии, матрикс высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC), матрикс высокоскоростной жидкостной хроматографии (FPLC), пластины микротитратора или микрочип.

В следующих вариантах осуществления изобретения рассматриваются слитые конструкты белков, включающие любой вышеупомянутый LPR пептид направленного действия, соединенный с выбранным белком, с образованием слитого конструкта белка, в котором образующийся слитый конструкт белка, благодаря дополнительному включению LPR молекулы направленного действия, который является искусственно созданным, а не является природным белком. В целом, в таких предпочтительных вариантах осуществления изобретения такие слитые конструкты белков могут быть созданы с использованием любого вышеупомянутого класса молекул.

В следующих вариантах осуществления изобретения рассматривается создание конструкта, нацеленного на взаимодействие с VEGFR-1/NRP-1, включающего полученный LPR пептид направленного действия, как описано выше, и соединяющий пептид с молекулой, с созданием конструкта преимущественно путем ковалентной сшивки. Как упоминалось выше, когда молекула, подлежащая взаимодействию, является белком или пептидом, предпочтительными мишень-ориентированными конструктами будут те, в которых пептид направленного действия присоединен вблизи или непосредственно на амино- или карбокси-конце такой молекулы.

Настоящее изобретение также нацелено на способ мишень-ориентированной доставки молекулы или белка к клеткам, экспрессирующим VEGFR-1 или NRP-1, где способ заключается в получении LPR пептида направленного действия или конструкта слитых белков, как описано выше, или мишень-ориентированного конструкта, как описано выше, и введение пептида или слитого конструкта белков в клеточную популяцию, которая содержит клетки, экспрессирующие VEGFR-1 или NRP-1, с целью доставки, тем самым, молекулы или белка к указанным клеткам. В целом, если конъюгат или слитый конструкт белков планируется использовать в диагностических или терапевтических целях у субъекта, например человека, конъюгат или слитый конструкт белков создают в виде фармацевтически приемлемой композиции, которая вводится субъекту.

Предполагается, что в случае терапевтического лечения пациентов, имеющих заболевание или нарушения, субъект будет, как правило, нуждаться в проведении анти-ангиогенной терапии. К таким заболеваниям или нарушениям относятся гиперпролиферативные заболевания, нарушение веса, ожирение, диабет, астма, артрит, цирроз или глазные болезни. Типичными гиперпролиферативными заболеваниями, рассматриваемыми для проведения терапии с использованием терапевтических конъюгатов в соответствии с изобретением, являются ревматоидный артрит, воспалительное заболевание кишечника, остеоартрит, лейомиома, аденома, липома, гемангиома, фиброма, окклюзия сосудов, рестеноз, атеросклероз, пре-неопластические поражения (такие как железистая гиперплазия, внутриэпителиальная неоплазия предстательной железы), рак in situ, волосатая лейкоплакия рта или псориаз.

Изобретение также рассматривает, что конъюгаты данного изобретения будут пригодными для лечения различных видов рака, в частности, тех видов, которые чрезвычайно ангиогенны. Типичными видами рака являются рак десны, языка, легких, кожи, печени, почек, глаз, мозга, лейкемия, мезотелиома, нейробластома, рак головы, шеи, молочной железы, поджелудочной железы, предстательной железы, почек, кости, яичек, яичников, шейки матки, пищевода, матки, мочевого пузыря, желудочно-кишечного тракта, лимфома, рак толстой кишки, саркома, рак желудка.

В следующих аспектах изобретения рассматривается то, что субъект, подлежащий лечению, имеет глазные болезни или нарушения, характеризующиеся внутриглазной клеточной пролиферацией или неоваскуляризацией. Типичными нарушениями являются возрастная дегенерация желтого пятна, пролиферативная диабетическая ретинопатия, ретинопатия недоношенных, глаукома, пролиферативная витреоретинопатия, неоваскуляризация вследствие глазного ишемического синдрома, неоваскуляризация вследствие окклюзии разветвления вены сетчатки, неоваскуляризация вследствие окклюзии центральной вены сетчатки или неоваскуляризация вследствие ретинопатии при серповидно-клеточной анемии.

В других аспектах изобретения рассматривается то, что конъюгаты по настоящему изобретению будут пригодными для лечения нарушений веса, таких как ожирение.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1A, 1B. _D(LPR) ингибирует неоваскуляризацию in vivo. Репрезентативные иллюстрации матрикса матригеля, содержащего 500 мкг/мл _D(LPR) или контрольного пептида после 7-дневной имплантации (а, нижняя панель). Матрикс матригеля был отделен и ангиогенез был количественно оценен путем измерения содержания гемоглобина в матриксе матригеля. Гистограмма построена для репрезентативных животных из того же эксперимента (а, верхняя панель). (b) Количество сосудов, положительных по фактору Виллебранда человека (Р<0,01).

Фиг.2А, 2B, 2C. Ингибирование ангиогенеза сетчатки, индуцированного ишемией, под действием _D(LPR). (а) Неоваскуляризация сетчатки была индуцирована у новорожденных мышей C57B6 под воздействием 75% кислорода с последующей терапией _D(LPR) (ежедневные инъекции в дозировке 20 мг/кг). (b) Окрашенные гематоксилином и эозином срезы сетчатки (день Р19) демонстрировали значительное снижение образования новых кровеносных сосудов на внутренней поверхности сетчатки (отмечено стрелками) по сравнению с контрольными животными. (с) Количественное определение ядер эндотелиальных клеток внутренней поверхности на Р19 день.

Фиг.3А, 3В. Лечение мышей, имеющих опухоль, с использованием _D(LPR) замедляет опухолевый рост. Мыши Balb/c, имеющие опухоль, происходящую из EF43.fgf4, были сгруппированы (N=7) и ежедневно получали 50 мг/кг _D(LPR) или его циклическую форму _D(CLPR), контрольный пептид или только носитель. (а) После пяти дней лечения животные, получавшие _D(LPR) или его циклическую форму _D(CLPRC), демонстрировали сниженный объем опухоли по сравнению с контрольными животными. (b) На гистограмме показаны медиана и дисперсия. Различие в объеме опухоли между животными, получавшими _D(LPR) или его циклическую форму _D(CLPRC), было статистически значимо (Р<0,02). Два независимых эксперимента были выполнены со схожими результатами.

Фиг.4А, 4В, 4С. Лечение ожирения с использованием VEGF-подобного соединения _D(CLPRC). Страдающих ожирением мышей (C57BL/6), вскормленных на высококалорийной и богатой жирами диете (вес от 40 до 50 граммов), использовали в этом исследовании. Животных разделили на четыре группы и проводили ежедневную терапию с помощью (а) VEGF-подобного пептида _D(CLPRC), инъецируемого интраперитонеально (50 мг/кг); (b) пептидного сжигателя жира (CKGGRAKDC-GG-_D(KLAKLAK)₂; Kolonin et al., 2004), инъецируемого подкожно в дозировке 1 мг/кг в сочетании с VEGF-подобным пептидом _D(CLPRC) в дозировке 50 мг/кг; или (с) сжигателя жира в дозировке 3 мг/кг. Животным в контрольной группе инъецировали только носитель (фосфатно-солевой буферный раствор, PBS).

ОПИСАНИЕ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

1. Обзор

Пептиды, идентифицированные с помощью комбинаторных библиотек, лидируют в области разработки и синтеза лекарственных средств. Они могут быть быстро синтезированы и легко модифицированы с большим разнообразием функциональных групп, обеспечивая науку и медицину эффективными средствами для создания и направленного действия лекарственных средств. Ввиду их небольшого молекулярного веса по сравнению с макромолекулами, такими как антитела, пептиды имеют преимущество в тканевой проницаемости и биораспределении, что делает их исключительными ведущими веществами в области открытия и разработки лекарственных средств (обзорная статья Falciani et al., 2005). Действительно, пептиды, идентифицированные методом фагового дисплея, были успешно использованы in vivo в мишень-ориентированной терапии с целью доставки химиотерапевтических препаратов (Arap, 1998#10), проапоптотических пептидов (Ellerby, 1999#69) или доставки вирусов для визуализации и генной терапии (Hajitou, 2006#6744). Однако их использование в разработке лекарственных препаратов было затруднено из-за наличия проблем.

Пептиды сами по себе не подходят для использования в качестве лекарственных средств, поскольку они быстро распадаются протеазами и удаляются из плазмы. Экспрессия протеаз зачастую повышена в тех биологических процессах, в которых необходимы клеточная пролиферация, миграция и тканевая перестройка (общие для большинства патологических процессов, таких как ангиогенез), приводя к повышенной локальной протеолитической активности и деградации пептида. С точки зрения создания лекарственного препарата, пептиды часто демонстрируют значительную конформационную вариабельность, обуславливая трудоемкость и сложность структурных исследований (Giordano et al., 2005). Таким образом, создание пептидомиметиков на основе пептидов, идентифицированных методом фагового дисплея, может оказаться сложной задачей и обычно ограничивается фармацевтическими компаниями или лабораториями с синтетическими возможностями и доступом к большим химическим библиотекам.

Ангиогенезом называется прорастание новых кровеносных сосудов из предсуществующих, и он является неотъемлемым компонентом роста и метастаза опухоли (Folkman, 1971) так же, как и ряда патологических нарушений, таких как диабет, псориаз, ожирение и ревматоидный артрит (Carmeliet, 2005). В период половой зрелости ангиогенез происходит при заживлении ран, беременности и менструального цикла, и, таким образом, лекарственные средства, нацеленные на ангиогенные кровеносные сосуды, по-видимому, имеют важное клиническое применение при многих заболеваниях (Carmeliet et al., 2005). Сосудистый эндотелиальный ростовой фактор (VEGF) и его рецепторы были в центре внимания в данной отрасли науки вследствие их ведущей роли в образовании сосудов. VEGF оказывает свое действие посредством связывания с тирозинкиназными рецепторами (VEGFR-1, VEGFR-2) и с нейрофилином-1 (NRP-1) (Olsson et al., 2006). Большинство внутриклеточных сигнальных путей и митогенных воздействий VEGF опосредованы VEGFR-2, и несколько лекарственных препаратов, нацеленных на данный метаболический путь, находятся в настоящее время в стадии исследований в клинике (Cardones & Banez, 2006; Schneider & Sledge, 2007). Хотя VEGFR-1 и NRP-1 играют важную роль в данном процессе, вначале их воспринимали без энтузиазма в качестве возможных терапевтических средств. Все изменилось, и исследования, проведенные за последние несколько лет, предполагают, что оба рецептора играют значительную роль в ангиогенезе (Luttun et al., 2004; Wu et al., 2006; Pan et al., 2007). Исследования генных делеций показали, что VEGFR-1 и NRP-1 необходимы во время образования сосудов. Обе молекулы являются рецепторами для VEGF и плацентарного ростового фактора (PlGF), и последний совместно с VEGFR-1 вовлечен в патологический ангиогенез (Carmeliet et al., 2001), опухолевый рост (Luttun et al., 2002), увеличивая прохождение сигнала в клетке посредством перекрестной активации VEGFR-1/VEGFR-2 (Autiero et al., 2003) и рекрутирование клеток-предшественников из костного мозга во время неоваскуляризации (Jin et al, 2006; Li et al., 2006). Недавние исследования также предположили, что рекрутирование VEGFR1+ гематопоэтических клеток-предшественников важно для инициации метастазирования опухоли (Kaplan et al., 2005). Кроме того, NRP-1 не только усиливает связывание VEGF с VEGFR-2 (Soker et al., 2002), но также индуцирует контактирование и миграцию эндотелиальных клеток независимо от активации VEGFR-2 (Wang et al., 2003; Murga et al., 2005). Моноклональные антитела, направленные против VEGF-связывающего домена NRP-1 и против VEGFR-1, уменьшают как ангиогенез, так и опухолевый рост (Wu et al., 2006; Pan et al., 2007). Из этого следует, что лекарства, нацеленные на сигнальные пути через VEGFR-1 и NRP-1, по-видимому, найдут важное применение в клинике.

Настоящее изобретение представляет уникальные ингибиторы ангиогенеза и вещества направленного действия на VEGFR-1, LPR и _D(LPR), которые демонстрируют значительное снижение ангиогенеза в трех различных испытаниях. _D(LPR) также ингибировал неоваскуляризацию в двух животных моделях после системного применения. Принимая во внимание устойчивость _D(LPR) к деградации под действием смеси панкреатических ферментов, эти данные указывают на то, что это соединение и более длинные структуры пептидов, содержащие данную последовательность, вероятно, уцелеют в желудочно-кишечном тракте и могут быть введены орально пациентам. Таким образом, настоящее изобретение преодолевает недостатки предыдущего уровня техники путем идентификации LPR мотива для приготовления соединений направленного действия на VEGFR-1/NRP-1, терапевтических и/или диагностических средств, например, для лечения и/или выявления неоваскулярных или ангиогенных VEGF-ассоциированных нарушений, включая, без ограничения, рак, ожирение, диабет, астму, артрит, цирроз и глазные болезни.

В определенных вариантах осуществления изобретения рассматриваются специфические молекулы направленного действия, подлежащие взаимодействию с клетками, экспрессирующими VEGFR-1/NPR-1, включая, в более общем смысле, пептиды, полипептиды и белки с модификациями в виде вставки LPR мотива либо внутри, либо, что более предпочтительно, на N- или C-конце такого пептида или белка, либо вблизи этих концов. Примечательно, что хотя D-форма аминокислоты более предпочтительна вследствие ее значительной устойчивости к деградации протеазами, настоящее изобретение не исключает использование менее предпочтительной L-формы или смеси D- и L-аминокислот. Определенные варианты осуществления изобретения касаются молекул направленного действия на VEGFR-1/NPR-1, которые функционально связаны с терапевтическими или диагностическими средствами. В определенных вариантах осуществления изобретения терапевтическим средством является вирус, который можно сконструировать для экспрессии, либо вставить или соединить пептиды направленного действия на VEGFR-1/NPR-1 с белками вирусной оболочки или файбер-белок. Мишень-ориентированные вирусы затем могут быть использованы для генной терапии с целью лечения различных заболеваний, включая рак. Способность селективно действовать на VEGFR-1/NPR-1 в сосудистой системе около опухоли и/или в ней самой с помощью пептидов, модифицированных пептидов, антител, вирусов и/или других аффинных реагентов обеспечивает значительное преимущество при лечении рака, что может обусловливать повышенную эффективность и результативность.

2. Определения

Используемая в данном описании изобретения форма единственного числа может означать один или более. Используемые в настоящем описании формул(ы) изобретения слова в единственном числе в сочетании со словом «содержащий» могут означать один или более одного. Применяемое в настоящем документе слово «другой» может означать, по крайней мере, второй или более.

Термин «молекула направленного действия» охватывает различные типы аффинных реагентов, которые могут быть использованы для улучшения локализации или связывания вещества в определенном очаге у животных, включая органы, ткани, определенные типы клеток, пораженные ткани или опухоли. Молекулами направленного действия могут быть пептиды, пептидные миметики, полипептиды, антитела, подобные антителам молекулы, нуклеиновые кислоты, аптамеры и фрагменты вышеуказанного. Молекулами направленного действия также являются небольшие молекулы. В определенных вариантах осуществления изобретения молекулы направленного действия могут улучшить локализацию вещества в клетках, экспрессирующих VEGFR-1/NRP-1 внеклеточно, то есть VEGFR-1/NRP-1, связанные с клеточной поверхностью или связанные с окружающим внеклеточным матриксом. Селективным связыванием молекулы направленного действия по настоящему изобретению, например, пептида направленного действия, а также вариантов и фрагментов вышеуказанного, называется связывание молекулы направленного действия с молекулой-мишенью (например, VEGFR-1/NRP-1) при отсутствии значительного связывания с посторонними белками. Считается, что молекула направленного действия селективно связывается, даже если она также связывается с другими белками, которые в значительной степени не гомологичны мишени при условии, что такие белки имеют гомологию с фрагментом или доменом мишени пептида антитела. В этом случае будет понятно, что связывание молекулы направленного действия с мишенью является селективным, несмотря на некоторую степень перекрестной реактивности. Как правило, можно оценить степень перекрестной реактивности и дифференцировать ее от связывания с мишенью.

«Пептид направленного действия» - это пептид, состоящий из непрерывной последовательности аминокислот LPR и характеризующийся селективной локализацией в органе, ткани или типе клеток, заключающейся в специфическом связывании с внеклеточным белком или молекулой, которые специфически экспрессируются или образуются в специфической ткани или типе(ах) клеток. Селективная локализация может быть определена, например, методами, представленными ниже, в которых очищенная пептидная последовательность направленного действия встроена в белок, представленный на внешней поверхности фага.

Термин «субъект» означает, главным образом, млекопитающее. В определенных вариантах осуществления изобретения, субъектом является мышь, кролик, свинья, лошадь, корова, кошка, собака, овца, козел или обезьяна. В одном из аспектов осуществления изобретения субъектом является человек.

3. Белки и пептиды

В определенных вариантах осуществления настоящее изобретение касается новых композиций, включающих, по крайней мере, один белок или пептид. Используемые в данном описании изобретения белок или пептид, в основном, представляют собой в числе прочего белок размером более 200 аминокислот вплоть до полноразмерной последовательности, транслируемой с гена; полипептид размером приблизительно более чем 100 аминокислот; и/или пептид размером от приблизительно 3 до приблизительно 100 аминокислот. Для удобства термины "белок", "полипептид" и "пептид" используются в данном документе взаимозаменяемо.

В определенных вариантах осуществления изобретения размер, по крайней мере, одного белка или пептида составляет, в числе прочего, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, приблизительно 110, приблизительно 120, приблизительно 130, приблизительно 140, приблизительно 150, приблизительно 160, приблизительно 170, приблизительно 180, приблизительно 190, приблизительно 200, приблизительно 210, приблизительно 220, приблизительно 230, приблизительно 240, приблизительно 250, приблизительно 275, приблизительно 300, приблизительно 325, приблизительно 350, приблизительно 375, приблизительно 400, приблизительно 425, приблизительно 450, приблизительно 475, приблизительно 500, приблизительно 525, приблизительно 550, приблизительно 575, приблизительно 600, приблизительно 625, приблизительно 650, приблизительно 675, приблизительно 700, приблизительно 725, приблизительно 750, приблизительно 775, приблизительно 800, приблизительно 825, приблизительно 850, приблизительно 875, приблизительно 900, приблизительно 925, приблизительно 950, приблизительно 975, приблизительно 1000, приблизительно 1100, приблизительно 1200, приблизительно 1300, приблизительно 1400, приблизительно 1500, приблизительно 1750, приблизительно 2000, приблизительно 2250, приблизительно 2500 или более аминокислотных остатков, или любой другой ряд аминокислотных остатков, получаемый из вышеуказанного (например, от приблизительно 200 до приблизительно 2500 аминокислотных остатков).

Используемый в данном описании изобретения термин «аминокислотный остаток» относится к любой встречающейся в природе аминокислоте, любой производной аминокислоты или любому миметику аминокислоты, известным в данной области техники. В определенных вариантах осуществления изобретения аминокислотные остатки белка или пептида последовательны без какого-либо прерывания аминокислотной последовательности не аминокислотами. В других вариантах осуществления последовательность может включать одну или более не аминокислотные группы. В определенных вариантах осуществления последовательность аминокислотных остатков белка или пептида может быть прервана одной или более не аминокислотной группой.

Таким образом, термин «белок или пептид» означает аминокислотную последовательность, включающую, по крайней мере, одну из 20 типичных аминокислот, встречающихся в природе, или, по крайней мере, одну модифицированную или не типичную аминокислоту, включая, помимо прочего, Aad, 2-аминоадипиновую кислоту; EtAsn, N-этиласпарагин; Baad, 3-аминоадипиновую кислоту; Hyl, гидроксилизин; Bala, β-аланин, β-аминопропионовую кислоту; AHyl, алло-гидроксилизин; Abu, 2-аминобутириновую кислоту; 3Hyp, 3-гидроксипролин; 4Abu, 4-аминобутириновую кислоту, пиперидиновую кислоту; 4Hyp, 4-гидроксипролин; Acp, 6-аминокапроиновую кислоту; Ide, изодесмозин; Ahe, 2-аминогептановую кислоту; AIle, алло-изолейцин; Aib, 2-аминоизобутириновую кислоту; MeGly, N-метилглицин, саркозин; Baib, 3-аминоизобутирин