Человеческое опухолеспецифическое моноклональное антитело

Человеческое опухолеспецифическое моноклональное антитело

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение в целом относится к новым опухолеспецифическим связывающим молекулам, в частности к человеческим антителам, а также их фрагментам, производным и вариантам, которые узнают опухолевые антигены и опухоль-ассоциированные антигены соответственно. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим такие связывающие молекулы, антителам и их мимикам для лечения различных опухолей, в частности меланомы, рака молочной железы и метастазов.

Уровень техники

Гуморальные иммунные ответы на опухоли встречаются относительно часто (1, 2). Это явление использовали для идентификации множества опухолеспецифических антигенов (taa) путем скрининга аутологичных экспрессионных библиотек с сывороткой, взятой у больного раком (1). Несколько из таких taa теперь используются в качестве T-клеточных антигенов для индукции у пациентов противоопухолевых CTL-ответов (3, 4). В настоящее время пересматривается такое предпочтительное отношение к клеточному ответу, в большинстве случаев цитотоксическому иммунному ответу, как к некой терапевтической стратегии, и разрабатываются новые вакцины с тем, чтобы индуцировать также и антительные ответы. В частности, такое изменение концепции, вероятно, произошло под влиянием недавних достижений в лечении опухоли различными моноклональными антителами, такими как трастузумаб (Герцептин) и бевацизумаб (Авастин) (5). Несмотря на то, что эти моноклональные антитела были специфически индуцированы против целевых молекул предполагаемого онкологического характера, антитела, вырабатываемые у больных раком либо спонтанно, либо путем вакцинации, относились к другому классу молекул, терапевтическое значение которых с трудом поддавалось оценке. Это происходило главным образом из-за отсутствия эффективных экспериментальных подходов для их выделения и последующей характеристики in vitro и на животных моделях человеческого рака.

Таким образом, существует потребность в преодолении вышеописанных ограничений и предоставлении терапевтического и диагностического антитела к антигенам, имеющим отношение к раку.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение использует опухолеспецифический иммунный ответ больных раком для выделения специфических человеческих моноклональных антител к опухолевым антигенам и опухоль-ассоциированным антигенам (taa). В частности, в экспериментах, выполненных по настоящему изобретению, специфические к taa NY-ESO-1 моноклональные антитела успешно выделены у страдающего меланомой пациента, в титре сыворотки которого были обнаружены NY-ESO-1, и получен частичный клинический ответ. Для выделения человеческого антитела, специфического к опухолевому антигену и taa соответственно, была применена иммуногистохимия (ИГХ) с использованием тканевых микрочипов (ТМЧ).

Таким образом, настоящее изобретение относится к человеческим антителам, антигенсвязывающим фрагментам и аналогичным связывающим антигены молекулам, которые способны узнавать опухоль-ассоциированный антиген NY-ESO-1. Кроме того, настоящее изобретение относится к композициям, включающим указанные антитела, и к иммунотерапевтическим и иммунодиагностическим способам, использующим такие же антитела.

В особо предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения человеческое антитело или его антиген-связывающий фрагмент проявляет иммунологические характеристики связывания антитела, характеризуемого вариабельными участками V_H и/или V_L, как показано на фиг.4 (SEQ ID NO:2 и 4). В качестве альтернативы антитело представляет собой гуманизированное, ксеногенное или химерное человек-мышь антитело, последнее, в частности, является полезным для диагностических способов и исследований, проводимых на животных. Также включены терапевтические композиции, включающие антитело или его активные фрагменты или агонисты и родственные молекулы, или, наоборот, антагонисты того же антитела, и способы использования таких композиций для профилактики, диагностики или лечения опухоли при помощи таких композиций; причем нуждающемуся в таком лечении пациенту вводят эффективное количество этой композиции.

Антигенсвязывающий фрагмент антитела может представлять собой одноцепочечный Fv фрагмент, F(ab') фрагмент, F(ab) фрагмент и F(ab')₂ фрагмент или любой другой антигенсвязывающий фрагмент. В специфическом варианте осуществления (см. ниже) антитело или его фрагмент представляет собой человеческое антитело IgG изотипа.

Естественно, настоящее изобретение охватывает и иммортализованный человеческий В-лимфоцит памяти и B-клетку соответственно, которые продуцируют антитело, имеющее отличительные и уникальные характеристики, как определено ниже.

Настоящее изобретение также относится к полинуклеотидам, кодирующим по меньшей мере вариабельный участок иммуноглобулиновой цепи антитела по изобретению. Предпочтительно указанный вариабельный участок содержит по меньшей мере один определяющий комплементарность участок (CDR) вариабельного участка V_H и/или V_L, как показано на фиг.4 (SEQ ID NO:5-10).

Следовательно, настоящее изобретение также охватывает векторы, содержащие указанные полинуклеотиды и трансформированные ими клетки-хозяева, а также их использование для продуцирования антитела и эквивалентных связывающих молекул, которые являются специфическими к антигенам, характерным для опухоли и/или вызывающим развитие опухоли, в частности меланому или рак молочной железы.

Антитело, его иммуноглобулиновая цепь (цепи), связывающие фрагменты и антиген, связывающийся с указанным антителом, могут использоваться в фармацевтических и диагностических композициях для иммунотерапии и диагностики опухоли соответственно. Однако для приготовления лекарственного средства предпочтительно использовать вышеуказанные композиции.

Следовательно, конкретной задачей настоящего изобретения является предоставление способов лечения или профилактики раковых заболеваний, таких как первичная карцинома молочной железы и метастазы. Способы содержат введение пациенту эффективной концентрации антитела или производного антитела, причем данное антитело нацелено на ткань и клетки опухоли.

Другие варианты осуществления настоящего изобретения будут очевидны из нижеприведенного описания и примеров. Кроме того, описание настоящего изобретения, в случае необходимости или с точки зрения целесообразности, может быть дополнено содержанием раскрытия более ранней заявки на европейский патент EP 07005180.0, поданной в Европейское патентное ведомство 13 марта 2007.

Краткое описание чертежей

Фиг.1: Лунка 12D7 с культурой B-клеток памяти содержит NY-ESO-1-специфические антитела. Среду, кондиционированную культурами B-клеток памяти, исследовали на наличие NY-ESO-1-специфических человеческих антител следующим образом: A) При помощи ELISA отображали рекомбинантный NY-ESO-1 полной длины. B) При помощи иммуногистохимии на NY-ESO-1-положительной карциноме молочной железы (mc) и на NY-ESO-1-отрицательной контрольной ткани (ct). Показано окрашивание двух лунок (9D1, 12D7) с ELISA-положительной культурой B-клеток памяти, полученное с помощью кондиционированной среды. C) NY-ESO-1-специфическое антитело, находящееся в лунке 12D7, представляет собой подкласс IgG1, как показано окрашиванием NY-ESO-1-положительной ткани кондиционированной B-клетками средой из лунки 12D7 с культурой, затем окрашиванием подклассов IgG1-4 вторичными антителами к IgG.

Фиг.2: 4-ый номер клона рекомбинантного человеческого антитела 12D7, полученный методом одноклеточной РТ-ПЦР из культуры B-клеток памяти, специфически узнает NY-ESO-1 в ELISA и на срезах ткани. Супернатантную жидкость (СН), собранную из 293T HEK клеток, трансфицированных векторами экспрессии иммуноглобулиновых легкой и тяжелой цепей, экспрессирующих четвертый номер клона 12D7, исследовали на специфичность к NY-ESO-1: A) ELISA отображает NY-ESO-1 полной длины. Значения ELISA указаны для неразбавленного СН (1:12D7.4 СН), разбавления 1/10 (2:12D7.4 СН) и разбавления 1/100 (3:12D7.4 СН). Для сравнения также показан сигнал ELISA, полученный из плазмы пациента, у которого были выделены культуры В-клеток памяти, использованные в виде разбавления 1/100 (4). В качестве контроля показано отсутствие связывания с покрытыми NY-ESO-1 пластинами ELISA для СН, полученного при трансфекции нерелевантного рекомбинантного антитела, продуцированного таким же способом, что и 12D7.4 (5), а также отсутствие связывания клона 12D7 № 4 с покрытыми нерелевантным антигеном пластинами ELISA. B) Иммуногистохимия на NY-ESO-1-положительной карциноме молочной железы (mc) и на NY-ESO-1-отрицательной контрольной ткани (ct) показывает специфическое связывание рекомбинантного клона 12D7 № 4 с карциномой молочной железы.

Фиг.3: Характеристика человеческого моноклонального антитела Manhattan. Картирование эпитопа выполняли, используя наложение пептидов, охватывающих весь белок NY-ESO-1, нанесенный на пластину ELISA. A) Manhattan специфически связывается с пептидом, покрывающим с 11 по 30 аминокислоты на N-конце белка NY-ESO-1. B) Сыворотка пациента С1 узнает различные пептидные фрагменты на N-конце и в средней области NY-ESO-1. C) В конкурентных ELISA экспериментах с пептидом NY-ESO-1_11-30 определена авидность Manhattan как равная K_D=10^-10. D) Иммунофлуоресцентное окрашивание NY-ESO-1-положительной клеточной линии SK-MEL-37 с помощью humAb Manhattan показывает колокализацию окраски NY-ESO-1 с ядерным маркером Hoechst. Контрольный рекомбинантный ген 8-15c5 человеческого антитела, специфический к MOG, не связывается.

Фиг.4: Аминокислотные и нуклеотидные последовательности вариабельного участка, т.е. тяжелой цепи и легкой каппа цепи антитела 12D7. Определяющие комплементарность участки (CDR) подчеркнуты.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение в целом относится к антителам и его антигенсвязывающим фрагментам, которые проявляют иммунологические характеристики связывания и/или биологические свойства, как в общих чертах показано для продемонстрированного в примерах антитела. В местах упоминания термина "иммунологические характеристики связывания" или других характеристик связывания антитела с антигеном, во всех его грамматических формах, имеется в виду специфичность, аффинность, кросс-реактивность и другие характеристики связывания антитела. Естественно, настоящее изобретение охватывает антитело, продуцирующее клеточные линии, а также рекомбинантные клетки. Настоящее изобретение также относится к диагностическому анализу и наборам, которые содержат связывающую молекулу по настоящему изобретению, и к основанным на этом терапевтическим способам.

Согласно настоящему изобретению человеческое антитело, специфическое к опухоль-ассоциированному антигену NY-ESO-1, клонировали от страдающего меланомой пациента, который имел сероположительную реакцию на NY-ESO-1 в способе ELISA и на аутологичных срезах опухоли, с помощью способов идентификации, проверки на достоверность и продуцирования диагностически и терапевтически полезных опухоль-ассоциированных молекул, по существу как раскрыто в совместно рассматриваемой международной заявке на патент PCT/EP2008/000053 "Method of providing disease-specific binding molecules and targets", поданной 7 января 2008, содержание которой включено в данное описание в виде ссылки. Скрининг антител-кандидатов выполняли на опухолевой ткани при помощи ELISA, используя адаптированный метод тканевых микрочипов. Было показано, что полученное реагирующее с тканью человеческое моноклональное антитело связывается с N-концом NY-ESO-1, который также присутствует в опухоль-ассоциированном антигене LAGE-1; см. пример 3.

Если не утверждается иное, термины "рак" и "опухоль" в настоящем описании являются взаимозаменяемыми.

Только с целью пояснения, но без ограничения объема настоящего изобретения, большинство из нижеприведенных вариантов осуществления описано относительно человеческих антител и антителоподобных молекул, которые представляют собой предпочтительные связывающие молекулы для разработки терапевтических и диагностических агентов по настоящему изобретению. Однако следует понимать, что в контексте настоящего изобретения термин "антитело" и его фрагмент также может относиться к другим, не являющимся антителами, связывающим молекулам, которые связываются с человеческим опухолевым (опухоль-ассоциированным) антигеном NY-ESO-1, включая без ограничений гормоны, рецепторы, лиганды, молекулы главного комплекса гистосовместимости (ГКГС), шапероны, такие как белки теплового шока (HSP), а также молекулы адгезии клетка-клетка, такие как представители кадгерина, интегрина, лектина C-типа и суперсемейства иммуноглобулинов (Ig).

NY-ESO-1 первоначально был идентифицирован у пациента, страдающего раком пищевода, с помощью технологии, основанной на клонировании антител (SEREX, см. ниже). Недавно было показано, что NY-ESO-1 может представлять собой наиболее иммуногенный СТ антиген, поскольку спонтанные клеточный и гуморальный иммунные ответы можно наблюдать у высокого процента пациентов с опухолями, экспрессирующими NY-ESO-1, (Gnjatic et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100 (2003), 8862-8867; Jager and Knuth, Breast 14 (2005), 631-635).

Поскольку CT антигены экспрессируются селективно в опухолевых клетках и в сперматогонии яичка человека, они являются перспективной группой целевых антигенов для иммуннотерапевтического метода лечения больных раком. Среди них NY-ESO-1, по-видимому, является очень иммуногенным, и известно, что он индуцирует эффективные гуморальный и клеточный иммунные ответы у пациентов с меланомой и раком яичника, молочной железы, легкого, а также раком мочевого пузыря, что делает его идеальной мишенью для активной иммунотерапии рака. Информацию относительно нуклеотидной и аминокислотной последовательностей, а также их природы, первичных источников и т.д., опухолевых антигенов и опухоль-ассоциированных антигенов можно найти в соответствующих базах данных, таких как UniProtKB/Swiss-Prot, представленных EMBL, в которой NY-ESO-1 может быть найден под первичным инвентарным номером P78358.

В конкретном предпочтительном варианте осуществления антитело по настоящему изобретению связывается с эпитопом, определенным аминокислотной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:11, представляющей собой аминокислотные остатки 11-30 белка NY-ESO-1.

Средства и способы рекомбинантного продуцирования антител и их мимиков, а также способы скрининга для сравнения связывающих молекул, которые могут быть или могут не быть антителами, известны в данной области техники; см. также Примеры. Однако, как раскрыто в настоящем описании, в частности относительно терапевтических применений к человеку, антитело по настоящему изобретению представляет собой человеческое антитело в том смысле, что применение указанного антитела по существу не дает реакции на человеческое анти-мышиное антитело (HAMA), наблюдаемой в ином случае для химерных и даже гуманизированных антител.

Кроме того, как показано в нижеприведенном примере 3, было идентифицировано и клонировано антитело, которое, в частности, продемонстрировало высокую аффинность связывания при взаимодействии с его родственным антигеном с константой равновесия диссоциации (K_D), находящейся ниже наномолярного диапазона. Предпочтительно аффинность связывания связывающей молекулы по настоящему изобретению с его родственным антигеном составляет по меньшей мере 10^-7 M, более предпочтительно по меньшей мере 10^-8 M, особенно предпочтительно 10^-9 M и наиболее предпочтительно по меньшей мере 10^-10 M.

В настоящем изобретении в качестве примера описано человеческое анти-NY-ESO-1 антитело и его связывающие фрагменты, которые могут быть охарактеризованы содержанием в их вариабельном участке, т.е. связывающем домене, по меньшей мере одного определяющего комплементарность участка (CDR) вариабельного участка V_H и/или V_L, содержащего аминокислотную последовательность, приведенную на фиг.4 (V_H) (SEQ ID NO:2) и (V_L) (SEQ ID NO:4). Приведенный в качестве примера набор CDR вышеупомянутых аминокислотных последовательностей участка V_H и/или V_L, как изображено на фиг.4, дано в SEQ ID NO:5-10. Однако, как обсуждается ниже, специалист в данной области техники хорошо знает, что в качестве дополнения или альтернативы можно использовать CDR, аминокислотные последовательности которых отличаются от приведенных в SEQ ID NO:5-10 одной, двумя, тремя или даже большим количеством аминокислот в случае CDR2 и CDR3.

В одном из вариантов осуществления антитело по настоящему изобретению представляет собой любое одно из антител, содержащих аминокислотную последовательность участка V_H и/или V_L, как изображено на фиг.4. В качестве альтернативы антитело по настоящему изобретению представляет собой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который конкурирует за связывание с антигеном NY-ESO-1 с по меньшей мере одним из антител, имеющих участок V_H и/или V_L, как изображено на фиг.4. Такие антитела могут быть мышиными, а также, однако, гуманизированными, ксеногенными или предпочтительно химерными человек-мышь антителами, в частности для применения в терапии. Антигенсвязывающий фрагмент антитела может представлять собой, например, одноцепочечный Fv фрагмент (scFv), F(ab') фрагмент, F(ab) фрагмент или F(ab')₂ фрагмент.

Таким образом, для некоторых применений необходимы только вариабельные участки антител, которые могут быть получены обработкой антитела подходящими реагентами для получения Fab', Fab или F(ab")₂ частей. Такие фрагменты достаточны для использования, например, в иммуннодиагностических процедурах, включающих связывание иммунноспецифических частей иммуноглобулинов с детектирующими реагентами, такими как радиоизотопы.

В качестве альтернативы, для получения иммуноглобулинов непосредственно из культуры иммортализованных B-клеток или B-клеток памяти, иммортализованные клетки можно использовать в качестве источника реорганизации локусов тяжелой цепи и легкой цепи для последующей экспрессии и/или генетической манипуляции. Гены реорганизованного антитела можно подвергнуть обратной транскрипции от соответствующих мРНК, для того чтобы получить кДНК. При необходимости константный участок тяжелой цепи может быть заменен участком другого изотипа или полностью удален. Для кодирования одноцепочечных участков Fv вариабельные участки могут быть соединены. Для обеспечения способности связываться с более чем одной мишенью может быть соединено множество участков Fv или могут быть использованы химерные комбинации тяжелой и легкой цепей. После получения генетического материала несложно разработать аналоги, как описано выше, которые сохраняют обе способности связываться с желаемой мишенью. Способы клонирования вариабельных участков антитела и создания рекомбинантных антител известны специалисту в данной области техники и описаны, например, у Gilliland et al., Tissue Antigenes 47 (1996), 1-20; Doenecke et al., Leukemia 11 (1997), 1787-1792.

После получения соответствующего генетического материала и при необходимости модификации для кодирования аналога, кодирующие последовательности, включая те, которые кодируют как минимум вариабельные участки тяжелой и легкой цепей, могут быть вставлены в системы экспрессии, включенные в векторы, которые могут быть трансфицированы в стандартные рекомбинантные клетки-хозяева. Можно использовать множество таких клеток-хозяев; однако, для эффективной обработки предпочтительны клетки млекопитающих. Для этой цели можно использовать обычные клеточные линии млекопитающих, включая клетки CHO, клетки HEK 293 или клетки NSO. Затем проводят продуцирование антитела или аналога путем культивирования измененного рекомбинантного хозяина в условиях культивирования, соответствующих росту клеток-хозяев и экспрессии кодирующих последовательностей. Затем антитела извлекают, выделяя их из культуры. Системы экспрессии предпочтительно разрабатывают таким образом, чтобы были включены сигнальные пептиды, для того чтобы полученные антитела секретировались в среду; однако также возможно внутриклеточное продуцирование.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к антигену NY-ESO-1, который распознается описанным выше антителом по настоящему изобретению, как в виде пептида, так и в посттрансляционном модифицированном виде; причем антиген предпочтительно является пептидом, состоящим из по меньшей мере 6-50 и предпочтительно не более чем 10-100 аминокислот в длину, который содержит родственный эпитоп. Наиболее предпочтительно, антиген по настоящему изобретению содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO:11 и состоит примерно из 10-30 аминокислот и предпочтительно не более чем примерно 20 аминокислот в длину. Молекула является достаточно большой, чтобы быть аллергенной без какой-либо посттрансляционной модификации, и, следовательно, она полезна как иммуноген в комбинации с адъювантом (или без него) как в виде предшественника, так и в посттрансляционном модифицированном виде. Эти антигены и пептиды можно использовать для определения того, имеются или нет антитела в образце, таком как сыворотка или кровь. Предпочтительно антиген по настоящему изобретению способен вызвать у человека гуморальный ответ.

Согласно вышесказанному, настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему антиген или связывающую молекулу по настоящему изобретению, в случае антитела, предпочтительно по меньшей мере к вариабельному участку иммуноглобулиновой цепи описанного выше антитела. Как правило, указанный кодируемый полинуклеотидом вариабельный участок содержит по меньшей мере один определяющий комплементарность участок (CDR) вариабельного участка V_H и/или V_L упомянутого антитела. Специалист в данной области техники знает, что каждый вариабельный домен (тяжелой цепи V_H и легкой цепи V_L) антитела содержит три гипервариабельных участка, иногда называемых определяющими комплементарность участками или "CDR", фланкированными четырьмя относительно консервативными каркасными участками или "FR", и относящихся к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельные участки или CDR IgG подтипа человеческих антител содержат следующие аминокислотные остатки: 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) остатки вариабельного домена легкой цепи и 31-35 (Н1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) остатки вариабельного домена тяжелой цепи, как описано у Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991), и/или аминокислотные остатки гипервариабельной петли, т.е. 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) остатки вариабельного участка легкой цепи и 26-32 (Н1), 53-55 (H2) и 96-101 (H3) остатки вариабельного участка тяжелой цепи, как описано у Chothia et al., J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917. Каркас или FR остатки представляют собой аминокислотные остатки вариабельного участка, которые отличаются от разделяющих их гипервариабельных участков. Термин "специфическое связывание" относится к связыванию антитела с заданным антигеном. Как правило, антитело связывается с константой диссоциации (K_D), равной 10^-7 или меньше, и связывается с заданным антигеном с K_D, значение которой по меньшей мере в два раза ниже значения его K_D связывания с неспецифическим антигеном (например, BSA, казеином или любым другим определенным полипептидом), отличающимся от заданного антигена. Фразы "антитело, которое узнает антиген" и "антитело, специфическое к антигену", в настоящем описании используются наряду с термином "антитело, которое специфически связывается с антигеном". "Высокоспецифическое" связывание в настоящем описании означает, что относительная K_D антитела для специфического целевого эпитопа, т.е. taa NY-ESO-1, по меньшей мере в 10 раз ниже K_D связывания этого антитела с другими лигандами. Предпочтительно антитело связывается со своим родственным антигеном NY-ESO-1 с константой диссоциации (K_D), равной 10^-9 M или меньше.

Аффинность или авидность антитела к антигену может быть определена экспериментально с помощью любого из подходящих способов, см., например, Berzofsky et al., "Antibody-Antigen Interactions" In Fundamental Immunology, Paul, W. E., Ed., Raven Press New York, NY (1984), Kuby, Janis Immunology, W.H. Freeman and Company New York, NY (1992), и способов, описанных в настоящем описании. Измеренная аффинность конкретного антитело-антиген взаимодействия может меняться при измерении в различных условиях, например, концентрации соли, pH. Таким образом, измерение аффинности и других антигенсвязывающих параметров, например, K_D, IC₅₀, предпочтительно проводят в стандартизованных растворах антитела и антигена и стандартизованном буфере.

Для специалиста в данной области техники очевидно, что вариабельный домен антитела с вышеописанным вариабельным участком можно использовать для создания других полипептидов или антител с нужной специфичностью и биологической функцией. Таким образом, настоящее изобретение также охватывает полипептиды и антитела, содержащие по меньшей мере один CDR вышеописанного вариабельного домена, который преимущественно имеет по существу такие же или аналогичные связывающие свойства, что и описанное в прилагаемых примерах антитело. Для специалиста в данной области техники очевидно, что раскрытые в настоящем описании антитела могут быть сконструированы с помощью вариабельных доменов или CDR согласно известным в данной области способам, например, как описано в европейских заявках на патент EP 0451216 А1 и EP 0549581 А1. Более того, специалисту в данной области техники известно, что аффинность связывания может быть увеличена с помощью аминокислотных замен внутри CDR или гипервариабельных петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917), которые частично перекрываются с CDR, как определено у Kabat. Таким образом, настоящее изобретение также относится к антителам, у которых один или несколько упомянутых CDR имеют одну или несколько, предпочтительно не более двух, аминокислотных замен. Предпочтительно антитело по изобретению содержит в одной или обеих иммуноглобулиновых цепях два или все три CDR вариабельных участка, как приведено в SEQ ID NO:5-10.

Полинуклеотид по изобретению, кодирующий вышеуказанное антитело, может представлять собой, например, ДНК, кДНК, РНК или искусственно продуцированную ДНК или РНК, или рекомбинантно продуцированную химерную молекулу нуклеиновой кислоты, содержащую любой из таких полинуклеотидов, либо отдельно, либо в комбинации. Предпочтительно указанный полинуклеотид представляет собой часть вектора. Такие векторы могут содержать дополнительные гены, такие как маркерные гены, которые позволяют выбрать указанный вектор в подходящей клетке-хозяине и в подходящих условиях.

Предпочтительно полинуклеотид по изобретению необязательно соединен с управляющими экспрессией последовательностями, обеспечивающими экспрессию в прокариотических или эукариотических клетках. Экспрессия указанного полинуклеотида включает транскрипцию полинуклеотида в транслируемой мРНК. Регуляторные элементы, гарантирующие экспрессию в эукариотических клетках, предпочтительно клетках млекопитающих, известны специалистам в данной области техники. Они обычно включают регуляторные последовательности, гарантирующие инициацию транскрипции, и необязательно поли-A сигналы, гарантирующие терминацию транскрипции и стабилизацию транскрипта. Дополнительные регуляторные элементы могут включать транскрипционные, а также трансляционные энхансеры и/или естественно ассоциированные или гетерологичные участки промотора.

В связи с этим, для специалиста в данной области техники очевидно, что полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере вариабельный домен легкой и/или тяжелой цепи, могут кодировать вариабельные домены обеих или только одной иммуноглобулиновой цепи. Аналогично, для осуществления экспрессии указанные полинуклеотиды могут находиться под контролем одного и того же промотора или могут управляться отдельно. Возможные регуляторные элементы, обеспечивающие экспрессию в прокариотических клетках-хозяевах, содержат, например, P_L, lac, trp или tac промотор для E. coli, а примерами регуляторных элементов, обеспечивающих экспрессию в эукариотических клетках-хозяевах, являются AOX1 или GAL1 промотор для дрожжей или CMV-, SV40-, RSV-промотор, CMV-энхансер, SV40-энхансер или глобиновый интрон для клеток млекопитающих и других животных.

Помимо элементов, которые ответственны за инициацию транскрипции, такие регуляторные элементы также могут содержать сигналы терминации транскрипции, такие как SV40-поли-A участок или tk-поли-A участок, по ходу транскрипции полинуклеотида. Кроме того, в зависимости от используемой экспрессионной системы к кодирующей последовательности полинуклеотида по изобретению могут быть добавлены лидерные последовательности, которые способны направлять полипептид к клеточному компартменту или его секрецию в среде и хорошо известны в данной области техники. Лидерная последовательность (последовательности) собирается в соответствующую фазу с помощью последовательностей трансляции, инициации и терминации, и предпочтительно лидерная последовательность способна направлять секрецию транслируемого белка или его части в периплазматическое пространство или внеклеточную среду. Гетерологичная последовательность необязательно может кодировать слитый белок, содержащий C- или N-терминальный сигнальный пептид, обеспечивающий желательные характеристики, например, стабилизацию или упрощенную очистку экспрессированного рекомбинантного продукта. В этом контексте в данной области техники известны подходящие векторы экспрессии, например вектор экспрессии кДНК Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen) или pSPORT1 (GIBCO BRL).

Предпочтительно управляющие экспрессией последовательности могут представлять собой эукариотические промоторные системы в векторах, способных к трансформации или трансфекции эукариотической клетки-хозяина, но также могут использоваться управляющие последовательности для прокариотических хозяев. После введения вектора в соответствующего хозяина хозяин содержится в условиях, подходящих для обеспечения высокого уровня экспрессии нуклеотидных последовательностей, и при желании затем возможны сбор и очистка иммуноглобулиновых легких цепей, тяжелых цепей, димеров легкая/тяжелая цепь или интактных антител, связывающих фрагментов или других форм иммуноглобулина; см. Beychok, Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979).

Кроме того, настоящее изобретение относится к обычно используемым в генной инженерии векторам, в частности плазмидам, космидам, вирусам и бактериофагам, которые содержат полинуклеотид, кодирующий антиген или предпочтительно вариабельный домен иммуноглобулиновой цепи антитела по изобретению; необязательно в комбинации с полинуклеотидом по изобретению, который кодирует вариабельный домен другой иммуноглобулиновой цепи антитела по изобретению. Предпочтительно указанный вектор представляет собой вектор экспрессии и/или вектор для переноса генов или целевой вектор. Для доставки полинуклеотидов или вектора по изобретению в целевую клеточную популяцию можно использовать векторы экспрессии, полученные из вирусов, таких как ретровирусы, вирус осповакцины, аденоассоциированный вирус, вирусы герпеса или вирус бычьей папилломы. Для создания рекомбинантных вирусных векторов можно использовать способы, известные специалистам в данной области техники; см., например, методы, описанные у Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N.Y. и у Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994). В качестве альтернативы полинуклеотиды и векторы по изобретению могут быть реконструированы в липосомы для доставки в целевые клетки. Векторы, содержащие полинуклеотиды по изобретению (например, последовательности, кодирующие тяжелый и/или легкий вариабельный домен (домены) иммуноглобулиновых цепей, и управляющие экспрессией последовательности), могут быть трансфицированы в клетку-хозяина известными способами, которые меняются в зависимости от типа клеточного хозяина. Например, для прокариотических клеток обычно используется трансфекция с использованием хлорида кальция, тогда как для других клеточных хозяев можно использовать обработку фосфатом кальция или электропорацию; см. Sambrook, выше.

Кроме того, настоящее изобретение относится к клеткам-хозяевам, трансформированным полинуклеотидом или вектором по изобретению. Указанная клетка-хозяин может быть прокариотической или эукариотической клеткой. Полинуклеотид или вектор по изобретению, находящийся в клетке-хозяине, либо может быть интегрирован в геном клетки-хозяина, либо может поддерживаться экстрахромосомно. Клетка-хозяин может быть любой прокариотической или эукариотической клеткой, такой как бактериальная клетка, клетка насекомого, грибка, растения, животного или человека. Предпочтительные грибковые клетки представляют собой, например, клетки из рода Saccharomyces, в частности клетки вида S. cerevisiae. Термин "прокариотический" означает, что включены все бактерии, которые могут быть трансформированы или трансфицированы с помощью молекул ДНК или РНК для экспрессии антитела по изобретению или соответствующих иммуноглобулиновых цепей. Прокариотические хозяева могут включать грамотрицательные, а также грамположительные бактерии, такие как, например, E.coli, S.typhimurium, Serratia marcescens и Bacillus subtilis. Термин "эукариотический" означает, что включены клетки дрожжей, высших растений, насекомых и, предпочтительно, млекопитающих, наиболее предпочтительно клетки HEK 293, NSO и CHO. В зависимости от хозяина, используемого в процедуре рекомбинантного продуцирования, антитела или иммуноглобулиновые цепи, кодируемые полинуклеотидом по настоящему изобретению, могут быть гликозилированными или могут быть негликозилированными. Антитела по изобретению или соответствующие иммуноглобулиновые цепи также могут включать исходный аминокислотный остаток метионина. Полинуклеотид по изобретению можно использовать для трансформации или трансфекции хозяина с помощью любого способа, хорошо известного специалистам в данной области техники. Кроме того, способы получения слитых, необязательно соединенных генов и их экспрессии, например, в клетках млекопитающих и бактерий, известны в данной области техники (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Описанные там генетические конструкции и способы можно использовать для экспрессии антитела по изобретению или соответствующих иммуноглобулиновых цепей в эукариотических или прокариотических хозяевах. В общем случае в отношении хозяина используются векторы экспрессии, содержащие промоторные последовательности, которые облегчают эффективную транскрипцию введенного полинуклеотида. Вектор экспрессии обычно содержит точку начала репликации, промотор и терминатор, а также специфические гены, которые способны обеспечить фенотипическую селекцию трансформированных клеток. Подходящие исходные клетки для последовательностей ДНК и клетки-хозяева для экспрессии и секреции иммуноглобулина можно получить из многих источников, таких как американская коллекция типов культур (American Type Culture Collection) ("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas", Fifth edition (1985) Rockville, Maryland, USA, включенный в настоящее описание в виде ссылки). Кроме того, для крупномасштабного продуцирования антитела по изобретению можно использовать трансгенных животных, предпочтительно млекопитающих, содержащих клетки по изобретению.

Таким образом, в другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу продуцирования антигена по настоящему изобретению, или антитела или его связывающего фрагмента или иммуноглобулиновой цепи (цепей), где указанный способ включает:

(а) культивирование клетки, как описано выше; и

(b) выделение из культуры указанного антигена, антитела или его связывающего фрагмента или иммуноглобулиновой цепи (цепей).

Трансформированные хозяева могут быть выращены в ферментаторах и культивированы согласно известным в данной области способам для достижения оптимального клеточного роста. После экспрессии целые антитела, их димеры, отдельно легкие и тяжелые цепи или другие формы иммуноглобулина по настоящему изобретению могут быть очищены согласно стандартным процедурам, описанным в данной области техники, включая осаждение сульфатом аммония, аффинную хроматографию, колоночную хроматографию, гель-электро