Экспрессионный плазмидный вектор для гетерологичной экспрессии рекомбинантных белков, высокочастотной интеграции и усиленной амплификации экспрессионной кассеты в клетках млекопитающих, бицистронная мрнк, способ получения стабильных линий продуцентов рекомбинантных белков с использованием указанного вектора, способ получения рекомбинантных белков

Экспрессионный плазмидный вектор для гетерологичной экспрессии рекомбинантных белков, высокочастотной интеграции и усиленной амплификации экспрессионной кассеты в клетках млекопитающих, бицистронная мрнк, способ получения стабильных линий продуцентов рекомбинантных белков с использованием указанного вектора, способ получения рекомбинантных белков

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к технологии получения биологически активных веществ (БАВ) методами генной инженерии, точнее к методам получения рекомбинантных белков в культивируемых клетках млекопитающих.

Предшествующий уровень техники

Получение рекомбинантных белков в культивируемых клетках млекопитающих позволяет производить не менее половины лекарственных средств биологического происхождения, существенную часть вакцин, а также многие препараты для ветеринарии и реагенты для клинической диагностики. Среди линий клеток млекопитающих, используемых в биофармацевтическом производстве, наиболее распространена линия клеток яичника китайского хомячка (Cricetulus griseus) CHO (Chinese hamster ovary cells) и ее производные. Некоторые сублинии CHO отличаются инактивацией гена дигидрофолатредуктазы (DHFR) и позволяют, путем добавления ингибиторов DHFR, относительно легко проводить амплификацию введенных в геном клетки генетических конструкций, содержащих миниген DHFR. В частности, путем мутагенеза химическими агентами из базовой линии СНО-K1 была получена сублиния CHO-DG44, не содержащая активных аллелей DHFR (Urlaub G, Chasin LA. Isolation of Chinese hamster cell mutants deficient in dihydrofolate reductase activity. Proc Natl Acad Sci USA. 1980 Jul;77(7):4216-4220) и пригодная для получения стабильных линий-продуцентов рекомбинантных белков (Derouazi M et al, Genetic characterization of CHO production host DG44 and derivative recombinant cell lines. Biochem Biophys Res Commun. 2006 Feb 24;340(4):1069-1077).

Основным фактором, влияющим на продуктивность создаваемой промышленной линии-продуцента, является уровень мРНК целевого гена, определяемый, в свою очередь, силой промотора целевого гена, контекстом точки (или точек) интеграции целевого гена в хромосомы и числом копий целевого гена на клетку.

Стабильность линии-продуцента при последовательных пересевах определяется устойчивостью промотора целевого гена к инактивации метилированием остатков цитидина (Brooks AR e al Transcriptional silencing is associated with extensive methylation of the CMV promoter following adenoviral gene delivery to muscle. J Gene Med. 2004 Apr; 6(4):395-404), общей устойчивостью целевого гена и генетической кассеты к модификации ДНК (делециям, инсерциям и точечным мутациям) и интенсивности процессов хромосомной транслокации в областях интеграции копий целевого гена (Kim M et al, A mechanistic understanding of production instability in CHO cell lines expressing recombinant monoclonal antibodies. Biotechnol Bioeng. 2011 May 2. doi: 10.1002/bit.23189. Epub ahead of print). При этом устойчивость промотора к инактивации метилированием определяется его последовательностью (промоторы клеток устойчивее промоторов вирусов), устойчивость к модификации целевого гена и кассеты в целом определяется ее длиной (чем короче ген и чем ближе селекционный маркер к целевому гену, тем менее вероятна его модификация), а вероятность делеции целевого гена при хромосомных транслокациях определяется положениями точек интеграции и может быть проверена только экспериментально. Поскольку процессы метилирования ДНК, возникновения мутаций и транслокации участков хромосом идут в культивируемых клетках непрерывно и практически не поддаются внешнему контролю, "среднюю" стабильность линий-продуцентов можно увеличивать уменьшением числа генераций от момента трансфекции клеток генетической конструкцией до получения маточного клеточного банка.

Таким образом, при создании промышленной линии-продуцента рекомбинантного белка должны быть одновременно решены 2 различные технические задачи - максимизация уровня мРНК целевого гена и ограничение числа последовательных пересевов трансфицированной культуры до определения конечного клона-продуцента и его масштабирования.

Для максимизации уровня мРНК целевого гена в современной практике используют 3 общих подхода:

1) использование как можно более сильных промоторов и регуляторных участков ДНК, способствующих эухроматинизации области интеграции;

2) проведение селективной или направленной интеграции генетических конструкций в транскрипционно активные области генома;

3) амплификацию в геноме интегрированных генетических конструкций.

Применение первого и, в особенности, второго подхода позволяет минимизировать продолжительность пассирования культуры до момента получения конечного клона-продуцента. В то же время, использование третьего подхода позволяет увеличивать уровень мРНК целевого гена практически неограниченно, но требует увеличения времени культивирования.

Техническое решение, позволяющее использовать преимущества всех трех вышеуказанных подходов, должно представлять большой практический интерес. Такое техническое решение может быть основано на применении плазмидной ДНК, обладающей следующими основными свойствами:

1) сильный промотор целевого гена, минимально чувствительный к инактивации метилированием;

2) наличие регуляторных участков ДНК, препятствующих гетерохроматинизации целевой ДНК;

3) повышенная частота интеграции генетической конструкции в геном клеток;

4) наличие селекционного маркера, позволяющего вести первичный отбор стабильно трансфицированных клеток при различном уровне селекционного давления;

5) возможность осуществления амплификации целевых генов после получения первичной популяции стабильно трансфицированных клеток. Известно техническое решение, позволяющее вести экспрессию целевых генов в клетках СНО под контролем сильного промотора клетки-хозяина, при этом данный промотор находится в контексте собственных регуляторных последовательностей, расположенных в 5' и 3'-нетранскрибируемых областях его исходного гена - фактора элонгации трансляции 1 альфа (CHEF1) (Running Deer J, Allison DS. High-level expression of proteins in mammalian cells using transcription regulatory sequences from the Chinese hamster EF-1 alpha gene. Biotechnol Prog. 2004 May-Jun; 20(3):880-889). Использование данного промотора позволило увеличить уровень секреции нескольких модельных белков в 6-35 раз по сравнению с аналогичными конструкциями на основе известных промоторов CMV и EF1 человека, при этом полученные линии сохраняли продуктивность при культивировании в течение нескольких месяцев. Особенностью данного технического решения является расположение селекционного маркера - минигена DHFR мыши перед 3'-нетранскрибируемой областью (НТО) гена CHEF1, но после сигнала полиаденилирования и под контролем отдельного вирусного промотора SV40 и терминатора транскрипции SV40.

Следствием такого расположения функциональных участков является невысокая генетическая сцепленность целевого гена и гена селекционного маркера, существенно ограничивающая возможность амплификации целевого гена. Предположительно, при проведении амплификации построенных по данной схеме экспрессионных кассет под действием возрастающих концентраций ингибитора DHFR метотрексата (МТХ) будет возможна инактивация или делеция целевого гена и последующая амплификация в геноме клетки хозяина только области селекционного маркера, включающей его вирусный промотор, миниген DHFR и терминатор транскрипции. Опубликованные данные о стабильности генетических кассет на основе CHEF1 и DHFR при амплификации под действием МТХ отсутствуют.

Известны способы увеличения сцепленности амплифицируемого гена целевого белка и селекционного маркера - использование полученного в процессе трансляции гибридного белка, разделяющегося на целевой белок и белковый продукт селекционного маркера или бицистронной мРНК. Первый способ может быть реализован путем соединения полипептидных последовательностей целевого белка и продукта селекционного маркера пептидом 2А (Doronina VA et al. Site-specific release of nascent chains from ribosomes at a sense codon. Mol Cell Biol. 2008 Jul; 28(13):4227-4239). Такой способ имеет неустранимый недостаток - появление небольших количеств гибридного белка и целевого белка с неотделенным коротким пептидом р2В и не может быть использован для получения биофармацевтических белков. Второй способ может быть реализован путем соединения кодирующих областей целевого гена и гена DHFR внутренним сайтом связывания рибосом (internal ribosome entry site, IRES); он описан в работе (Lucas BK, Giere LM, Demarco RA, Shen A, Chisholm V, Crowley CW: High level production of recombinant proteins in CHO cells using a dicistronic DHFR intron expression vector. Nucleic Acids Res 1996, 24:1774-1779). Происхождение и эффективность работы IRES не имеют существенного значения для проведения амплификации, при конструировании данного функционального участка экспрессионного вектора может быть использован, например, IRES вируса энцефаломиокардита (Parks, G.D., G.M. Duke, and A.C. Palmenberg. Encephalomyocarditis 3C protease: efficient cell-free expression from clones which link viral 5' non-coding sequences to the P3 region. J. Virol. 1986, 60:376-384).

Практическая применимость экспрессионных векторов большой длины при получении эукариотических продуцентов ограничена низкой эффективностью их трансфекции в животные клетки (Kreiss P et al, Plasmid DNA size does not affect the physicochemical properties of lipoplexes but modulates gene transfer efficiency. Nucleic Acids Res. 1999 Oct 1;27(19):3792-3798) и низкой вероятностью успешной интеграции экспресионной кассеты в геном клетки. Поскольку небольшая часть нетрансфицированных клеток спонтанно приобретает устойчивость к действию селекционного агента и продолжает делиться в его присутствии, вероятность обнаружения клонов-продуцентов после первичного отбора становится незначительной при низком уровне интеграции экспрессионной кассеты.

Одним из способов увеличения вероятности интеграции является включение в экспрессионный вектор сигнальных участков ДНК вирусов, отвечающих за интеграцию провируса в геном клетки-хозяина. Известно техническое решение, в котором в последовательность экспрессионного вектора, содержащего промотор CMV и миниген DHFR, был вставлен фрагмент мультимеризованного концевого повтора вируса Эппштейн-Барра (US6180108 В1). Для полученного вектора, содержащего вставки, кодирующие фармацевтически значимые белки различного размера, было продемонстрировано увеличение вероятности получения стабильных трансфектантов, то есть увеличение числа колоний, растущих в селективной среде, в 3-10 раз. Фрагмент мультимеризованного концевого повтора вируса Эппштей-Барра (EBV-TR) не вызывал значимого изменения уровня продукции целевых белков. Для некоторых полученных стабильных трансфектантов была продемонстрирована возможность проведения амплификации целевого гена под действием возрастающих концентраций МТХ, однако влияние EBV-TR на ход амплификации и его общая эффективность не изучались. Фактически использованный в процитированной работе фрагмент EBV-TR содержал соединенные между собой половины единиц концевого повтора из состава конкатемера.

Подробное описание настоящего изобретения

Технической задачей, решаемой авторами, являлось создание вектора для получения высокопродуктивных и стабильных систем экспрессии рекомбинантных белков в клетках млекопитающих, в частности в клетках СНО, а также создание способа получения высокопродуктивных и стабильных при последовательном пассировании линий клеток млекопитающих, трансфицированных указанным вектором.

Технический результат достигался путем конструирования новой экспрессионной плазмидной ДНК p1.1, содержащей регуляторные элементы для гетерологичной экспрессии рекомбинантных белков, высокочастотной интеграции и ускоренной амплификации экспрессионной кассеты в клетках млекопитающих, а также выявления методов трансфекции, первичной селекции продуцентов и амплификации целевого гена, позволяющих получать линии-продуценты с высоким уровнем продукции целевого белка и достаточной стабильностью.

В основе технического решения лежит разработанный авторами плазмидный ДНК вектор, содержащий функциональные промотор и терминатор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, обеспечивающие конститутивную экспрессию целевого гена в клетках СНО, фланкированные 5' и 3' НТО этого гена, обеспечивающими эухроматинизацию сайтов интеграции экспрессионной кассеты в геном СНО; участок для клонирования открытых рамок считывания целевых белков; внутренний сайт связывания рибосом вируса энцефаломиокардита (EMCV IRES), обеспечивающий реинициацию трансляции на бицистронной мРНК в клетках млекопитающих и полное генетическое сцепление уровней продукции целевого белка и DHFR; ОРС DHFR мыши, экспрессирующуюся в составе бицистронной мРНК вместе с целевым геном (IRES DHFR) и обеспечивающую устойчивость стабильно трансфицированных клеток к отсутствию в среде тимидина и дозозависимую устойчивость к воздействию метотрексата, что позволяет вести направленную селекцию высокопродуктивных клонов с множественными копиями экспрессионной кассеты в геноме СНО; участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR), обеспечивающий повышенный уровень интеграции кассет в геном клеток СНО и ускорение процесса амплификации амплификации целевого гена в геноме под действием МТХ.

Термин «экспрессионный вектор» означает плазмидную ДНК, содержащую все необходимые генетические элементы для экспрессии внедренного в нее целевого гена, например, промотор и терминатор, и элементы для амплификации экспрессионной кассеты и отбора клонов с множественными копиями экспрессионной кассеты в геноме.

Конкретным примером генетических элементов для экспрессии согласно настоящему изобретению являются промотор и терминатор фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, но не ограничиваются ими.

Примером последовательности промотора гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированного 5' НТО этого гена, является последовательность, соответствующая нуклеотидам с 2377 по 6443 в последовательности SEQ ID NO:1.

Примером последовательности терминатора гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированного 3' НТО этого гена, является последовательность, соответствующая нуклеотидам с 7652 по 11909 в последовательности SEQ ID NO:1.

Нетранслируемая область (НТО, UTR - untranslated region) согласно настоящему изобретению представляет собой участок ДНК, не кодирующий открытых рамок считывания (ОРС), который при этом может содержать функциональные регуляторные элементы. Размер указанной нетранслируемой области варьируется в широких пределах и составляет 150 до 10000 нуклеотидов, предпочтительно 4000-5000 нуклеотидов, необходимых для обеспечения инициации и терминации транскрипции, процессинга транскрибируемой РНК, а также для эухроматинизации сайтов интеграции экспрессионной кассеты в геном СНО.

Последовательность участка для клонирования открытых рамок считывания целевых белков (полилинкер) может представлять представляют собой, например, последовательность, соответствующие нуклеотидам с 6444 по 6486 в последовательности SEQ ID NO:1. Указанный полилинкер содержит уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции: AscI (20), PvuI (1413), FseI (5213), AbsI (6446), NheI (6467), HpaI (6484), AgeI (8861), SbfI (11764).

Последовательность внутреннего сайта связывания рибосом вируса энцефаломиокардита (EMCV IRES), представляет собой, например, последовательность, соответствующую нуклеотидам с 6487 по 7074 в последовательности SEQ ID NO:1.

Последовательность OPC DHFR мыши представляет собой, например, последовательность, соответствующую нуклеотидам с 7087 по 7650 в последовательности SEQ ID NO:1.

Фрагментом ДНК, кодирующим элемент для амплификации экспрессионной кассеты согласно настоящему изобретению, может являться, например, фрагмента конкатемера терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR). Указанный фрагмент ДНК может быть получен методом ПЦР (см. Пример 1, Фиг.1). Также указанный фрагмент ДНК может быть получен с использованием технологии клонирования фирмы Sloning BioTechnology, описанной в заявке РСТ WO 2005071077.

Последовательность участка фрагмента конкатемера терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR) представляет собой, например, последовательность, соответствующую нуклеотидам с 1964 по 2365 в последовательности SEQ ID NO:1.

Конкретным воплощением вектора согласно настоящему изобретению является плазмида p1.1 длиной 11909 п.о., представленная в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1. Структура плазмиды pl.l приведена на Фиг.3.

Указанная плазмида размером 11909 п.о. состоит из:

1) 1-1964 участка, включающего

а. 154-827 (674 по) область начала репликации плазмиды pUC,

b. 969-1829 (861 по) открытую рамку считывания бета-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампициллину;

2) 1964-2365 (402 по) участка фрагмента конкатемера терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR);

3) 2377-6443 (4067 по) участка, содержащего функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 5' НТО этого гена (5'CHEF-1 UTR);

4) 6444-6486 (43 по) участка для клонирования вставок целевых ОРС (полилинкер);

5) 6487-7074 (588 по) участка, содержащего внутренний сайт связывания рибосом вируса энцефаломиокардита (EMCV IRES);

6) 7087-7650 (564 по) участка, содержащего открытую рамку считывания дегидрофолатредуктазы мыши для селективного отбора и амплификации в эукариотических клетках;

7) 7652-11909 участка, содержащего сигнал полиаденилирования и функциональный терминатор и (7920-7925) гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 3' НТО этого гена (3'CHEF-1 UTR).

Вектор был получен с использованием стандартных методов генной инженерии, коммерчески доступных плазмид и химически синтезированных олигонуклеотидов (Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989).

Элементы вектора перечислены в порядке их расположения. Взаимный порядок расположения функциональных элементов является существенным для эффективной работы вектора.

В качестве рекомбинантной плазмиды согласно настоящему изобретению могут использоваться различные плазмиды, обладающие способностью к интеграции в геном клетки-реципиента после трансфекции, содержащие конститутивный эукариотический промотор, экспрессионную бицистронную кассету и области, обеспечивающие эухроматинизацию района интеграции экспрессионный кассеты.

Предпочтительно, чтобы экспрессионный плазмидный вектор согласно настоящему изобретению дополнительно содержал консенсусную последовательность Козак. Последовательность Козак располагается вокруг старт-кодона целевого гена и способствует инициации трансляции мРНК целевого гена.

Последовательность экспрессионной плазмиды p1.1-eGFP несущей вставку гена репортера - зеленого флуоресцентного белка eGFP согласно настоящему изобретению представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2.

Фрагменты ДНК, которые кодируют по существу те же регуляторные элементы могут быть получены, например, путем модификации нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК (SEQ ID NO:1), например, посредством метода сайт-направленного мутагенеза, так, что один или несколько нуклеотидов в определенном сайте будут делегированы, заменены, вставлены или добавлены. Фрагменты ДНК, модифицированные, как описано выше, могут быть получены с помощью традиционных методов обработки с целью получения мутации.

Показатели функциональной активности, при которой считается, что полученный вектор позволяет получить высокопродуктивный клон клеток с множественными копиями экспрессионной кассеты в геноме, определяются по концентрации секретируемого белка в культуральной среде или по концентрации несекретируемого белка в лизате клеточной массы или по специфическим функциональным свойствам целевого белка, в случае eGFP - по отношению интенсивности флуоресценции лизата клеточной массы к содержанию общего белка в клеточной массе. Измерение интенсивности флуоресценции и тотального клеточного белка описано в Примере 6, измерение концентрации секретируемого или несекретируемого целевого белка может быть проведено при помощи твердофазного ИФА, измерение функциональной активности целевого белка может быть проведено, например, коагулометрически для факторов свертываемости крови, спектрофотометрически для ферментов, при помощи твердофазного ИФА с использованием антигена на подложке - для иммуноглобулинов и т.д. Считается, что вероятность интеграции генетической кассеты в геном увеличена, если на 21 день после трансфекции доля лунок культуральных планшетов, в которых интенсивность флуоресценции eGFP достоверно выше фонового значения, более чем вдвое выше доли таких лунок для клеток, трансфицированных контрольной генетической конструкцией в одинаковых условиях. Считается, что частота амплификации целевого гена выше, чем для контрольной генетической конструкции, если средняя удельная интенсивность флуоресценции eGFP для пяти лунок культуральных планшетов, проанализированных через 15 дней после введения повышенной концентрации метотрексата и дающих максимальные интенсивности флуоресценции среди всех проанализированных лунок, более чем вдвое выше аналогичного показателя для культуры, трансфицированной контрольной генетической конструкцией и подвергнутой такой же обработке метотрексатом.

Практические функциональные свойства вектора p1.1 (SEQ ID NO:1) можно оценить по оценке экспрессии репортерного белка, ОРС которого с соответствующей последовательностью Козак клонирована в p1.1 (примером такой конструкции является плазмида p1.1-eGFP SEQ ID NO:2) по сравнению с контрольным вектором p1.1(EBVTR-) (SEQ ID NO:3), в который клонирована идентичная вставка (с образованием конструкции p1.1-eGFP (EBVTR-)(SEQ ID NO:4)).

Также целью настоящего изобретения является предоставление бицистронной мРНК, образующейся в ходе экспрессии описанной выше экспрессионной кассеты, содержащей открытую рамку считывания целевого рекомбинантного белка, внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMCV) и открытую рамку считывания дегидрофолатредуктазы (DHFR). Экспрессия целевого гена и гена селекционного маркера в составе указанной бицистронной мРНК обеспечивает их повышенную генетическую сцепленность. При использовании клеток мыши для получения рекомбинантных белков предпочтительно использование открытой рамки считывания дегидрофолатредуктазы (DHFR) мыши.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения стабильных линий клеток млекопитающих с множественными копиями экспрессионной кассеты в геноме, продуцирующих целевой белок с высокой эффективностью.

Указанный способ включает трансфекцию клеток млекопитающего, не содержащих активные аллели дегидрофолатредуктазы, экспрессионным вектором согласно настоящему изобретению, содержащим вставку с ОРС целевого гена, кодирующей целевой рекомбинантный белок; отбор жизнеспособных клеток на среде, не содержащей гипоксантин и тимидин, с последующим отбором клеток млекопитающих - продуцентов целевого белка на среде, содержащей метотрексат. Предпочтительная концентрация метотрексата в среде составляет 50 нМ, предпочтительно 100 нМ, предпочтительно 200 нМ.

В качестве клеток млекопитающего, не содержащих активные аллели дегидрофолатредуктазы, могут быть использованы любые традиционно применяемые линии клеток с инактивируемой дигидрофолатредуктазой. Предпочтительно использование клеток эпителия яичника китайского хомячка (СНО), нокаутных по гену дигидрофолатредуктазы (dhfr-/-), линия DG-44 (Invitrogen, США).

Целевым рекомбинантных белком согласно настоящему изобретению может быть любой белок, представляющий интерес в данной области техники. Примером таких белков является, например, зеленый флуоресцентный белок eGFP, но не ограничиваются ими.

Также целью настоящего изобретения является предоставление описанного выше способа, в котором культивируют клетки СНО DG44, трансфицированные экспрессионным вектором согласно настоящему изобретению, содержащим вставку с ОРС целевого гена, кодирующей целевой рекомбинантный белок.

Также целью настоящего изобретения является предоставление способа получения рекомбинантных белков в клетках млекопитающих, включающего культивирование в питательной среде клеток млекопитающих - продуцентов целевого белка, полученных описанным выше способом, и выделение полученного целевого белка из культуральной жидкости.

Выращивание клеток, выделение и очистка целевого белка из культуральной или подобной ей жидкости может быть осуществлена способом, подобным традиционным способам культивирования, в которых рекомбинантный белок продуцируется с использованием клеток млекопитающих.

Питательная среда, используемая для культивирования, может быть как синтетической, так и натуральной, при условии, что указанная среда содержит источники углерода, азота, минеральные добавки и, если необходимо, соответствующее количество питательных добавок, необходимых для роста клеток. В качестве источника углерода могут использоваться различные углеводы, такие как глюкоза или сахароза и другие органические кислоты. В качестве источника азота могут использоваться различные неорганические соли аммония, такие как аммиак и сульфат аммония, другие соединения азота, такие как амины, природные источники азота. В качестве минеральных добавок могут использоваться фосфат калия, сульфат магния, хлорид натрия, сульфат железа, сульфат марганца, хлорид кальция и подобные им соединения. В качестве витаминов могут использоваться тиамин, дрожжевой экстракт и т.п.

Выращивание может осуществляться в аэробных условиях, предпочтительно с повышенным содержанием CO2 (8%), таких как перемешивание культуральной жидкости в колбах, при температуре в пределах от 20 до 40°С, предпочтительно в пределах от 30 до 38°С. Обычно, выращивание в течение от 12 часов до 4 дней приводит к накоплению целевого рекомбинантного белка в культуральной среде.

После выращивания твердые остатки, такие как клетки, могут быть удалены из культуральной жидкости методом центрифугирования, а затем целевой белок может быть выделен и очищена методами хроматографии и/или концентрирования.

Особенности вектора и результаты его практического применения приведены на следующих чертежах.

Краткое описание чертежей:

На Фигуре 1 показана схема сборки участка терминального повтора вируса EBV и областей промотора и терминатора гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка с фланкирующими их областями. Обозначения: EBVTR - участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBV); 5'CHEF-1 UTR функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка фланкированный 5' НТО этого гена; 3'CHEF-1 UTR функциональный терминатор и сигнал полиаденилирования гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка фланкированный 3' НТО этого гена.

На Фигуре 2 показана схема получения плазмид p1.1, p1.1 (EBVTR-), p1.1-eGFP, p1.1(EBVTR-)-eGFP. Обозначения: пунктирной линией обозначены стадии ПЦР, сплошной линией обозначены стадии рестрикции-лигирования, эндонуклеазы рестрикции, использовавшиеся для клонирования, указаны под названиями плазмид.

На Фигуре 3 показана карта экспрессионной плазмиды p1.1 (длина 11909 пар оснований). Используются следующие обозначения: pUC origin - область начала репликации плазмиды pUC; bla - открытая рамка считывания бета-лактамазы, обеспечивающей устойчивость к ампициллину; bla promoter - прокариотический промотер гена bla; EBVTR - участок терминального повтора вируса Эпштейн-Барр человека (EBVTR); 5'CHEF-1 UTR функциональный промотор гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 5' НТО этого гена; EMCV IRES - внутренний сайт связывания рибосом вируса энцефаломиокардита (EMCV); DHFR - открытая рамка считывания дигидрофолатредуктазы мыши для селективного отбора и амплификации в эукариотических клетках; 3'CHEF-1 UTR функциональный терминатор и сигнал полиаденилирования (7920-7925) гена фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка, фланкированный 3' НТО этого гена; Стрелками указаны направления транскрипции генов, в скобках указаны номера первого и последнего нуклеотидов фрагментов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.

На Фигуре 4 показана карта экспрессионной плазмиды p1.1 (EBVTR-) (длина 11501 пар оснований). Обозначения аналогично фигуре 3.

На Фигуре 5 показана карта экспрессионной плазмиды p1.1-eGFP (длина 12623 пар оснований). Обозначения аналогично фигуре 3, eGFP - открытая рамка считывания зеленого флуоресцентного белка с последовательностью Козак и стоп-код оном.

На Фигуре 6 показана карта экспрессионной плазмиды p1.1(EBVTR-)-eGFP (длина 12215 пар оснований). Обозначения аналогично фигуре 5.

На Фигуре 7 показана диаграмма удельных интенсивностей флуоресценции белка eGFP при транзиентной трансфекции клеток СНО плазмидами p1.1-EGFP и p1.1(EBVTR-)-EGFP. По оси ординат отложена нормализованная интенсивность флуоресценции в условных единицах, линеаризация по данным калибровочного графика для раствора белка eGFP.

На Фигуре 8 показан график абсолютных интенсивностей флуоресценции EGFP для 10 наиболее продуктивных лунок, полученных при первичной селекции клонов в присутствии и отсутствии 50 нМ метотрексата.

На Фигуре 9 показан график удельных интенсивностей флуоресценции EGFP для 8 наиболее продуктивных олигоклональных линий, полученных при амплификации целевого гена под действием различных концентраций метотрексата.

На Фигуре 10 показана динамика удельных интенсивностей флуоресценции EGFP для 6 олигоклональных линий с амплификацией целевого гена при их продолжительном культивировании.

Существо настоящего изобретения и его промышленная применимость в биотехнологии иллюстрируются следующими примерами.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Получение плазмиды PAL-EBV

ПЦР-продукт, содержащий терминальные повторы EBV (SEQ ID NO:5) собирали из синтетических олигонуклеотидов EBV-H1F1-F (SEQ ID NO:6); EBV-H1F1-R (SEQ ID NO:7); EBV-H1F2-F (SEQ ID NO:8); EBV-H1F2-R (SEQ ID NO:9); EBV-H1F3-F (SEQ ID NO:10); EBV-H1F3-R (SEQ ID NO:11); EBV-H1F4-F (SEQ ID NO:12); EBV-H1F4-R (SEQ ID NO:13); EBV-H2F1-F (SEQ ID NO:14); EBV-H2F1-R (SEQ ID NO:15); EBV-H2F2-F (SEQ ID NO:16); EBV-H2F2-R (SEQ ID NO:17); EBV-H2F3-F (SEQ ID NO:18); EBV-H2F3-R (SEQ ID NO:19); для аналитических ПЦР в процессе сборки использовали специфические праймеры EBV-H1F2-SHORTF (SEQ ID NO:20); EBV-H2F2-SHORTR (SEQ ID NO:21); EBV-H2F1-SHORTF (SEQ ID: NO:22); для анализа полученной конструкции PAL-EBV (SEQ ID NO:23) использовали стандартные праймеры к последовательностями вектора PAL-TA (ЗАО «Евроген», Россия) M13dir (SEQ ID NO:24), M13rev (SEQ ID NO:25); SP6 (SEQ ID NO:26), T7prom (SEQ ID NO:27).

Праймеры EBV-H1F1-F (SEQ ID NO:6) и EBV-H1F1-R (SEQ ID NO:7) фосфорилировали, отжигали и клонировали в вектор PAL-TA (ЗАО «Евроген», Россия).

Реакцию фосфорилирования олигонуклеотидов проводили в буфере трис-HCl, рН 7,5, содержащем 10 мМ MgCl₂, 50 мМ дитиотреитола, 1 мМ АТФ и 100 пМ олигонуклеотида, 1 ед. полинуклеотидкиназы фага Т4 (Сибэнзим, Россия) в течение 30 минут при 37°С. После окончания реакции фермент инактивировали при 65°С 10 мин.

Для получения дуплекса вносили в пробирку по 100 пм каждого олигонуклеотида, нагревали до 95°С и медленно охлаждали до комнатной температуры и лигировли в вектор PAL-TA (ЗАО «Евроген», Россия) с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и стандартного буфера (Fermentas, Литва). Полученной лигазной смесью трансформировали клетки Е.coli штамма DH5alpha, с генотипом F- φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169 recA1 endA1 hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 λ- thi-1 gyrA96 relA1. Для этого к 200 мкл замороженной суспензии клеток Е.coli добавляли 5 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду 30 мин, нагревали до 42°С на 45 секунд и инкубировали на льду 5 минут, затем добавляли 800 мкл питательного бульона SOB, инкубировали при 37°С 60 минут, затем переносили суспензию на чашку Петри с твердой агаризованной средой, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/1 мл агара и помещали в термостат на 37°С 18 часов. Колонии Е.coli, отобранные в результате бело-голубого скрининга, анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием праймеров EBV-H1F1-F (SEQ ID NO:6) и EBV-H1F1-R (SEQ ID NO:7), отобранные клоны наращивали в 5 мл среды 2xYT-Amp и выделяли плазмидную ДНК Получали плазмиду PAL-H1F1 при помощи набора Gene JET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва) по протоколу производителя. После чего выделяли фрагмент PAL-H1F1/XmaI из 1,5% агарозного геля набором "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" («Promega», США) по протоколу производителя.

Праймеры EBV-H1F3-F (SEQ ID NO:10), EBV-H1F3-R (SEQ ID NO:11) и EBV-H1F4-F (SEQ ID NO:12) и EBV-H1F4-R (SEQ ID NO:13) отжигали попарно (нагревали до 95°С и медленно охлаждали до комнатной температуры), фосфорилировали как описано выше и лигировали два дуплекса между собой ДНК-лигазой фага Т4 (Fermentas, Литва), после чего клонировали в вектор PAL-TA как описано выше. Получали плазмиду PAL-H1F3-4, обрабатывали рестриктазой XmaI и лигировали с фрагментом PAL-H1F1/XmaI, отбирали клоны и выделяли плазмиды как описано выше. Полученную плазмиду PAL-H1F1-3-4 обрабатывали эндонуклеазой XmaI и лигировали с стоженными, фосфорилированными частично комплиментарными праймерами EBV-H1F2-F (SEQ ID NO:8) и EBV-H1F2-R (SEQ ID NO:9), при отжиге образующими дуплекс с выступающими «липкими» 5'-концами комплиментарными липким концам, образующимся при рестрикции акцептора нуклеазой XmaI. Трансформацию проводили как описано выше.

Клоны PAL-H1 анализировали методом ПЦР с клонов при помощи праймеров EBV-H1F2-SHORTF (SEQ ID NO:20), EBV-H1F1-R (SEQ ID NO:7), M13dir (SEQ ID NO:24), M13rev (SEQ ID NO:25).

Праймеры EBV-H2F1-F (SEQ ID 14) и EBV-H2F1-R (SEQ ID NO:15) фосфорилировали, отжигали и клонировали в вектор PAL-TA (Евроген) как описано выше, полученную плазмиду PAL-H2F1 обрабатывали рестриктазой BspEI и подставляли двуцепочечный адаптер полученный как описано выше из праймеров EBV-H2F2-F (SEQ ID NO:16) и EBV-H2F2-R (SEQ ID NO:17), выступающие 5' концы которых коплиментарны липким концам, образующимся при обработке рестриктазой BspEI с исчезновением одного сайта. Полученную плазмиду PAL-H1F1-2 обрабатывали по сохранившемуся уникальному сайту рестриктазой BspEI и подставляли двуцепочечный адаптер, полученный как описано выше из праймеров EBV-H2F3-F (SEQ ID NO:18) и EBV-H2F3-R (SEQ ID NO:19).

Клоны PAL-H2 анализировали методом ПЦР с клонов при помощи праймеров EBV-H2F2-SHORTR (SEQ ID NO:21), EBV-H2F2-SHORTF (SEQ ID NO:22), M13dir (SEQ ID NO:24), M13rev (SEQ ID NO:25). Две половины целевой последовательности EBV-H1 и EBV-H2 собирали по сайтам рестрикции AvrII/NheI. Схема сборки фрагментов EBVTR представлена на Фиг.1

Полученная конструкция PAL-EBV представлена в списке последовательностей под номером SEQ ID NO:23. Ее секвенировали с использованием праймеров SP6 (SEQ ID NO:26), T7prom (SEQ ID NO:27).

Пример 2. Получение плазмиды PBL-2-ID и PBL-2-ID-EBV

ОРС, кодирующую дегидрофолатредуктазу (аминокислотная последовательнось SEQ ID NO:28), получали при помощи ПЦР с использованием праймеров AD-DHFR-F (SEQ ID NO:29), AD-DHFR-R (SEQ ID NO:30) и плазмиды pOptivec-circ (SEQ ID NO:31) в качестве матрицы. ПЦР проводили набором реактивов "Encycio PCR kit" (ЗАО Евроген, Россия) по инструкции производителя, ПЦР-продукт очищали из 1% агарозного геля набором "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" («Promega», США) по протоколу производителя и лигировли в векторную плазмиду PAL-TA (ЗАО «Евроген», Россия) с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и стандартного буферного раствора (Fermentas, Литва). Полученными лигазными смесями трансформировали клетки Е.coli штамма DH5 alpha и вели отбор клонов и выделение плазмид как описано в Примере 1. Полученная конструкция PAL-DHFR представлена в списке последовательностей под номером 32. Ее секвенировали с использованием праймеров SP6 (SEQ ID 26), T7prom (SEQ ID 27).

Фрагмент, кодирующий внутренний сайт связывания рибосом (IRES) вируса энцефаломиокардита (EMCV), переносили рестрикцией из pOptivec-circ (SEQ ID NO:31). Для этого pOptivec-circ (SEQ ID NO:31), обрабатывали рестриктазами BamHI-BglII и лигировали в PAL-DHFR/BglII с образованием плазмиды PAL-ID (SEQ ID NO:34). Для ее секвенирования использовали праймеры IRESrev (SEQ ID NO:35) и IRESArev (SEQ ID NO:36) и AD-DHFR-F (SEQ ID NO:29).

В качестве основы для сборки целевого вектора использовали вектор PBL-2 (SEQ ID NO:37). Фрагмент, содержащий IRES-DHFR, вырезали из плазмиды PAL-ID (SEQ ID NO:34) рестриктазами NotI и XbaI, лигировали в PBL-2 (SEQ ID 37)/ NotI и XbaI с образованием плазмиды PBL-2-ID (SEQ ID NO:38). Анализ клонов вели с праймеров AD-DHFR-F (SEQ ID NO:29) и SQ-BB-R (SEQ ID NO:40). Для ее секвенирования использвали праймеры SQ-BlaN-F (SEQ ID NO:39) и SQ-BB-R (SEQ ID NO:40).

Фрагмент, содержащий EBVTR, вырезали из плазмиды PAL-EBV (SEQ ID NO:23) рестрикцией NsiI, и лигировали в PBL-2-ID (SEQ ID 38)/ PstI с образованием плазмиды PBL-2-ID-EBV (SEQ ID NO:41).

Пример 3. Получение векторов p1.1(EBVTR-) и p1.1, содержащих 5' и 3' НТО EF-1 китайского хомячка

Фрагмент, содержащий промотор фактора элонгации 1 альфа китайского хомячка и 5'НТО этого гена, соответствующий области 8532-12603 AY188393 (SEQ ID 42), получали методом ПЦР с использованием геномной ДНК выделенной из клеток СНО DG44 и праймеров AD-5CHEF1-R (SEQ ID NO:43); AD-5CHEF2-F (SEQ ID NO:44); AD-5CHEF2-R (SEQ ID NO:45); AD-5CHEF3-F (SEQ ID NO:46); AD-5CHEF3-R (SEQ ID NO:47); AD-5CHEF4-F (SEQ ID NO:48); AD-5CHEF4Xho-R (SEQ ID NO:49); AD-5CHEF1-F (SEQ ID NO:50); AD-5CHEF5-F (SEQ ID NO:51); AD-5CHEF5-R (SEQ ID NO:52); AD-5CHEF61-F (SEQ ID NO:53); AD-5CHEF61-R (SEQ ID NO:54); AD-5CHEF62-F (SEQ ID NO:55); AD-5CHEF62-R (SEQ ID NO:56).

Методом ПЦР с геномной ДНК с использованием праймеров AD-5CHEF1-F (SEQ ID NO:50) и AD-5CHEF1-R (SEQ ID NO:43) получали фрагмент 5CHEF-F1 (SEQ ID:57); с использованием праймеров AD-5CHEF2-F (SEQ ID NO:44) и AD-5CHEF2-R (SEQ ID NO:45) получали фрагмент 5CHEF-F2 (SEQ ID NO:58); с использованием праймеров AD-5CHEF3-F (SEQ ID NO:46) и AD-5CHEF3-R (SEQ ID NO:47) получали фрагмент 5CHEF-F3 (SEQ ID NO:59); с использованием праймеров AD-5CHEF4-F (SEQ ID NO:48) и AD-5CHEF4Xho-R (SEQ ID NO:49) получали фрагмент 5CHEF-F4 (SEQ ID NO:60); с использованием праймеров AD-5