Авирулентная адъювантная живая вакцина против mycoplasma hyopneumoniae

Авирулентная адъювантная живая вакцина против mycoplasma hyopneumoniae

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится в основном к областям иммунологии и ветеринарной медицины. Более конкретно, в настоящем изобретении предложены адъювантные живые авирулентные композиции М. hyopneumoniae на основе штамма. J М.hyopneumoniae, включая иммуногенные и вакцинные композиции, которые способствуют снижению тяжести и/или предупреждению заболевания, вызванного одним или более чем одним вирулентным штаммом М.hyopneumoniae. Также предложены адъювантные живые авирулентные композиции М.hyopneumoniae, включая иммуногенные или вакцинные композиции, дополнительно содержащие химерную модифицированную живую вакцину против свиного цирковируса типа 1-типа 2 (cPCV1-2). Введение животному одной или двух доз адъювантной живой авирулентной композиции М.hyopneumoniae, раскрытой в данной заявке, является эффективным в обеспечении иммунитета, включая клеточный иммунитет и/или гуморальный иммунитет против заражения вирулентным штаммом М.hyopneumoniae.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Mycoplasma hyopneumoniae (также называемая М.hyopneumoniae) является возбудителем микоплазменной пневмонии свиней. Заболевание вызывает хронический кашель, тусклый цвет щетины, замедленный рост и болезненный вид в течение нескольких недель. У зараженных животных наблюдаются характерные поражения в виде участков уплотнения от красного до серого цвета, в частности, в вентральной апикальной и сердечной долях. Хотя заболевание вызывает незначительную смертность, пораженная свинья зачастую склонна к вторичным инфекциям, вызванным условно-патогенными микроорганизмами, приводящим к гибели или стрессу. (R.F. Ross, Mycoplasmal diseases, pp.436-444, в A.D. Laman, et at., (eds.) Diseases of Swine, Iowa State University Press, 1986).

Это заболевание считается одной из наиболее важных причин ассоциированной с заболеванием гибели свиней (Whittlestone, pp.133-176, in Tully and Whitcomb (eds.), The Mycoplasma Vol 2: Human and Animal Mycoplasmas, New York, Academic Press, (1979)). Заболевание обычно приводит к неэффективному приросту массы и появлению чахлых и болезненных животных. Кроме того, пораженная свинья часто склонна к вторичной инфекции, вызванной условно-патогенными организмами (Burch, Pig America pp.26-27, December, 1982). Экономические последствия этого заболевания являются значительными. Только экономические потери были оценены в 200-250 миллионов долларов ежегодно.

Mycoplasma hyopneumoniae является медленно растущей, прихотливой бактерией, лишенной клеточной стенки. Ее часто бывает трудно выделить из дыхательных путей из-за Mycoplasma hyorhinis, общего вторичного агента, также локализованного в дыхательных путях. Заболевание распространяется в виде аэрозоля, продуцируемого при кашле, и при непосредственном контакте с пораженной свиньей или свиньей-бактерионосителем в стадии выздоровления. Смешивание зараженных и незараженных животных приводит к раннему и частому повторному заражению. Инфекция часто начинается с заражения поросят свиноматками-носителями во время опороса.

Из-за методов содержания стада инфекция может быть обнаружена только в конце жизни. Дополнительное заражение обычно наблюдают после отъема, когда поросят объединяют. Явное заболевание обычно наблюдают у поросят в возрасте шести недель или старше. Скорости роста и скорости конверсии корма значительно снижены у пораженных животных. Существующее лечение с использованием антибиотиков является дорогостоящим и требует длительного применения. Остается проблемой повторное заражение животных.

Таким образом, вакцины в настоящее время являются наиболее эффективным способом предупреждения инфекций и их последствий. Были предприняты многочисленные попытки создания вакцины для защиты свиней от заражения Mycoplasma hyopneumoniae. Некоторые исследователи описали вакцины, содержащие полученные рекомбинантным путем поверхностные антигены Mycoplasma hyopneumoniae, Schaller с совет., патент США №4894332, выданный 16 января 1990 г.; европейская патентная публикация №283840, опубликованная 28 сентября 1988 г. В публикации РСТ № WO 86/00019, опубликованной 3 января 1986 г., раскрыта вакцина против Mycoplasma hyopneumoniae, содержащая исключительно плазматические мембраны Mycoplasma hyopneumoniae, свободные от других клеточных компонентов. Etheridge с совет., Res. Vet. Sci. 33:188 (1982), обнаружил неполную защиту против колонизации легких Mycoplasma hyopneumoniae при введении живой вакцины внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно. Kristensen с coaem., Am. J. Vet. Res. 42:784 (1981), не обнаружил защиты свиней от микоплазменной пневмонии после инъекции инактивированной нагреванием Mycoplasma hyopneumoniae. Ross с соавт., Am. J. Vet. Res. 45:1899 (1984), обнаружил, что применение экстрактов Mycoplasma hyopneumoniae, приготовленных посредством процедуры замораживания-оттаивания для иммунизации свиней, обеспечивало только непостоянную защиту, и в некоторых случаях у иммунизированных свиней отмечали повышенное развитие поражений. Эти исследователи также изучали цельно-клеточную вакцину, полученную путем инактивации формалином. Инактивация формалином значительно уменьшает защитную иммуногенность Mycoplasma hyopneumoniae, и такая вакцина не является эффективной. Yoshioka с соавт., патент США №3917819 (выданный 4 ноября 1975 г.) раскрыл некоторые убитые вакцины против микоплазмы, содержащие микоплазму, инактивированную формалином, включая инактивированную вакцину против Mycoplasma hyopneumoniae. В европейской патентной публикации 571648 Chung-Nan раскрыл вакцину против М.hyopneumoniae, основанную на высоко пролиферативном и антигенном штамме PRIT-5.

Вакцины, основанные на инактивированных вирулентных штаммах Mycoplasma hyopneumoniae, имеются в продаже. Fort Dodge Animal Health (FDAH) продает бактерии Mycoplasma hyopneumoniae под названием Suvaxyn® и Respifend® Mycoplasma hyopneumoniae для применения в качестве вакцины для защиты здоровых свиней против клинических признаков, вызванных Mycoplasma hyopneumoniae. Этот бактерии рекомендуют в качестве двухдозовой вакцины для поросят в возрасте по меньшей мере одной недели, с применением второй дозы через две или три недели после первой вакцинации.

Штамм J М.hyopneumoniae является непатогенным штаммом с ограниченной способностью прикрепляться к ресничкам эпителия свиньи и, следовательно, вызывать заболевание. Castro et at., Veterinary Microbiology 116:258-269 (2006) и Vasconcelos et al., J. Bacteriol. 187(16):5568-5577 (2005) (описывающие полную геномную последовательность штамма J М.hyopneumoniae (ATCC 25934)). Сравнения геномов патогенных и непатогенных штаммов (штамм J) выявили различия в поверхностных белках, включая адгезин ресничек эпителия, который, как считают, является определяющим соответствующие патогенные свойства у штаммов М.hyopneumoniae. Vasconcelos et al. (2006) и Djordjevic et al., Infection and Immunity 72(5):2791-2802 (2004).

М. hyopneumonia экспрессирует на своей клеточной поверхности мембранные липопротеины, в частности, белки Р46, Р65 и Р97, которые несут видоспецифические антигенные детерминанты. Недавно Bouh с соавт. описал моноклональные антитела к Р46 и Р65 живого авирулентного эталонного штамма J М.hyopneumoniae ATCC 25934. Clin. Diag. Lab. Immunology 10(3):459-468 (2003). Blank и Stemke описали физическую и генетическую карту генома штамма J М.hyopneumoniae, Can. J. Microbiol. 46:832-840 (2000), a Wilton с соавт. описал скрининг экспрессирующих библиотек, полученных из непатогенного штамма J М.hyopneumoniae, и скрининг этих библиотек с помощью свиной гипериммунной сыворотки против М.hyopneumoniae.

Существует необходимость в композициях, включая иммуногенные или вакцинные композиции, полученных из живой адъювантной авирулентной Mycoplasma hyopneumoniae, которые обеспечивают эффективность против вирулентных штаммов М.hyopneumoniae. Упоминание какой-либо ссылки в данной заявке не следует рассматривать, как признание факта, что такая ссылка пригодна в качестве предшествующего уровня техники для настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложены композиции, включая иммуногенные композиции или вакцинные композиции, содержащие иммунологически эффективное количество живой авирулентной Mycoplasma hyopneumoniae и биологически приемлемый адъювант. Композиции, раскрытые в данной заявке, вызывают иммунный ответ против Mycoplasma hyopneumoniae, таким образом предупреждая и/или уменьшая тяжесть заболевания, вызванного этим организмом, или облегчая по меньшей мере один симптом, ассоциированный с этим заболеванием.

Соответственно, в одном аспекте изобретения предложена композиция для индукции иммунного ответа против Mycoplasma hyopneumoniae у животного, содержащая иммунологически эффективное количество живого авирулентного штамма Mycoplasma hyopneumoniae и биологически приемлемый адъювант.

В одном из воплощений композиция содержит живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, геном которого содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере примерно 90%-ную гомологию с последовательностью нуклеиновой кислоты эталонного штамма J.

В одном из воплощений композиция содержит живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, геном которого содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере примерно 95%-ную гомологию с последовательностью нуклеиновой кислоты эталонного штамма J.

В одном из воплощений композиция содержит живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, геном которого содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере примерно 99%-ную гомологию с последовательностью нуклеиновой кислоты эталонного штамма J.

В одном из воплощений композиция содержит живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, который имеет по меньшей мере примерно 70%-ную полиморфную идентичность с эталонным штаммом J.

В одном из воплощений композиция содержит живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, который имеет по меньшей мере примерно 85%-ную полиморфную идентичность с эталонным штаммом J.

В одном из воплощений композиция содержит живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, который имеет по меньшей мере примерно 95%-ную полиморфную идентичность с эталонным штаммом J.

В одном из воплощений процент гомологии живого авирулентного штамма Mycoplasma hyopneumoniae, используемого в композиции, описанной в данной заявке, определяют путем сравнения с авирулентным эталонным штаммом J с номером доступа АТСС 25934 (номер доступа в GenBank АЕ 017243) или 27715. В некоторых других воплощениях эталонный штамм может быть вирулентным штаммом, например, имеющим номера доступа АТСС 25617 или 25095.

В одном из воплощений процент полиморфной идентичности живого авирулентного штамма Mycoplasma hyopneumoniae, используемого в композициях, описанных в данной заявке, определяют путем сравнения с авирулентным эталонным штаммом J с номером доступа АТСС 25934 или 27715. В некоторых других воплощениях эталонный штамм может быть вирулентным штаммом, например, с номером доступа АТСС 25617 или 25095.

В одном из воплощений живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, используемый в композициях, описанных в данной заявке, представляет собой штамм J с номером доступа АТСС 25934 или 27715.

В одном из воплощений живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, используемый в композициях, описанных в данной заявке, представляет собой штамм J с номером доступа АТСС 27715.

В одном из воплощений иммунный ответ, вызванный живым авирулентным штаммом Mycoplasma hyopneumoniae, защищает животное против инфекции или уменьшает тяжесть по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с инфекцией вирулентным штаммом Mycoplasma hyopneumoniae.

В одном из воплощений введение животному одной дозы адъювантной живой авирулентной композиции М.hyopneumoniae, раскрытой в данной заявке, является эффективным в обеспечении иммунитета у животного против инфекции Mycoplasma.

В одном из воплощений введение животному двух доз адъювантной живой авирулентной композиции М.hyopneumoniae, раскрытой в данной заявке, является эффективным в обеспечении иммунитета у животного против инфекции Mycoplasma.

Адъювантная живая авирулентная вакцинная композиция против Mycoplasma hyopneumoniae, раскрытая в данной заявке, может быть использована соответственно для применения у свиней против инфекции и заболевания, вызванного Mycoplasma hyopneumoniae, и найдет применение в контроле и/или предупреждении распространения инфекции и заболевания, вызванного Mycoplasma hyopneumoniae, в популяции свиней.

Таким образом, в иммуногенных композициях и вакцинных композициях по настоящему изобретению используют одну или более чем одну живую авирулентную Mycoplasma hyopneumoniae в комбинации с одним или более чем одним адъювантом, таким как биологически приемлемый адъювант.Биологически приемлемый адъювант возможно может представлять собой один или более адъювантов, выбранных из группы, состоящей из SP-масла, SL-CD, полимера акриловой кислоты (такого как Carbopol®, Noveon, Inc., Cleveland, ОН) и смеси метаболизируемого масла, такого как один или более ненасыщенных терпеновых углеводородов, например сквален или сквалан, и полиоксиэтилен-полипропиленового блоксополимера, такого как Pluronic® (BASF, Florham Park, New Jersey).

Концентрация адъюванта, используемого в композиции, описанной в данной заявке, будет зависеть от природы адъюванта. Адъюванты, как правило, находятся в композициях, описанных в данной заявке, в конечной концентрации примерно 1-50% (об./об.) и более типично в конечной концентрации примерно 10%, 15%, 20%, 25% или 30% (об./об.). В композициях, содержащих SP-масло, адъювант типично присутствует в концентрации от примерно 1% до примерно 25% (об./об.), более типично от примерно 5% до примерно 15% (об./об.), такой как, например, примерно 10% (об./об.). В композициях, содержащих полимер акриловой кислоты и смесь метаболизируемого масла, которая содержит один или более терпеновых углеводородов и полиоксиэтилен-полипропиленовый блоксополимер, отношение полимера акриловой кислоты к смеси метаболизируемого масла/полиоксиэтилен-полипропиленового блоксополимера обычно представляет собой соотношение от примерно 1:25 до примерно 1:50 и обычно в конечной концентрации от примерно 1% до примерно 25% (об./об.).

В одном из воплощений биологически приемлемый адъювант содержит SP-масло. В одном из воплощений SP-масло присутствует в концентрации от примерно 1% до примерно 25% об./об. В одном из воплощений SP-масло присутствует в концентрации от примерно 5% до примерно 15% об./об. В одном из воплощений SP-масло присутствует в концентрации примерно 10% об./об.

В некоторых воплощениях композиции, раскрытые в данной заявке, можно использовать в дополнительной комбинации с одной или более другими живыми бактериями, бактерином, анатоксином и/или вирусным антигеном. Таким образом, в некоторых аспектах этих воплощений адъювантная живая авирулентная композиция М.hyopneumoniae может содержать иммунологически эффективное количество живой авирулентной Mycoplasma hyopneumoniae и один или более биологически приемлемых адъювантов в дополнительной комбинации с (а) одной или более живыми бактериями; (б) одним или более чем одним бактерином; (в) одним или более чем одним очищенным анатоксином из одного или более патогенов, таких как, например, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcus suis, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae и бактерии лептоспира; и/или (г) одним или более чем одним вирусным антигеном, где вирус выбран из группы, состоящей из вируса свиного гриппа (SIV), вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV), поксвируса енота, экспрессирующего PRRS и/или другие антигены, TGEV (вирус трансмиссивного гастроэнтерита), экспрессирующего PRRS и/или другие антигены, и свиного цирковируса (PCV). В некоторых аспектах этих воплощений в качестве примера в данной заявке представлены композиции, включая иммуногенные композиции или вакцинные композиции, в которых используют в дополнительной комбинации химерную модифицированную живую вакцину против свиного цирковируса типа 1-типа 2 (cPCV1-2). В рамках этих или альтернативных воплощений композиции, включая иммуногенные или вакцинные композиции, могут дополнительно или возможно включать консервант и стабилизатор, такой как, например, SGGK, тимеросал и/или EDTA.

Концентрация таких других живых бактерий, бактерина, анатоксина и/или вирусного антигена, используемых в композиции, описанной в данной заявке, будет зависеть от природы живых бактерий, бактерина, анатоксина и/или вирусного антигена и, как правило, присутствуют в композициях, описанных в данной заявке. Для таких композиций, где другой антиген является бактериальным, бактерии, как правило, присутствуют в конечной концентрации от примерно 0,5×10⁵ до 0,5×10¹⁰ на миллилитр. Альтернативно, бактерии присутствуют в конечной концентрации от примерно 0,5×10⁶ до 0,5×10⁹ на миллилитр или в конечной концентрации от примерно 0,5×10⁷ до 0,5×10⁸ на миллилитр.

Во втором аспекте изобретения предложены способы индукции иммунного ответа на Mycoplasma hyopneumoniae или защиты животного от заболевания, вызванного Mycoplasma hyopneumoniae, и/или предупреждения или смягчения вспышки такого заболевания среди популяций животных путем введения адъювантной живой авирулентной композиции Mycoplasma hyopneumoniae, как описано в данной заявке. В родственном аспекте в настоящем изобретении также предложены способы усиления имунного ответа на Mycoplasma hyopneumoniae. Такие способы включают стадии введения животному, такому как свинья, одной или двух доз композиции, содержащей один или более адъювантный живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae.

В одном из воплощений в способах по настоящему изобретению используют живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, геном которого содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую примерно 90%-ную гомологию с последовательностью нуклеиновой кислоты эталонного штамма J.

В одном из воплощений в способах по настоящему изобретению используют живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, геном которого содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую примерно 95%-ную гомологию с последовательностью нуклеиновой кислоты эталонного штамма J.

В одном из воплощений в способах по настоящему изобретению используют живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, геном которого содержит последовательность нуклеиновой кислоты, имеющую примерно 99%-ную гомологию с последовательностью нуклеиновой кислоты эталонного штамма J.

В одном из воплощений в способах по настоящему изобретению используют живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, который имеет по меньшей мере примерно 70%-ную полиморфную идентичность с эталонным штаммом J.

В одном из воплощений в способах по настоящему изобретению используют живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, который имеет по меньшей мере примерно 85%-ную полиморфную идентичность с эталонным штаммом J.

В одном из воплощений в способах по настоящему изобретению используют живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, который имеет по меньшей мере примерно 95%-ную полиморфную идентичность с эталонным штаммом J.

В одном из воплощений живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, используемый в способах по изобретению, как описано в данной заявке, представляет собой штамм J с номером доступа АТСС 25934 или 27715.

В одном из воплощений живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae, используемый в способах по изобретению, как описано в данной заявке, представляет собой штамм J с номером доступа АТСС 27715.

В одном из воплощений в изобретении предложен способ усиления иммунного ответа на Mycoplasma hyopneumoniae, включающий стадии:

а) сначала введение животному первой иммуногенной композиции, содержащей иммунологически эффективное количество живого авирулентного штамма Mycoplasma hyopneumoniae с добавлением биологически приемлемого адъювантного материала; и

б) затем введение животному второй иммуногенной композиции, содержащей иммунологически эффективное количество живой авирулентной Mycoplasma hyopneumoniae с добавлением в качестве адъюванта биологически приемлемого адъювантного материала.

В некоторых воплощениях, в зависимости от точного предполагаемого применения, композиции могут быть введены парентерально, например, посредством внутримышечной, подкожной или внутрибрюшинной инъекции или местного нанесения крема. Альтернативно, композиции могут быть введены посредством аэрозоля, интраназальным или пероральным путями, такими как интраназальный спрей или пероральное введение посредством ручной подачи или массового применения.

В третьем аспекте изобретения предложено применение штаммов Mycoplasma hyopneumoniae, описанных в данной заявке, и композиций, содержащих эти штаммы, для изготовления лекарственного средства для лечения животного, страдающего от заражения Mycoplasma hyopneumoniae или страдающего по меньшей мере от одного симптома, ассоциированного с заражением Mycoplasma hyopneumoniae.

Эти и другие воплощения, признаки и преимущества изобретения станут очевидными из подробного описания и прилагаемой формулы изобретения, изложенной в данной заявке ниже. Все патенты, заявки на патенты и другая литература, упомянутые в данной заявке, таким образом включены посредством ссылки во всей своей полноте. В случае несоответствия настоящее изобретение будет иметь приоритетное значение.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Прежде чем способы по настоящему изобретению и методология лечения будут описаны, следует понять, что это изобретение не ограничивается конкретными описанными способами и экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут варьировать. Кроме того, следует понимать, что терминология, используемая в данной заявке, предназначена только для описания конкретных воплощений и не является исчерпывающей.

Используемые в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают в себя множественные значения, если контекст ясно не указывает на иное. Таким образом, например, ссылки на "способ" включают один или более способов, и/или стадий типа, описанного в данной заявке, и/или которые будут очевидны для специалистов в данной области техники при чтении этого описания и так далее.

Соответственно, в настоящей заявке могут быть использованы стандартные методы молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантной ДНК в пределах данной области техники. Такие методы исчерпывающе описаны в литературе. См., например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (здесь "Sambrook et al., 1989"); DAM Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)); Transcription And Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, (1986)); В. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

Хотя какие-либо способы и материалы, подобные или эквивалентные тем, которые описаны в данной заявке, могут быть использованы на практике при тестировании изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны ниже. Все публикации, упомянутые в данной заявке, включены посредством ссылки во всей своей полноте.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Термины, используемые в данной заявке, имеют значения, узнаваемые и известные специалистам в данной области техники, однако, для удобства и полноты конкретные термины и их значения приведены ниже.

Термин "примерно" или "приблизительно" означает статистически значимый диапазон значения. Такой диапазон может находиться в пределах порядка величины, типично 50%, более типично 20%, еще более типично 10% и еще более типично 5% от заданного значения или диапазона. Допустимое изменение, подпадающее под термин "примерно" или "приблизительно", зависит от конкретной системы при исследовании и может быть легко оценено средним специалистом в данной области техники.

"Адъювант" означает композицию, состоящую из одного или более веществ, которые усиливают антигенность живой авирулентной Mycoplasma hyopneumoniae в композиции, как правило, в вакцинной композиции. Адъювант может служить в качестве депо в ткани, которое медленно высвобождает антиген, а также в качестве активатора лимфоидной системы, который неспецифически усиливает иммунный ответ (Hood et al., Immunology, Second Ed., Menio Park, CA: Benjamin/Cummings, 1984. p.384). Часто первичная вакцинация одним антигеном, в отсутствие адъюванта, не будет вызывать гуморальный или клеточный иммунный ответ.Адъюванты включают, но не ограничиваются этим, полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, минеральные гели, такие как гидрат окиси алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, pluronic полиолы, полианионы, пептиды, масляные или углеводородные эмульсии, гемоцианины лимфы улитки и потенциально полезные человеческие адъюванты, такие как N-ацетил-мурамил-1--треонил-D-изоглутамин (thr-MDP), N-ацетил-нор-мурамил-1_-аланил-D-изоглутамин, N-ацетил-мурамил-1--аланил-D-изоглутаминил-1--аланин-2-(1'-2'-дипальмитоил-sn-глицеро-3-гидроксифосфорилокси)этиламин, BCG (бацилла Кальметта-Герена) и Corynebacterium parvum. Предпочтительно, адъювант является биологически приемлемым.

Адъюванты, используемые в композициях, описанных в данной заявке, являются, как правило, "биологически приемлемыми адъювантами" и, таким образом, могут быть использованы в комбинации с живой авирулентной Mycoplasma hyopneumoniae, так что полученные композиции могут быть введены животному in vivo без сопутствующей токсичности. В данной заявке в качестве примера приведены композиции, содержащие живую авирулентную Mycoplasma hyopneumoniae в комбинации с одним или более чем одним биологически приемлемлемым адъювантом, выбранным из группы, состоящей из SP-масла, SL-CD, карбопола и смеси метаболизируемого масла, такого как один или более ненасыщенных терпеновых углеводородов, например сквален или сквалан, и полиоксиэтилен-полипропиленового блоксополимера, такого как Pluronic®.

Живой авирулентный штамм Mycoplasma hyopneumoniae или молекула из него являются "антигенными", когда они способны специфически взаимодействовать с антигенраспознающей молекулой иммунной системы, такой как иммуноглобулин (антитело) или Т-клеточный антигенный рецептор. Как правило, антигенная молекула представляют собой полипептид или его вариант, который содержит "эпитоп" из по меньшей мере примерно пяти и, как правило по меньшей мере из примерно 10 аминокислот.Антигенная область полипептида, также названная в данной заявке "эпитопом", может представлять собой такую область, которая является иммунодоминантной для распознавания антителом или Т-клеточным рецептором, или она может представлять собой область, используемую для образования антитела к молекуле посредством конъюгирования антигенной области с полипептидом-носителем для иммунизации. Молекуле, которая является антигенной, не нужно самой быть иммуногенной, т.е. способной вызывать иммунный ответ без носителя.

Термин "по меньшей мере" означает не менее чем.

Как использовано в данной заявке, "бактерии" представляет собой бактериальный сбор, который был инактивирован и который, в комбинации с некоторыми адъювантами, может вызывать защитный иммунитет для защиты против заболевания или инфекции при введении животным.

Полимеры акриловой кислоты представляют собой, как правило, карбомеры. Карбомеры имеются в продаже под товарным знаком "Карбопол" и описаны, например, в патентах США №№2909462 и 3790665, каждый из которых включен в данную заявку посредством ссылки.

Термин "носитель" относится к разбавителю, адъюванту, эксципиенту, стабилизатору, консерванту и/или наполнителю, с которым вводят соединение или композицию. Такие носители могут представлять собой стерильные жидкости, такие как вода и масла, включая вазелин, масла животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Вода или водные солевые растворы, например, забуференный фосфатами физиологический раствор, растворы Рингера и водные растворы глюкозы и глицерина, часто используют в качестве носителей, в частности, для инъецируемых растворов. Носитель или разбавитель не должны быть токсичными и не должны влиять на биологическую активность антигена/иммуногена. Другие дополнительные вспомогательные вещества, такие как увлажняющие или эмульгирующие агенты, поверхностно-активные вещества, pH буферные вещества и тому подобные, также могут быть использованы в композициях по изобретению. Консерванты могут включать, например, тимеросал и/или EDTA. Подходящие фармацевтические носители описаны в "Remington's Pharmaceutical Sciences" E.W. Martin, 18^е издание. Широкое разнообразие носителей хорошо известно в данной области техники, и выбор конкретных носителей находится в пределах квалификации специалистов в данной области техники.

Термин "колониеобразующая единица" или "КОЕ" представляет собой единицу измерения, используемую для указания числа организмов, способных реплицироваться в данном образце. Это основано на теории, что колония образуется в результате репликации пары/кластера или одиночной клетки бактерии.

"Иммунологически эффективное количество" представляет собой количество живой авирулентной Mycoplasma hyopneumoniae, которое будет вызывать иммунный ответ против Mycoplasma hyopneumoniae. "Иммунологически эффективное количество" будет зависеть от вида, породы, возраста, размера, состояния здоровья животного-реципиента и будет находиться под влиянием предварительной экспозиции животного с одним или более чем одним штаммом Mycoplasma hyopneumoniae, независимо от того является ли этот один или более чем один штамм вирулентным штаммом или авирулентным штаммом Mycoplasma hyopneumoniae. Как использовано в данной заявке, "Иммунологически эффективное количество" живой авирулентной Mycoplasma hyopneumoniae, при использовании в комбинации с подходящим адъювантом, представляет собой такое количество Mycoplasma hyopneumoniae, которое является достаточным для того, чтобы усилить иммуногенность живой авирулентной Mycoplasma hyopneumoniae, и, таким образом, обеспечивает защитный иммунитет против контрольного заражения вирулентным штаммом Mycoplasma hyopneumoniae. В одном из воплощений Иммунологически эффективное количество представляет собой минимум примерно 1×10³ организмов. В одном из воплощений Иммунологически эффективное количество варьирует в диапазоне от примерно 1×10³ колониеобразующих единиц/мл (КОЕ/мл) до примерно 1×10¹¹ КОЕ/мл. В одном из воплощений Иммунологически эффективное количество составляет примерно 5×10 ⁷ КОЕ/мл.

Как использовано в данной заявке, термин "иммуногенный" означает, что живая авирулентная Mycoplasma hyopneumoniae способна вызывать гуморальный и/или клеточный иммунный ответ. Иммуногенный штамм также является антигенным. Иммуногенная композиция представляет собой композицию, которая вызывает гуморальный и/или клеточный иммунный ответ при введении животному.

Термин "иммуногенная композиция" относится к любой фармацевтической композиции, содержащей антиген, например микроорганизм, которая может быть использована для индукции иммунного ответа у млекопитающего. Иммунный ответ может включать Т-клеточный ответ, В-клеточный ответ, или как Т-клеточный, так и В-клеточный ответ.Композиция может способствовать сенсибилизации млекопитающего посредством презентации антигена, ассоциированного с молекулами МНС на клеточной поверхности. Кроме того, антигенспецифические Т-лимфоциты или антитела могут быть получены для обеспечения будущей защиты иммунизированного хозяина. "Иммуногенная композиция" может содержать живую, ослабленную или убитую/инактивированную вакцину, содержащую целый микроорганизм или полученную из него иммуногенную область, которая индуцирует либо клеточно-опосредованный (Т-клеточный) иммунный ответ или антитело-опосредованный (В-клеточный) иммунный ответ, или и тот и другой, и может защищать животное от одного или более симптомов, ассоциированных с инфекцией микроорганизмом, или может защищать животное от смерти, вызванной инфекцией микроорганизмом.

Как использовано в данной заявке, термин "выделенный" означает, что упомянутый материал удален из его природного окружения. Таким образом, выделенный биологический материал может быть свободен от некоторых или всех клеточных компонентов, т.е. компонентов клеток, в которых природный материал встречается естественным образом (например, цитоплазматический или мембранный компонент). Материал является выделенным, если он присутствует в клеточном экстракте или супернатанте. Выделенный белок может быть ассоциирован с другими белками или нуклеиновыми кислотами, или и теми и другими, с которыми он ассоциирован в клетке, или с клеточными мембранами, если он является мембраносвязанным белком. Выделенную органеллу, клетку или ткань удаляют из участка локализации, в котором она обнаруживается в организме. Выделенный материал может быть, но не обязательно, очищен.

Как использовано в данной заявке, термин "MHDCE" означает клеточные эквиваленты ДНК Mycoplasma hyopneumoniae и определяется как единица измерения, используемая для определения приблизительного количества организмов Mycoplasma hyopneumoniae, присутствующих в данном образце.

Термин "парентеральное введение", как использовано в данной заявке, означает введение посредством некоторых других способов, а не через желудочно-кишечный тракт, в частности, посредством введения веществ в организм внутривенным, подкожным, внутримышечным путем, или посредством интрамедуллярной инъекции, а также другие непероральные и неинтраназальные пути введения, такие как внутрибрюшинная инъекция и метеное применение.

Термин "полиморфная идентичность с эталонным штаммом J" относится к сходству между профилем белковой экспрессии одного не-J штамма Mycoplasma hyopneumoniae с эталонным штаммом J Mycoplasma hyopneumoniae. Полиморфная идентичность может быть основана на одной или более характеристиках одного или более белков, включая, но не ограничиваясь этим, например, количество или размер одного или более белков исследуемого микроорганизма Mycoplasma hyopneumoniae, скорость седиментации одного или более белков, или изменения физических или биохимических характеристик одного или более белков. Данный термин также может включать сходство между нуклеотидными последовательностями, которые кодируют любые один или более белов одного не-J штамма Mycoplasma hyopneumoniae и эталонного штамма J Mycoplasma hyopneumoniae, и включает любые мутации в этих последовательностях, включая делеции или замены. Изменение в нуклеотидной и аминокислотной последовательности представляет собой изменение, которое обеспечивает сохранение авирулентной природы организма Mycoplasma hyopneumoniae. В данной области техники хорошо известен широкий спектр анализов для наблюдения за перестройками в нуклеотидной и аминокислотной последовательностях. Например, размер и структуру нуклеиновокислотной или аминокислотной последовательностей исследуют с помощью нозерн-, саузерн-, вестерн-, SDS-PAGE (полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия) ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) профилирования, протоколов ПЦР и секвенирования ДНК, хорошо известных специалистам в данной области техники (см., например, Calus, D. et al. Veterinary Microbiology, Vol.120, Issues 3-4, March 10, 2007, pages 284-291; Scarman, AL, et al. Microbiology (1997), Vol.143: 663-673). Кроме того, другие методы наблюдения за перестройками в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях, такие как анализ однонитевого конфирмационного полиморфизма, хорошо известны в данной области техники (см., например, патент США №5382510, опубликованный 7 сентября 1999 г., и патент США №5952170, опубликованный 17 января 1995 г.).

Термин "очищенный", как использовано в данной заявке, относится к веществу, который был выделен при условиях, которые уменьшают или устраняют присутствие чужеродных веществ, т.е., загрязняющих веществ, включая природные вещества, из которых данное вещество получено. Например, очищенные бактерии или белок, как правило, по существу, свободны от клеток хозяина или культуральных компонентов, включая тканевую культуру или яичные белки, неспецифические патогены и тому подобное. Как использовано в данной заявке, термин "по существу свободный" используют в порядке и в контексте аналитического тестирования материала. Как правило, очищенный материал, по существу свободный от загрязняющих веществ, является по меньшей мере на 50% чистым; более типично по меньшей мере на 90% чистым и еще более типично по меньшей мере на 99% чистым. Чистота может быть оценена посредством хроматографии, гель-электрофореза, иммуноанализа, анализа состава, биологического анализа и других способов, известных в данной области техники. Способы очистки хорошо известны в данной области техники. Термин "по существу чистый" указывает на самую высокую степень чистоты, которая может быть достигнута при использовании стандартных методов очистки, известных в данной области техники.

"Эталонный штамм" относится к штамму микроорганизма, например, Mycoplasma hyopneumoniae, который получен из надежного источника и который может быть использован в качестве контрольного штамма, с которым можно сравнивать другие неуст