Фармацевтическая композиция, продуцирующая антиоксидантный, антимикробный, антитоксический белок - лактоферрин человека, способ ее получения и способ терапии

Фармацевтическая композиция, продуцирующая антиоксидантный, антимикробный, антитоксический белок - лактоферрин человека, способ ее получения и способ терапии

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к области медицины, в частности токсикологии и радиологии, к лекарственным средствам на основе антиоксидантных белков и способам их применения.

Известна фармацевтическая композиция, содержащая лактоферрин человека, вызывающая в организме различные физиологические изменения, включая иммуномодулирующие эффекты, уменьшение воспалительных реакций и ингибирование роста солидных опухолей. (Патент США №6333311).

Известна фармацевтическая композиция, содержащая рекомбинантный лактоферрин человека (Патент США №5955316). Известна композиция, предназначенная для лечения диабетических язв при аппликационном, пероральном или парентеральном применении (Патент США №7524814).

Известен способ профилактики и лечения тяжелых послеоперационных осложнений (гнойно-воспалительных и постгеморрагических) с явлениями полиоргаиной недостаточности и общей интоксикации путем ежедневного внутривенного, внутриполостного, интратрахеального введения лекарственных препаратов, содержащих лактоферрин человека и церулоплазмин человека (Патент РФ №2199337).

К причинам, затрудняющим достижение стойкого терапевтического эффекта при использовании всех указанных композиций относится наличие в них в качестве активных компонентов выделенных и очищенных белков, которые при любых способах введения быстро выводятся из организма больного, что обусловливает необходимость многократного введения. фармацевтических композиций, содержащих антиоксидантный белок лактоферрин, для поддержания терапевтически эффективной концентрации в организме. Помимо сложности с медицинской точки зрения, это экономически невыгодно.

Таким образом, в данной области возникла острая необходимость в разработке фармацевтических композиций и способов профилактики и лечения на их основе, которые были бы терапевтически высоко эффективны, экономически оправданы, а также требовали меньших временных и трудовых затрат медицинского персонала при применении.

Известно активно развивающееся направление по разработке генно-терапевтических препаратов на основе рекомбинантных аденовирусов. Среди человеческих аденовирусов наиболее охарактеризованным является аденовирус человека пятого серотипа (Ад5) (Zaia J.A. The status of gene vectors for the treatment of diabetes, Cell Biochem, Biophys, 2007, v. 48(2-3), c.183-90 - Статус генетических векторов для лечения сахарного диабета).

Одними из преимуществ рекомбинантных аденовирусов является обеспечение высокого уровня экспрессии целевого гена в течение длительного времени, до 28 дней, у некоторых лабораторных животных дольше (до 60-90 дней) (S.L. Brody, R.G. Crystal, Adenovirus-Mediated in Vivo Gene Transfer, Annals new york acadmy of sciences, 1994, 716, c.90-103 - Обеспечиваемый аденовирусами перенос генов in Vivo).

Известно успешное применение вещества на основе рекомбинантного аденовируса, экспрессирующего лактоферрин человека в опыте на мышах с раком молочной железы. После введения вещества в ткани опухоли наблюдалось замедление ее роста вследствие апоптоза клеток (Inhibition of tumor growth by recombinant adenovirus containing human lactoferrin through inducing tumor cell apoptosis in mice bearing EMT6 breast cancer, Wang J., Li Q., Ou Y., Han Z., Li K., Wang P., Zhou S., Arch Pharm Res, 2011, Vol 34, No 6, c.987-995 - Ингибирование роста опухоли с помощью аденовируса, содержащего ген человеческого лактоферрина путем индукции апоптоза опухолевых клеток у мышей с раком груди ЕМТ6).

Однако данный препарат не обеспечивает антиоксидантного, антимикробного действия лактоферрина, т.к. при описанном способе терапии обеспечивается только его противоопухолевое действие.

Известно, что аденовирус может эффективно экспрессировать лактоферрин человека вокруг опухолевых клеток, показывая стабильное торможение роста раковых опухолей шейки матки, усиление иммунитета организма и не имеет никаких токсических побочных эффектов (Заявка на выдачу патента №200910021705, 19.08.2009, Li Q., Li J., Han Z., Wu G., Hu J., Recombinant adenovirus carrying human lactoferrin, preparation and uses thereof, Китай).

Данный препарат также обладает узким противоопухолевым действием, так как указанный способ его применения вокруг опухолевых клеток не обеспечивает широкого антиоксидантного антимикробного и антитоксического действия лактоферрина.

Наиболее близкой фармацевтической композицией того же назначения к заявляемому изобретению по совокупности признаков является антибактериальный, антиоксидантный, детоксицирующий, иммуномодулирующий и антиканцерогенный препарат, который в качестве активного вещества содержит лактоферрин человека, выделенный из женского молока (Патент РФ №2165769, принят за прототип. Известный препарат выполнен в виде лиофилизата, содержащего от 10 до 90% лактоферрина человека. Препарат применяют для профилактики и/или лечения инфекционных, воспалительных заболеваний и токсических состояний различной этиологии.

К причинам, затрудняющим достижение стойкого терапевтического эффекта при использовании указанного препарата является необходимость многократных инфузий препарата из-за быстрого выведения лактоферрина из организма больного и, соответственно, большие затраты препарата, медицинского инструментария и времени медицинского персонала для достижения требуемого результата лечения.

Уникальность и дефицитность сырья - женского молока серьезно ограничивает масштабирование производства препарата и, соответственно, возможность его применения в требуемых количествах при медицинских показаниях.

Задачей данного изобретения является создание фармацевтической композиции, продуцирующей антиоксидантный, антимикробный, антитоксический белок - лактоферрин человека, обеспечивающей достижение стойкого терапевтического эффекта при однократных введениях этой композиции, сокращение затрат препарата, медицинского инструментария и времени медицинского персонала для достижения требуемого результата лечения, способа ее получения и способа терапии посредством воздействия этой фармацевтической композицией на организм человека.

Поставленная задача решается за счет того, что, фармацевтическая композиция, в которой лечебный эффект получают в результате воздействия антиоксидантного, антимикробного, антитоксического белка лактоферрина человека, на организм человека содержит нереплицирующиеся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа со вставкой гена лактоферрина человека, экспрессирующие лактоферрин человека в терапевтически эффективном количестве в организме, при этом она содержит содержащая формулирующий буфер. Содержание нереплицирующихся наночастиц составляет не менее 2,33×10¹¹ физических частиц на мл формулирующего буфера. Способ получения фармацевтической композиции, содержащей нереплицирующиеся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа со вставкой экспрессирующей кассеты, включающей промотор, ген лактоферрина человека и сигнал полиаденилирования, заключается в том, что заданную активность получают путем засева пермиссивной клеточной культуры 293 нереплицирующимися наночастицами с геном лактоферрина человека и наращивания нереплицирующихся наночастиц в клетках до нужного содержания, после проводят многостадийную очистку путем центрифугирования, четырехкратного перемораживания-оттаивания в буферном растворе полученной на предыдущей стадии твердой части, дополнительно обрабатывают нуклеазой с дальнейшим отделением нереплицирующейся наночастицы с геном лактоферрина человека от разрушенных клеток центрифугированием и последующим отбором полученного супернатанта, при этом дальнейшую очистку проводят ультрафильтрацией, для чего полученный супернатант разводят буфером и перемешивают, затем полученный раствор фильтруют под давлением, и проводят очистку путем анионно-обменной хроматографии и далее экслюзионной хроматографии, к полученному элюату добавляют этанол и этилендиаминтетрауксусную кислоту, после чего отправляют на нормальную фильтрацию, затем получают готовый препарат путем разбавления полученного на предыдущей стадии препарата формулирующим буфером до заданного содержания нереплицирующихся наночастиц. При этом конструирование нереплицирующихся наночастиц со вставкой гена лактоферрина человека осуществляют методом гомологичной рекомбинации в культуре клеток. Терапевтически эффективную дозу нереплицирующихся наночастиц берут на 3 мл конечного объема композиции. Форма выпуска препарата - 1 мл, 2 мл. и 3 мл. Способ терапии, заключается во введении человеку заявленной фармацевтической композиции, продуцирующей антиоксидантный, антимикробный, антитоксический белок - лактоферрин человека. Фармацевтическая композиция вводится человеку внутривенно. Фармацевтическая композиция может вводится человеку внутривенно капельно. Введение фармацевтической композиции проводят для лечения токсических состояний, обусловленных гнойно-воспалительными заболеваниями индуцированными различными микроорганизмами, физическими воздействиями и химическими агентами, в том числе средствами лекарственной и лучевой терапии. Терапевтически эффективная доза нереплицирующихся наночастиц со вставкой гена лактоферрина человека составляет от 7×10¹¹ физических частиц до 7×10¹³ физических частиц на человека. Введение фармацевтической композиции проводят последовательно в два этапа. При этом введение фармацевтической композиции на втором этапе проводят через сутки после первого введения. Введение фармацевтической композиции на первом этапе осуществляют в объеме, содержащем 1/3 полной терапевтической дозы фармацевтической композиции, а на втором этапе вводят оставшиеся 2/3 полной терапевтической дозы композиции. 1/3 полной дозы фармацевтической композиции растворяют в 66 мл физиологически приемлемого растворителя, а 2/3 полной дозы растворяют в 134 мл физиологически приемлемого растворителя. Физиологически приемлемым растворителем является раствор глюкозы. Раствор глюкозы является 5%, либо 10%.

Реализация изобретения.

Указанные единые технические, лечебные и экономические результаты при осуществлении изобретения по заявляемому изобретению достигаются за счет того, что заявляемый способ, так же как известный способ профилактики и/или лечения воспалительных, и/или инфекционных заболеваний, и/или токсических состояний осуществляют при помощи антиоксидантного белка лактоферрина. Особенность заявляемого способа заключается в том, что антиоксидантный белок продуцируется непосредственно в организме человека при введении нереплицирующихся наночастиц со вставкой гена антиоксидантного белка, а не вводятся многократно в виде выделенных из природного источника белков. Экспрессированный белоки оказывает лечебное действие в качестве антимикробного, и/или противовоспалительного, и/или иммуномодулирующего, и/или антиокидантного, и/или детоксицирующего, и/или антиканцерогенного агента.

Для осуществления лечебного процесса фармацевтическую композицию на основе нереплицирующихся наночастиц, продуцирующую антиоксидантный белок человека лактоферрин, вводят в следующих дозах:

- для лечения токсических состояний, обусловленных гнойно-воспалительными заболеваниями индуцированными различными микроорганизмами, физическими воздействиями и химическими агентами, в том числе средствами лекарственной и лучевой терапии, от 7×10¹¹ ф.ч. до 7×10¹³ ф.ч. на человека;

- для профилактики постинъекционных осложнений в начале терапии на первом этапе 1/3 полной терапевтической дозы нереплицирующихся наночастиц с геном лактоферрина человека;

- для профилактики постинъекционных осложнений в начале терапии на втором этапе вводят 2/3 полной терапевтической дозы нереплицирующихся наночастиц с геном лактоферрина человека;

Сущность изобретения заключается в следующем. Заявляемая фармацевтическая композиция содержит в качестве основного действующего компонента нереплицирующиеся наночастицы со вставкой гена, экспрессирующего антиоксидантный белок человека - лактоферрин. Этот белок проявляет в организме человека многогранные биологический свойства, которые обусловливают его антиоксидантное, детоксицирующее, иммуномодулирующее, антимикробное, противовоспалительное и антиканцерогенное действие. Основным существенным отличием заявляемой фармацевтической композиции от ранее известных фармацевтических композиций является то, что антиоксидантный белок длительное время продуцируется при однократном введении наноструктуры непосредственно в организме, а не вводится многократно в организм в виде выделенного из какого-либо источника белка. Фармацевтическая композиция совместима с любыми фармацевтически пригодными растворителями. Заявляемые пределы количества фармацевтической композиции, вводимой в организм больного, позволяют сохранять высокую терапевтически эффективную концентрацию целевого антиоксидантного белка в организме в течение длительного времени.

Фармацевтическая композиция является исходным продуктом для приготовления различных лекарственных форм, применение которых определяется в зависимости от заболевания. Заявляемая фармацевтическая композиция на основе нереплицирующихся наночастиц со вставкой гена, кодирующего антиоксидантные белки человека, прошла доклинические и клинические испытания по изучению специфической (терапевтической) эффективности и общетоксического действия, которые показали безвредность данной композиции и терапевтическую активность в качестве антиоксидантного, антибактериального и детоксицирующего вещества, что иллюстрируется приведенными ниже примерами.

Для создания фармацевтичекой композиции, содержащей в своем составе нереплицирующиеся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа и пролонгированно экспрессирующей лактоферрин человека в организме человека в терапевтических количествах необходимо:

1) сконструировать нереплицирующиеся наночастицы со вставкой гена лактоферрина;

2) разработать способ получения фармацевтической композиции;

3) доказать соответствие экспрессирующегося нереплицирующимися наночастицами лактоферрина человека нативному лактоферрину человека;

4) определить путь введения, терапевтическую дозу и допустимые пределы доз;

5) доказать пролонгированность действия фармацевтической композиции;

6) разработать способ безопасного и терапевтически эффективного применения фармацевтической композиции.

Приведеные далее примеры, таблицы и рисунки раскрывают сущность изобретения и подтверждают эффективность решения по данному изобретению.

Пример 1.

1) Конструирование нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа со вставкой гена лактоферрина человека.

2) Получение фармацевтической композиции.

Конструирование нереплицирующейся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5 серотипа (размером 70-80 нм) со вставкой гена лактоферрина человека осуществляли методом гомологичной рекомбинации в клеточной культуре и проводили с использованием общеизвестных лабораторных методик (например, Сэмбрук Дж., Фрич Э., Маниатис Т. и др. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., Мир, 1984, с.205-224, 387-420). За основу была взята рекомбинантная плазмида pJM17 (W.J. McGrory, D.S. Bautista, F.L. Graham. A simple technique for the rescue of early regionl mutations into infectious human adenovirus type 5, Virology, V, 163, №2, 1988, с.614 - Простая техника для удаления раннего региона 1 в инфекционном аденовирусе человека 5 типа), с делециями в области Е1 аденовирусного генома. Искусственно синтезированный кДНК гена лактоферрина человека лигировали в общеизвестную шаттл-плазмиду pRcCMV (Invitrogen, San Diego, CA, №V75020). Далее для взаимной трансформации полученной плазмиды pRcCMV - Lf и плазмиды pJM17 ими трансфецировали клетки 293 (например, №300192, CLS, Germany) с помощью метода кальциево-фосфатной преципитации (Graham FL, van der Eb AJ, 1973-A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA". Virology, 52 (2) 456-67 - Новая техника метода заражения ДНК аденовируса человека 5 серотипа). В результате получили нереплицирующиеся наночастицы, содержащие экспрессирующую кассету с CMV-промотором, геном лактоферрина человека и сигналом полиаденилирования. Бляшки рекомбинантной частицы образовывались на культуре клеток через несколько дней после трансфекции, их отбирали пастеровской пипеткой, полученный материал размножали на клетках линии 293 до получения титра 3×10¹⁰ ф.ч. (физических частиц)/мл (10⁸ ЕД/мл).

Получение фармацевтической композиции.

Необходимое содержание нереплицирующихся наночастиц в композиции было определено в примерах 4 и 5 по антитоксическому эффекту и должно составлять не менее 2,33×10¹¹ ф.ч./мл (что соответствует активности не менее 6,7×10⁸ ЕД/мл). Объем препарата должен составлять 3 мл, что связано с удобством фасовки и применения. Получение данной композиции проходит в несколько этапов.

Полученную выше клеточную суспензию, содержащую нереплицирующиеся наночастицы в титре 3×10¹⁰ ф.ч./мл, использовали для дальнейшего наращивания титров нереплицирующихся наночастиц и приготовления готовой фармацевтической композиции с заданным содержанием не менее 2,33×10¹¹ ф.ч./мл (что соответствует активности не менее 6,7×10⁸ ЕД/мл).

Для наработки необходимых титров нереплицирующихся наночастиц волновой биореактор с 4500 мл суспензии пермиссивной клеточной культуры 293 засевали клеточной суспензией объемом 500 мл, содержащей нереплицирующиеся наночастицы с титром 3×10¹⁰ ф.ч./мл.

Культивировали для наращивания нереплицирующихся наночастиц внутри клеток и достижения их содержания 6×10¹⁰ ф.ч./мл (активность 2×10⁸ ЕД/мл), ориентировочно в течение 48 часов. По достижению необходимого содержания наночастиц клеточную массу подавали на очистку, которая состояла из нескольких стадий:

1) Проводили осаждение клеточной массы центрифугированием. Поступающая на очистку суспензия имела не менее 10¹⁴ ф.ч. на 5 л (оценивали при помощи масс-спектрометра, 1 ОЕ=10¹² ф.ч.). Центрифугирование проводили при режиме 6000 g в течение 15 мин, при этом жидкий надосадок сливали, а оставшуюся твердую часть, содержащую клетки и нереплицирующиеся наночастицы подавали на дальнейшие стадии очистки.

2) Извлечение нереплицирующихся наночастиц из клеточной культуры проводили путем разрушения клеток четырехкратным перемораживанием-оттаиванием. Готовили буферный раствор с pH 8.0: 5 mM ТрисHCl, 0.075 MNaCl, 1 mM MgCl₂) 5% сахароза, 1% полисорбат 80. Полученный в предыдущую стадию осадок ресуспендировали в 70 мл буфера (коэффициент содержания ×71).Объем раствора составлял 80 мл.

Замораживание проводили в течение 2 часов в жидком азоте, размораживали на водяной бане (при +37°C), не допуская перегрева.

3) Для облегчения дальнейшего удаления геномной клеточной ДНК проводили дополнительную обработку нуклеазой. Для этого добавляли бензоназу до концентрации в растворе 150 U/мл и ставили на мягкое перемешивание с помощью магнитной мешалки на 3 часа при комнатной температуре (21-23°C).

4) Отделение нереплицирующихся наночастиц от разрушенных клеток осуществляли центрифугированием при 9000 g 10 мин. Отбирали супернатант, содержащий нереплицирующиеся наночастицы.

5) Дальнейшую очистку проводили ультрафильтрацией. Для этого полученный супернатант разводили буфером (50 mM TrisHCl pH 7.5, 1М NaCl, 2 mM MgCl2, 5% сахароза, pH 7,5) до объема не менее 200 мл, перемешиваем с помощью магнитной мешалки. В процессе фильтрации объем циркулирующего раствора (ретентата) постоянно доводили до исходного (200 мл).

6) Далее очистку производили путем анион-обменной хроматографии.

Ретентат наносили на колонку (AxiChrom 70/300 объемом 400 мл), содержащую анионнообменный сорбент Q Sepharose virus licenced. Нереплицирующиеся наночастицы сорбируются на колонке, в то время как примеси не сорбируются, а вымываются буфером А. После удаления примесей нереплицирующиеся наночастицы десорбировали промывкой буфером Б. Условия хроматографирования: поток 193 мл/мин, буфер A (40 mM TrisHCl, 0,27 М NaCl, 2 mM MgCl₂, 5% Сахароза, 0,1% Полисорбат 80, pH 7.5), проводимость ~28-30 mS/cm; буфер Б (40 mM TrisHCl, 0.5М NaCl, 2 mM MgCl₂, 5% сахароза, 0.1% полисорбат 80, рН 7.5) проводимость ~50 mS/cm. Элюат в объеме 200 мл отправляли на следующую стадию.

7) Эксклюзионная хроматогафия

Поученный в предыдущей стадии элюат наносили на колонку (AxiChrom 100/300 объемом 800 мл), содержащую сорбент Q Sepharose 4 FastFlow. Высокомолекулярные вещества, не входящие в поры сорбента, элюировали первым пиком (к ним относятся нереплицирующиеся наночастицы), примеси элюировали после выхода пика нереплицирующихся наночастиц. Условия хроматографирования: поток 130 мл/мин, буфер (10 mM TrisHCl, 75 мМ NaCl, 1m MMgCl₂, 5% сахароза, 0,05% полисорбат 80, pH 8.0).

К полученномуй элюату (80 мл) добавляли этанол до концентрации 0,5% и этилендиаминтетрауксусную кислоту (ЭДТА) до концентрации 100 мкМ, отправляли на следующую стадию.

8) Нормальная фильтрация.

Для стерилизации полученного препарата проводили фильтрование через систему фильтров с размером пор 22 мкМ. Конечный объем препарата на данной стадии составлял 80 мл и содержал нереплицирующиеся наночастицы в титре 1×10¹² ф.ч./мл. Его разбавляли формулирующим буфером (например, 10 mM TrisHCl, 75 mM NaCl, 1 mM MgCl₂, 5% сахароза, 0,05% полисорбат 80, 0,5% Этанол, 100 мкм ЭДТА, pH 8.0) до получения заданного содержания 2,33×10¹¹ ф.ч./мл и стерилизовали нормальной фильтрацией.

Таким образом, вышеописанный способ получения фармацевтической композиции позволяет на основе сконструированной нереплицирующейся наночастицы со вставкой гена лактоферрина человека получить в препарате содержание нереплицирующихся наночастиц не менее 2,33×10¹¹ ф.ч. на мл формулирующего буфера (что соответствует активности фармацевтической композиции не менее 6,7×10⁸ ЕД/мл), а полная терапевтическая доза для человека (7×10¹¹ ф.ч.) содержится в 3 мл фармацевтической композиции, что соответствует поставленной задаче.

Пример 2.

Сравнение нативного лактоферрина человека и лактоферрина человека, экспрессируемого нереплицирующимися нанаочастицами по физико-химическим свойствам и биологической активности.

Нереплицирующиеся наночастицы на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа экспрессируют лактоферрин, называемый рекомбинантным, его соответствие нативному лактоферрину определяли по физико-химическим свойствам и биологической (антиоксидантной) активности. Для этого рекомбинантный лактоферрин человека выделяли из пермиссивной культуры клеток 293 линии, трансдуцированных нереплицирующимися наночастицами со вставкой гена, кодирующего лактоферрин человека. Очистку рекомбинантного лактоферрина человека из культуральной жидкости проводили стандартным методом аффинной хроматографии на матрице активированной CNBr сефарозы 4B, ковалентно связанной с высокоочищенными антителами к лактоферрину человека. Физико-химические свойства анализировали общеизвестными методами электорфореза, иммуноблоттинга, а биологическую (антиоксидантную) активность - известным методом ингибирования перекисного окисления липидов (ПОЛ) в гомогенате печени мышей. Нативный лактоферрин получали из донорского женского молока (Патент РФ №2165769, 13.07.2000).

1) Данные электрофоретического анализа показали, что рекомбинантный лактоферрин человека содержит белок, молекулярная масса которого составляет 76 кДа, что соответствует молекулярной массе лактоферрина человека, выделенного из донорского женского молока.

2) Методом иммуноблоттинга выявили, что рекомбинантный белок специфически взаимодействует с поликлональными антителами против лактоферрина человека (Sigma, кат. №L3262).

3) Антиоксидантная активность рекомбинантного лактоферрина человека - 1,3×10^-6 моль/мл сравнима с активностью лактоферрина из женского молока - 1,4×10^-6 моль/мл.

Таким образом, установлено соответствие рекомбинантного лактоферрина, экспрессированного нереплицирующимися наночастицами на основе генома аденовируса человека 5 серотипа и нативного лактоферрина из женского донорского молока по физико-химическим свойствам и антиоксидантной активности.

Пример 3.

Сравнение антимикробной активности.

Соответствие антимикробной активности рекомбинантного лактоферрина в сравнении с нативным лактоферрином, выделенным из женского молока, оценивали в отношении эталонных штаммов и клинических изолятов микрометодом в бульоне с использованием методических указаний по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам (Методические указания МУК 4.2.1890-04 "Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам", утв. Главным государственным санитарным врачом РФ 4 марта 2004 г.).

Представленные в таблице 1 данные показывают в большинстве случаев одинаковые или меньшие по рекомбинантному лактоферрину (что означает даже лучшую антимикробную активность у него по сравнению с нативным лактоферрином) значения минимальных концентраций рекомбинантного лактоферрина человека и нативного лактоферрина человека, подавляющих рост стандартных тест-микробов.

Таким образом, было установлено, что рекомбинантный лактоферрин, экспрессируемый нереплицирующимися наночастицами на основе генома аденовируса человека 5-го серотипа со вставкой гена лактоферрина человека и нативный лактоферрин, выделенный из женского молока,обладают сходной антимикробной активностью.

Пример 4.

Оценка детоксицирующего действия с определением минимальной эффективной дозы.

Детоксицирующее действие фармацевтической композиции оценивали in vivo с использованием лабораторных животных на модели токсикоза, индуцированного цитостатическим препаратом цисплатин, широко используемым в схемах полихимиотерапии больных со злокачественными процессами.

Противоопухолевое действие цисплатина реализуется за счет образования свободно радикальных продуктов, которые нарушают синтез ДНК путем внутри- и межнитевых сшивок ДНК, а также индуцируют перекисное окисление липидов (ПОЛ) клеточных мембран почек, печени, легких и других органов. Это, в конечном итоге, приводит к нарушению функций различных органов и обширному комплексу токсических реакций, интенсивность которых возрастает с увеличением дозы цисплатина.

Для оценки влияния фармацевтической композиции на токсические реакции вызванные цисплатином, его однократно вводили в дозе 16 мг/кг, что приводило к 50±6%-ой гибели животных контрольной группы от острых токсических реакций (рис.1). Гибель животных начиналась с 4-х суток после воздействия и продолжалась в течение 5-ти дней. Токсические явления выражались в повышении активности ферментов - ACT и АЛТ, повышении уровня креатинина на 7-е и мочевины на 3-й и 7-е сутки наблюдения (табл.2).

В качестве детоксицирующего агента животным опытных групп за 72 часов до введения цисплатина внутривенно вводили нереплицирующиеся наночастицы со вставкой гена лактоферрина человека в дозах 1,4×10¹¹, 4,3×10¹¹, 4,3×10¹² ф.ч./м², а животным группы сравнения трехкратно вводилинативный лактоферрин человека из донорского женского в разовой дозе 10 мг/кг (курсовая доза 30 мг/кг), первое введение - через 24 часа после инфузии цисплатина.

На рисунке 1 представлены данные, где:

1 - гибель животных контрольной группы, цисплатин вводили однократно внутривенно в дозе 16 мг/кг;

2 - гибель животных опытной группы, которым вводили фармацевтичекую композицию однократно внутривенно в дозе 1,4×10¹¹ ф.ч./м² за 72 ч до введения цисплатина;

3 - гибель животных опытной группы, которым вводили фармацевтичекую композицию однократно внутривенно в дозе 4,3×10¹¹ ф.ч./м² за 72 ч до введения цисплатина;

4 - гибель животных опытной группы, которым вводили фармацевтичекую композицию однократно внутривенно в дозе 4,3×10¹² ф.ч./м² за 72 ч до введения цисплатина;

5 - группа сравнения, животным которой вводили нативный лактоферрин человека из донорского женского молока через 24 ч после введения цисплатина в разовой дозе 10 мг/кг в течение последующих 3-х дней (курсовая доза 30 мг/кг).

Таким образом, в период реализации токсического действия цисплатина в опытных группах животных наблюдали максимальную продукцию рекомбинантного лактоферрина человека, сохранявшуюся в течение 10-ти дней, что приводило к снижению гибели животных до 13±6% при введении нереплицирующихся наночастиц со вставкой гена лактоферрина человека в дозах 1,4×10¹¹, 4,3×10¹¹ и 4,3×10¹² ф.ч./м². В группе сравнения, где животные получали трехкратно нативный лактоферрин человека, летальность составила 19±6%.

Полученные результаты означают наличие детоксицирующего эффекта против токсического действия цисплатина у фармацевтической композиции, продуцирующей рекомбинантный лактферрин и нативного лактоферрина из женского донорского молока.

Результаты биохимических исследований подтвердили снижение интенсивности токсических реакций цисплатина при введении фармацевтической композиции в дозах 4,3×10¹¹ ф.ч./м² и 4,3×10¹² ф.ч./м².

Таблица 2
Воздействие	Биохимические показатели крови животных
4 день	7 день	10 день
ACT, МЕ/л
Цисплатин	201±15	289±15	266±21
Фармацевтическая композиция (4,3×1011) + цисплатин	174±10	167±17	140±10
Фармацевтическая композиция (4,3×1012) + цисплатин	178±8	187±23	123±12
цисплатин + нативный лактоферрин человека	171±13	156±17	156±10
Физ. раствор	123±25
АЛТ, МЕ/л
Цисплатин	79±10	125±8	61±3
Фармацевтическая композиция (4,3×1011) + цисплатин	56±14	68±13	64±9
Фармацевтическая композиция (4,3×1012) + цисплатин	61±1	69±9	60±10
цисплатин + нативный лактоферрин человека	45±8	75±15	51±8
Физ. раствор	48±12
Креатинин, мкмоль/л
Цисплатин	65±12	97±10	124±21
Фармацевтическая композиция (4,3×1011) + цисплатин	51±11	54±13	59±13
Фармацевтическая композиция (4,3×1012) + цисплатин	46±9	67±16	66±11
цисплатин + нативный лактоферрин человека	46±5	57±15	56±6
Физ. раствор	35±9
Мочевина, ммоль/л
Цисплатин	10,5±0,9	11,0±1,1	6,1±0,9
Фармацевтическая композиция (4,3×1011) + цисплатин	5,4±1,8	5,9±1,2	4,8±0,5
Фармацевтическая композиция (4,3×1012) + цисплатин	6,0±0,8	5,4±0,9	6,2±1,5
цисплатин + нативный лактоферрин человека	5,4±0,3	6,0±0,5	5,2±0,5
Физ. раствор	4,7±1,0

Так, в таблице 2 представлены данные, которые показывают что практически все биохимические показатели крови животных в группах с введением цисплатина на фоне воздействия фармацевтической композиции и нативного белка соответствовали среднестатистическим нормальным значениям на все сроки наблюдения. Показатели функционального состояния печени - ACT и АЛТ не повышались в этих группах столь значительно, как в контрольных, а показатели, отражающие функциональное состояние почек - креатинин и мочевина - сохраняли близкие нормальным значения в отличие от достоверно повышенных значений в контрольных группах, т.е. рекомбинантный лактоферрин человека, как и нативный, выделенный из женского молока, способствует снижению нефро- и гепатотоксичности, вызываемых цитостатиком.

Таким образом, рекомбинантный лактоферрин человека обладает детоксицирующим действием в отношении токсичности цисплатина, что свидетельствует о его функциональной активности, подобной нативному белку.

Оценка детоксицирующего действия фармацевтической композиции на моделях химически индуцированного токсикоза позволила определить минимальную терапевтически эффективную дозу, равную 4,3×10¹¹ ф.ч./м² (токсическая доза (ТД) выражена в количестве нереплицирующихся наночастиц на м² поверхности тела животного, дозы лекарственных средств, рассчитанные на площадь поверхности тела для различных видов животных и человека, являются эквивалентными. (Хабриев Р.У., Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2000 г., 98 стр.).

Пример 5

Определение пределов переносимых доз.

Значения пределов переносимых доз фармацевтической композиции определяли в экспериментах на мышах при однократном внутривенном введении («острая» токсичность) лабораторным животным в дозах: 4,3×10¹¹ ф.ч./м², 43,0×10¹¹ ф.ч./м², 215,0×10¹¹ ф.ч./м², 430,0×10¹¹ ф.ч./м² и 860,0×10¹¹ ф.ч./м².

При изучении «острой» токсичности, минимальная терапевтическая доза, рассчитанная на м², была увеличена в 10, 50, 100 и 200 раз. Превышение ТД в 10-200 раз достаточно для получения достоверной информации о токсикологической безопасности исследуемого фармакологического средства. Минимально-эффективная доза, равная 4,3×10¹¹ ф.ч./м² и путь введения были выбраны на основании результатов исследований, полученных в ходе изучения его фармакологической активности на животных с тяжелой экзогенной интоксикацией, вызванной введением в организм животных токсических и смертельных доз высокотоксичного противоопухолевого препарата (пример 4).

У подопытных животных после однократного внутривенного введения фармацевтической композиции в вышеуказанных дозах регистрировали клинические признаки возможной интоксикации, гибель от токсичности, сроки гибели, изменение массы тела. Взвешивание животных осуществляли до введения препарата (фон), а также на 3, 7, 10, 14, 21 и 30 сутки после введения препарата. На 30 сутки все выжившие животные были подвергнуты эвтаназии с последующей аутопсией. Проводили патологоанатомическое исследование всех трупов животных, включающее макроскопическую оценку состояния полостей организма, внутренних органов и тканей. Местнораздражающее действие препарата оценивали визуально при осмотре места инъекции. Контрольным животным вводили стабилизирующий буферный раствор (контрольное вещество №1) и изотонический (0,9%) раствор хлористого натрия (контрольное вещество №2).

Полученные данные, характеризующие токсичность фармацевтической при однократном внутривенном применении мышам, представлены в таблицах 3, 4, 5.

Таблица 3
№ группы	Исследуемое или контрольное вещество	Доза, ф.ч./м2	Общее количество животных	Гибель животных от токсичности
Всего погибло	%	Сроки гибели, сутки
Самцы
1	Фармацевтическая композиция	4,3×1011	6	0	0	-
2	Фармацевтическая композиция	43,0×1011	6	0	0	-
3	Фармацевтическая композиция	215,0×1011	6	0	0	-
4	Фармацевтическая композиция	430,0×1011	6	0	0	-
5	Фармацевтическая композиция	860,0×1011	6	2	33	2 и 9
6	Стабилизирующий буфер (контрольное вещество №1)	25 мл/кг	6	0	0	-
7	Стабилизирующий буфер (контрольное вещество №1)	50 мл/кг	6	0	0	-
8	0,9% раствор NaCl (контрольное вещество №2)	50 мл/кг	6	0	0	-
Самки
1	Фармацевтическая композиция	4,3×1011	6	0	0	-
2	Фармацевтическая композиция	43,0×1011	6	0	0	-
3	Фармацевтическая композиция	215,0×1011	6	0	0	-
4	Фармацевтическая композиция	430,0×1011	6	0	0	-
5	Фармацевтическая композиция	860,0×1011	6	1	17	13
6	Стабилизирующий буфер (контрольное вещество №1)	25 мл/кг	6	0	0	-
7	Стабилизирующий буфер (контрольное вещество №1)	50 мл/кг	6	0	0	-
8	0,9% раствор NaCl (контрольное вещество №2)	50 мл/кг	6	0	0	-

Представленные в таблице 3 результаты эксперимента показывают, что однократное внутривенное введение фармацевтической композиции мышам - сам