Способ тканевой инженерии спинного мозга после его анатомического разрыва

Способ тканевой инженерии спинного мозга после его анатомического разрыва

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к медицине, а именно к нейрохирургии и трансплантологии, клеточной технологии и биоинженерии, и может быть использовано для реконструкции спинного мозга после его анатомического разрыва.

Известны способы восстановления спинного мозга после осложненной спинальной травмы, заключающиеся в пересадке фетальных или взрослых шванновских клеток, способных продуцировать миелин в аксональной регенерации и ряд нейротрофических факторов (BDNF, NGF, реснитчатый фактор) [1-3]. Пересадка таких клеток крысам в спинной мозг при частичной его перерезке может сопровождаться значительным восстановлением функции ЦНС с демоне грацией не только обширной регенерации спинномозговых аксонов ростральное и каудальнее зоны повреждения, но и ограниченного спрутинга (вырастания) аксонов в каудальный конец трансплантата [5, 8]. Ген-модифицированные шванновские клетки при их трансплантации в разрыв спинного мозга в эксперименте способны производить активную ремиелинизацию аксонов, стимулировать их рост и продвижение через зону повреждения [8-11]. Трансплантация сингенным иммунодефицитным крысам человеческих шванновских клеток заметно активизирует аксональный рост и частично восстанавливает функцию конечностей [12]. При этом трансплантация таких клеток в дислокацию разрыва спинного мозга (СМ) у больных сопровождалась частичным восстановлением моторных функций спинного мозга и чувствительности по шкале ASIA [5-7]. Однако проблема указанного способа заключается в недостаточной эффективности использования дифференцированных клеток как по причине их низкой массы, так и по непродолжительной жизнеспособности, большой потери при трансляции с подложек, на которых их культивируют, в дислокацию травмы, поскольку технология предусматривает элюцию клеток с помощью ферментов, а это существенно усиливает процесс запрограммированной клеточной смерти. Трансплантация шванновских клеток опосредованно влияет на регенерацию спинного мозга путем выделения ряда нейротрофических факторов, не образуя новые нейроны и аксоны.

Известны способы трансплантации эмбриональных стволовых клеток при спинальной травме. Выделение эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) из бластоцисты мыши [13] и трансплантация эмбриональной ткани на модели спинальной травмы [14| показапи возможность ее использования в качестве временного межуточного матрикса для регенерации в ней центральных аксонов. Растущие аксоны регенерировали в эмбриональный трансплантат с формированием связей. Применение трансплантации ЭСК на модели спинальной травмы покачало способность этих клеток встраиваться в поврежденные участки спинного мозга, дифференцироваться согласно молекулярному и клеточному микроокружению, быть длительно жизнеспособными [15-17]. При этом образующиеся из ЭСК олигодендроциты у половозрелых крыс подвергаются миелинизации в области аксонов [18]. Аксональный рост может сопровождаться прорастанием через глиальный рубец в области хирургического пересечения спинного мозга [19]. Ожидаемые морфологические изменения в спинном мозге сопровождаются частичным снижением нейродефицита.

Ряд исследователей с целью реконструкции СМ применяет фетальные ткани, например, суспензию клеток эмбриона до 12 недель гестации и указывает на эффективность восстановления функций СМ [4, 20, 21]. В одних экспериментах такая трансплантация не сопровождается существенным прорастанием аксонов сквозь пересаженную ткань в сторону каудальной части СМ [22-24], в других случаях регистрировался значительный спрутиш аксонов [25].

Одним из важных источников нейрональных клеток в постнатальном онтогенезе могут служить мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки (ММСК), которые участвуют в поддержании пролиферации прогениторных клеток. Показано, что ММСК могут спонтанно экспрессировать нейрональные маркеры [26]. Широкое использование морфогенных факторов дифференцировки, вызывающих деметилирование ДНК, а также стимуляцию факторов роста (EGF, BDNF) позволяет перепрограммировать геном клетки и добиться дифференцировки ММСК костного мозга в нейроны и глию с формированием аксонального роста и зрелых нейронов. При этом прямая трансплантация такой клеточной массы существенно влияет на снижение неврологического дефицита у экспериментальных животных, в большей степени касающегося сенсорной функции СМ [27-29]. Однако проблема состоит в том, что прямое использование ЭСК или их недифференцированных дериватов приводит к образованию тератом. Метод предусматривает перенос клеток без трехмерной подложки в дислокацию травмы, а это существенно увеличивает степень запрограммированной клеточной гибели, не создает условий адресного переноса ростовых факторов, не предусматривает их введение в готовом виде. Кроме того, трансплантация не сопровождается введением предшественников нейрональных клеток, а предусматривает введение недифференцированных клеток. Эмбриональные стволовые клетки мультипотентны или нолипотентны и могут дифференцироваться в любом направлении, не только в нейрональном.

Существует метод пересадки эмбриональной клеточной массы головного или спинного мозга от крыс в разрыв спинного мозга новорожденным или взрослым крысам, что приводит в ранние сроки после травмы (до 7 суток) к приживлению и спрутингу пересаженных нейронов, трансляции клеток нейроглии в каудальном направлении за пределы зоны повреждения [30-33]. В зоне травмы спинного мозга трансплантированная ткань активно интегрирует с тканью реципиента [34]. Это подтверждается на модели полной перерезки спинного мозга у новорожденной крысы. Трансплантация эмбриональных клеток в зону перерезки СМ улучшает его функциональные характеристики по сравнению с контролем [35]. Однако при таких пересадках частые неудовлетворительные результаты можно рассматривать как реализацию иммунологического конфликта по причине нарушения гематоэнцефалического барьера при травме спинного мозга [36]. Пересадка эмбриональной клеточной массы без трехмерной подложки приводит к слабой защите пересаженных клеток от реакций хозяина и не создает условий для жизнедеятельности и пролиферации. Кроме того, ткани донора при пересадке могут нести опасность контаминации, также как и применение при предварительном культивировании клеток продуктов животного происхождения, например сывороток крови.

Наиболее близким техническим решением является метод использования обкладочных клеток слизистой оболочки обонятельного тракта, источником которых служит обонятельная область верхнего носового хода полости носа. Обкладочные клетки поддерживают рост аксонов от обонятельной луковицы [37]. Их наличие в периферической и центральной нервной системе [38], постоянное обновление и спрутинг аксонов в сторону центральной нервной системы (ЦНС) с экспрессией нестина и нейрональных маркеров глии и нейронов в течение пре- и постнатального периода позволяют экспериментаторам проводить с их помощью реконструктивную биоинженерию СМ [39, 40]. Эти клетки мультипотентны и способны дифференцироваться в зависимости от созданного микроокружения [41]. Важными находками следует считать способность этих клеток к дифференцировкс в нейроны и олигодендроциты. прорастанию аксонов в соседние зоны межуточной ткани и ремиелинизации в условиях in vitro [42]. Также как и шванновские клетки, обкладочные клетки миелинизируют аксоны в культуре in vitro [43]. Трехмерную матрицу в качестве трансплантата, содержащего ольфакторные нейрональные клетки (ОНК), ряд авторов помещал в зону одностороннего повреждения пирамидного тракта у взрослых крыс. Результаты указывали на дифференцировку клеточной массы в шванновские клетки и их активизацию взаимодействия с нейрофибробластами. Как известно, такая межклеточная связь провоцирует процесс миелинизации аксонов, появление новых аксонов, их рост и спрутинг в дистальную культю СМ [44-47]. При этом морфологический инжиниринг СМ сопровождается сокращением неврологического дефицита, несмотря на использование модели полного пересечения СМ [48]. Совершенно очевидно, что процесс инжиниринга поддерживается комплексом молекулярного микроокружения, создаваемого клетками СМ. в основе которого лежит взаимодействие нейротрофических факторов [49]. Однако используемая трехмерная матрица представляла собой либо животный коллаген, например, 1 типа, либо коллаген в комплексе с хондроитинсульфатом. Кроме того, очень частые отрицательные результаты такой трансплантации (слабое устранение неврологического дифицита, особенно функции моторных нейронов) обусловлены отсутствием в трансплантате системы адресного переноса нейротрофических факторов, выделяемых пересаженными клетками. Кроме того, предлагаемый способ реконструкции СМ не предусматривает наличие в трансплантате экзогенных нейротрофических факторов, полученных от культивирования эмбриональной нейрональной клеточной массы, а также одновременного присутствия специальных нейрональных добавок, таких как ретиноевая кислота и фактор N2 (neuronal supplement).

В России, в клинике «Нейровита», проведены около двух десятков оперативных трансплантаций аутологичных ольфакторных нейрональных клеток (ОНК) на основе биодеградируемого геля «Сферогель». Использовалась и собственно клеточная масса, и комбинация аутологичных ОНК с аутологичными гемопоэтическими стволовыми клетками костного мозга. Результаты указывают на 50% частичное регрессирование неврологической симптоматики при наличии послеоперационных осложнений. Недостатками указанного способа является отсутствие в трансплантате условий переноса нейротрофических факторов, выделяемых пересаженными клетками, а также условий для дифференцировки стволовых клеток в нейрональном направлении и их пролиферации в зоне трансплантации.

Задачей предлагаемого способа является полноценное восстановление морфологической и функциональной целостности спинного мозга после его частичного или полного анатомического разрыва при осложненной позвоночно-спинальной травме. Поставленную задачу решают за счет того, что в диастаз спинного мозга имплантируют предшественники нейрональных клеток, полученные из эмбриональных стволовых клеток мыши в составе коллаген-хитозановой трехмерной матрицы, при этом трехмерная матрица содержит кондиционированную комбинированную бесклеточную питательную среду с нейротрофическими факторами, состоящую из двух смешанных сред, полученных от культивирования клеток мозговой ткани эмбриона крысы и от культивирования эмбриональных стволовых клеток мыши, содержащую животные и неживотные компоненты, или только кондиционированную среду, полученную от культивирования эмбриональных стволовых клеток мыши, не содержащую животные компоненты, например, нейрональную добавку N2 или B27, ретиноевую кислоту, синтетическую питательную среду, например DMFM/F12, а также коллаген-хитозановая матрица содержит комплекс полисахаридов с нано-микроструктурированными компонентами, включающая аскорбат хитозана с молекулярной массой 695 kDa и степенью дезацетилирования 98% при содержании на 1 г сухого хитозана аскорбиновой кислоты 1,8 г, хондроитинсерной кислоты 20 мг, гиалуроновой кислоты 10 мг и гепарина 5 мг, а также их солевые производные, которая может использоваться в виде губки, пленки, микросфер, геля или волокон.

Способ осуществляют следующим образом: При получении клеточных матриц-трансплантатов предварительно перед посадкой на них эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) коллаген-хитозановую матрицу в виде губки или пленки или волокон нарезают объемом 1-1,5 мм³ и в стерильных условиях раскладывают по лункам 96-луночного планшета без покрытия их 0,1% раствором желатина. При этом губка, пленка или волокна представляют собой коллаген-хитозановую трехмерную матрицу, содержащую комплекс полисахаридов в виде нано-микроструктурированного аскорбата хитозана с молекулярной массой 695 kDa и степенью дезацетилирования 98%, при содержании на 1 г сухого хитозана аскорбиновой кислоты 1,8 г, солевой анионной формы хондроитинсерной кислоты 20 мг\г, гиалуроната натрия 10 мг\г и гепарина 5 мг\г, кондиционированную питательную среду с нейротрофическими факторами, полученными при культивировании клеток головного мозга 17-20 дневных фетусов беспородных крыс, полученных после диспергирования мозга и обработки 0,5% раствором коллагеназы в течение 30 минут в среде ДМЕМ при 37°C с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 100 мкг/мл канамицина сульфата, 1 мМ L-глутамина, в которую дополнительно /добавляют еще 4нг/мл основного фактора роста фибробластов (bFGF), 1 мМ раствора незаменимых аминокислот (Sigma-Aldrieh). При этом наращивание клеточной биомассы для получения кондиционированной среды проводят при 37°C во флаконах, покрытых 0,1% раствором желатина. Кондиционированную среду собирают ежедневно. Одновременно с целью получения второй кондиционированной среды осуществляют пересев эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши с помощью 0,5% раствора коллагеназы в синтетической среде DMEM/F12 в культуральные флаконы, клетки культивируют с добавлением агента нейрональной дифференцировки - N2 компонента (или компонента В27) и ретиноевой кислоты согласно инструкции производителя. Среду также собирают, фильтруют через 0,22 мкм ацетат-целлюлозный фильтр и в дальнейшем используют совместно с первой кондиционированной средой в качестве комбинированной кондиционированной среды или самостоятельно.

Для получения предшественников нейрональных клеток с целью их трансплантации стволовые клетки с культуральных флаконов снимают 0.5% раствором коллагеназы, трижды отмывают чистой средой от фермента и переносят в лунки с нарезанной матрицей в среде для ЭСК. Клетки культивируют не менее 3-х суток до появления нейрональных маркеров в гумидных условиях при 37°C и атмосфере с 6% содержанием CO₂.Количество прикрепленных клеток оценивают путем диспергирования 5-6 кусочков матрицы в растворе фермента с последующим подсчетом клеток в камере Горяева. Каждый будущий нейроимплантат в процессе культивирования содержал порядка 50 тыс. эмбриональных стволовых клеток мыши. Использование в результате смешивания комбинированной кондиционированной среды от эмбриональных стволовых клеток мышей, находящихся в присутствии факторов нейрональной дифференцировки - компонента N2 и ретиноевой кислоты и кондиционированной среды от культивируемых мозговых клеток эмбрионов крыс, или в присутствии только кондиционированной среды от ЭСК мышей, приводит к нейрональной дифференцировке ЭСК мыши. Анализ экспрессии одного из нейрональных маркеров - нейрофиламента показал, что на первые сутки культивирования отсутствуют сигналы флуоресценции по указанному маркеру. На 5-7е сутки при культивировании ЭСК в кондиционированной среде обнаруживается экспрессия нейрофиламента. Аналогичная картина наблюдалась и в случае определения маркеров глиального фибриллярного кислого протеина (GFAP) и нестина (рис.1-3). На рис.1а показаны эмбриональные стволовые клетки мыши при фазово-контрастной микроскопии, культивированные и пассированные на коллаген-хитозановых матрицах в присутствии кондиционированных сред и N2 компонента с формированием в 1-й день клеточных колоний, на рис.1б показано образование предшественников нейронов на 14-й день культивирования. На рис.2а показано отсутствие экспрессии маркера нейрофиламента на 1-е сутки в клетках, культивируемых на коллаген-хитозановом комплексе в присутствии кондиционированных сред и N2 компонента, и наличие такой экспрессии на 7-е сутки (рис.2б) и 14-е сутки (рис.2в) культивирования. На рис.3а при иммуноцитохимическом анализе показаны эмбриональные стволовые клетки мыши, культивированные в кондиционированной среде с добавлением N2 компонента и экспрессирующие маркер нестин. Клетки фиксированы 1% формальдегидом в фосфатном буфере и обработаны антителами против нестина с последующим мечением вторичными антителами и детекцией флуоресценции. На рис.3б показаны эмбриональные стволовые клетки мыши, экспрессирующие в цитоплазме GFAP, культивированные при тех же условиях и обработанные антителами против маркера астроцитов - глиального фибриллярного кислого белка (GFAP).

Перед имплантацией кусочки коллаген-хитозановой матрицы с помощью глазного пинцета осторожно переносят в микропробирки с питательной средой DMEM/F12 и транспортируют в операционную. После предварительной обработки операционного поля 70% раствором этилового спирта под наркозом производят разрез по средней линии спины крысы на уровне от грудного позвонка Th7 до поясничного позвонка L4 длиной 4-5 см. Гемостаз производят по ходу операции. После рассечения кожи, подкожно-жирового слоя края раны мобилизуют и разводят ранорасширителями Эдсона. Остисто-трапециевидную и широчайшую мышцы отсекают от мест их прикрепления к остистым отросткам Th9-L3. Мышцы глубокого слоя отсепаровывают от позвоночника тупым инструментом и разводят микрохирургическим ранорасширителем. оголяют дужки позвонков Th9-Th12. Производят резекцию дужки Th10. твердую мозговую оболочку рассекают и разводят в стороны в горизонтальной плоскости. При помощи микроскальпеля и микроножниц осуществляют пересечение ¹/₂ правой боковой порции спинного мозга в поперечном направлении. В образовавшийся дефект нервной ткани размерами около 2 мм³ помещают нейрональный клеточно-матричный имплантат в виде микропористой губки. По окончании трансплантации дефект кости позвонков закрывают полисахаридной гидрогелевой массой «Бол-хит», не содержащей животного коллагена. Рану ушивают послойно: на глубокий слой мышц накладывают П-образные швы шовным материалом Vicril 4-0; мышцы поверхностного слоя ушивают непрерывным обвивным швом нитью Vicril 4-0; на кожу накладывают П-образные швы нитью Polyester 3-0. Швы обрабатывают спиртовым раствором йода.

В течение 3-5 дней после операции в качестве анальгетика животные получают Sol. Tramadoli 2,5 мг 3 раза в день в/м. Кожные швы снимают на 10-е сутки. В ранний послеоперационный период, в первые 24 часа, - допуск животных к воде. Кормление - на 2-3-и сутки после операции исключительно лечебным питанием «Полипротен-нефро» в течение 4-х недель. Крыс содержат в раздельных клетках с двойным сетчатым дном для активного передвижения, соблюдения гигиены, самостоятельного приема воды и пищи. Лекарственную поддержку осуществляют антибиотиком широкого спектра действия, спазмолитиками, сосудорасширяющими препаратами, глюкокортикоидными гормонами. Для оценки неврологических нарушений и динамики восстановления применяют шкалу оценки выраженности неврологического дефицита (Neurological Severity Scores - NSS) [4] в течение 1-4 недель послеоперационного периода. В схему контроля входят:

1. Оценка моторной функции (подвешивание крысы за хвост с регистрацией сгибания передней и задней конечностей, отклонения головы более чем на 10 градусов от вертикальной оси в течение 30 сек. помещение крысы на пол с оценкой нормального движения по полу, неспособности сохранять направленное движение, движения по кругу в сторону паретичных конечностей, падения на паретичную сторону.

2. Тест «суживающаяся дорожка» заключался в прохождении крысой по дорожке длиной 165 см и шириной в начале пути - 9 см, в конце пути 3 см. Дорожку располагают на высоте 120-130 см над полом, что создает у крыс мотивацию для ее преодоления. Крысы с повреждением спинного мозга при продвижении вперед начинают оступаться (наступают тазовыми конечностями мимо дорожки). В зависимости от степени тяжести травмы спинного мозга в целом, и степени нарушения проприорецепции, в частности крысы могли безошибочно проходить по дорожке различное расстояние. Интактные крысы преодолевают дорожку полностью.

3. Оценка сенсорной функции (укладывание: зрительный и тактильный тесты; проприоцептивный тест (придавливание лапки к краю стола).

4. Оценка равновесия (сохранение равновесия и стабильное положение тела, захватывание балансира, крепкое сжатие балансира и отвисание одной паретичной конечности вдоль балансира, крепкое сжатие балансира и отвисание двух паретичных конечностей вдоль балансира, или кружение на балансире (более 60 сек), попытка сохранить равновесие на балансире (более 40 сек), но падение с него, попытка сохранить равновесие на балансире (более 40 сек), но падение с него, падение без попытки балансировать или ухватиться за балансир (менее 20 сек).

5. Отсутствие рефлексов или патологическая двигательная активность (рефлекс с ушной раковины при дотрагивании до слухового бугорка - тряска головой, роговичный рефлекс при дотрагивании до роговицы кусочком ваты - мигание, рефлекс испуга (двигательный ответ на короткий шум при щелкании зажима для бумаги), судороги, миоклонус, миодистония. Один балл соответствует невозможности выполнять задание или отсутствие тестируемого рефлекса; 13-18 баллов выраженное повреждение; 7-12 баллов - повреждение средней степени тяжести: 1-6 баллов - умеренное повреждение.

Результаты имплантации. Анализ неврологических нарушений после моделирования спинальной травмы и имплантации в диастаз спинного мозга трехмерных матриц показал положительную динамику сенсорного и моторного восстановления спинного мозга. После имплантации клеточной матрицы с ЭСК - предшественниками нейрональных клеток происходит существенное улучшение неврологических показателей, таких как моторная и сенсорная активность задних конечностей, отсутствие патологической двигательной активности, восстановление состояния равновесия, улучшение выполнения тестов на горизонтальной поверхности и передвижений по суживающей дорожке. Через 1 неделю после частичной транссекции спинного мозга интегральная сумма баллов составляет 8-9, что соответствует средней степени тяжести спинальной травмы. Животные в тесте «беговая суживающая дорожка» проходили за лимитное время в среднем 13 см. Через 2 недели после нанесения спинальной травмы интегральная сумма баллов при оценке неврологических функций экспериментального животного составляет 7-7,5, что указывает на снижение тяжести нарушений и приближение ее к границе умеренного повреждения. Через 3 недели после экспериментальной травмы спинного мозга интегральная сумма нарушений составляет 6,0-6,5 балла. Эта величина соответствуют умеренной силе повреждения. Динамика снижения тяжести неврологических нарушений сохраняется к 4 неделе послеоперационного периода и составляет 5-6 баллов. При этом в тесте «беговая суживающая дорожка» крысы наращивают каждую неделю расстояние пробега от 10 см через 1 неделю до 50 см через 4 недели.

Таким образом, исследования неврологического статуса у взрослых крыс после экспериментального частичного пересечения спинного мозга и прямой трансплантации коллаген-хитозановой губки, содержащей нейрональное микроокружение в виде комбинированной кондиционированной среды и предшественники нейрональных клеток мыши, подтверждает положительную неврологическую динамику в тестах Neurological Severity Scores - NSS в течение 1-4 недель после операции, восстанавливая сенсорную и двигательную функции спинного мозга.

Результаты детекции флюоресценции в образцах спинного мозга методом проточной цитометрии в сроки 1-4 недель показывают, что прямая трансплантация предшественников нейрональных клеток, полученных путем культивирования и создания нейронального микроокружения с помощью кондиционированных сред и нейрональной добавки N2 компонента сохраняет предшественники нейронов жизнеспособными, которые пролиферируют в течение 4-х недель. Относительное количество клеток, экспрессирующих фактор GFP, не изменяется на протяжении двух недель.

В имплантированной матрице с эмбриональными стволовыми клетками мыши (ЭСКм) с увеличением длительности срока имплантации отмечается более выраженное рассасывание ее волокон. К 28-м суткам большая часть стволовых клеток мигрирует на периферию матрицы. Анализ препаратов показывает, что клетки в матрицах не только выживают, а, заполняя всю ее структуру, мигрируют по направлению к материнской нервной ткани.

Более того, уменьшение количества волокон биополимера свидетельствует о высокой метаболической активности клеток в зоне репарации. Вокруг зоны травмы в обоих случаях (при наличии и отсутствии ЭСКм в матрице) выявляется большое количество макрофагов, цитоплазма которых заполнена фагоцитированным детритом. Количество этих клеток увеличивается в течение 7-14-и суток после травмы и имплантации и уменьшается в течение 21-28-и суток.

При имплантации матрицы с ЭСКм отмечается увеличение всех клеток макроглии (астроциты, олигодендроциты). При использовании матрицы без ЭСКм наблюдается увеличение клеток олигодендроглии и уменьшение клеток астроцитарной глии.

Количество нейронов в сером веществе спинного мозга при имплантации матрицы с ЭСКм сохраняется примерно на одном уровне, с небольшим пиком на 2-3 неделях. Кроме того, на 28-е сутки вокруг зоны имплантации матрицы с ЭСКм отмечается появление большого количества клеток-предшественников нейрональной популяции. При отсутствии в матрице ЭСКм количество нейронов с течением времени уменьшается. Таким образом, результаты исследований показывают признаки полноценного восстановления структуры поврежденного спинного мозга. Трансплантация клеток на матрице приводит к более полноценному и быстрому восстановлению гистологической целостности ткани после повреждения.

При иммуногистохимическом анализе фиксированных ЭСКм препаратов спинного мозга клетки предварительно обрабатывали антителами против нейрофиламента, с последующим мечением вторичными антителами и детекцией флуоресценции. Результаты анализа гистопрепаратов показывают, что введение в матрицу имплантата предшественников нейрональных клепок приводит к приживлению и миграции их в раневой зоне с последующей дифференцировкой в нейрональном направлении в течение 1-4 недель. У животных во все сроки наблюдения отмечается присутствие трансплантированных клеток, дифференцирующихся в клетки нейронального типа. При дифференцировке клеток в нейрональном направлении в продольном срезе спинного мозга имеется наличие в клеточных тяжах нейрофиламента, фермента енолазы. образование синапсов и GFP к глиальному белку. При выполнении анализа наличия енолазы в препаратах спинного мозга после обработки клеток антителами против енолазы и последующего мечения вторичными антителами с детекцией флуоресценции обнаруживается специфический белок нейрона. При обработке антителами против глиального кислого белка указанный белок также обнаруживается в клеточной массе трансплантированных клеток.

Обработка срезов спинного мозга растворами антител к олигодендроцитам обнаруживает в зоне прямой трансплантации клетки этого типа.

Таким образом, анализ морфологии спинного мозга крыс указывает, что способ имплантации матриц в спинной мозг и их состав обеспечивают стабильность губчатой конструкции в течение 4-х недель. В образцах СМ в зоне его повреждения на 3-й и 4-й неделе после трансплантации присутствуют клетки со стабильной экспрессией GFP, что подтверждает способность трансплантированных клеток к хоумингу в зоне повреждения и их жизнеспособность. Трансплантированные клетки экспрессируют маркеры олигодендроцитов, нестина, нейрональной енолазы и нейрофиламента, образуя межсинаптические связи. Трансплантация не сопровождается выраженной воспалительной реакцией. Предложенный способ тканевой инженерии СМ приводит к полноценному восстановлению морфологической и функциональной целостности спинного мозга после его частичного анатомического разрыва при осложненной позвоночно-спинальной травме.

Пример эксперимента 1. У четырех белых беспородных крыс-самок массой 250 г с использованием операционного микроскопа воспроизводили модель спинальной травмы на уровне IX-X грудных позвонков с 50% боковым пересечением спинного мозга после предварительно выполненной ламинэктомии. В дефект спинного мозга помещали коллаген-хитозановую трехмерную матрицу в виде губки, содержащую биомассу из 50 тысяч линии эмбриональных стволовых клеток мыши, комбинированную кондиционированную среду, полученную от культивирования мозговых клеток 17-20 дневных фетусов крысы и эмбриональных стволовых клеток мыши, содержащую полную питательную среду с добавлением нейронального фактора N2. Животные составили опытную группу №1.

В ходе операции проводили премедикацию: за 30 мин до операции - Sol. Tramadoli 2,5 мкг/мл; Sol. Atropini sulfatis 0,1% - 0,1 мкг/мл; Sol. Dimedroli 0,1% - 0,1 мкг/мл. Анестезия: наркоз парами диэтилового эфира. После предварительной обработки операционного поля 70% раствором этилового спирта под наркозом производили разрез по средней линии спины животного на уровне от грудного позвонка Th7 до поясничного позвонка L4 длиной 4-5 см. Гемостаз производили по ходу операции. После рассечения кожи, подкожно-жирового слоя края раны мобилизовали и разводили ранорасширителями Эдсона. Остисто-трапециевидную и широчайшую мышцы отсекали от мест их прикрепления к остистым отросткам позвонков Th9-L3. Мышцы глубокого слоя отсепаровывали от позвоночника тупым инструментом и разводили микрохирургическим ранорасширителем. скелетировали дужки грудных позвонков Th8-Th10. Производили резекцию дужки грудного позвонка Th9. твердую мозговую оболочку рассекали и разводили в стороны в горизонтальной плоскости. При помощи микроскальпеля и микроножниц осуществляли 50% боковое пересечение спинного мозга в поперечном направлении. При помощи микрохирургического зонда с оливой производили контроль пересечения путем проведения инструмента по передней стенке позвоночного канала. В образовавшийся диастаз нервной ткани размерами около 1,5 мм помещали нейрональный клеточно-матричный имплантат указанного состава. Костную рану закрывали полисахаридной гидрогелевой массой «Бол-хит», не содержащей животного коллагена. Рану ушивали послойно: на глубокий слой мышц накладывали П-образные швы шовным материалом Vicril 4-0; мышцы поверхностного слоя ушивали непрерывным обвивным швом нитью Vicril 4-0; на кожу накладывали П-образные швы нитью Polyester 3-0. Швы обрабатывали спиртовым раствором йода.

Послеоперационный уход. В течение 3-5 дней после операции в качестве анальгетика животные получали Sol. Tramadoli по 2,5 мг 3 раза в день в/м. Швы снимали на 10-е сутки. В ранний послеоперационный период, в первые 24 часа осуществляли допуск животных к воде. Кормление проводили на 2-3-и сутки после операции исключительно смесью лечебного питания «Полипротен-нефро» в течение 1-4 недель. Крыс содержали в раздельных клетках. Лекарственную поддержку осуществляли антибиотиком широкого спектра действия, спазмолитиками, сосудорасширяющими препаратами.

Динамический неврологический контроль. Для оценки неврологических нарушений и динамики восстановления применяли шкалу оценки выраженности неврологического дефицита (Neurological Severity Scores - NSS) в течение 1-4 недель послеоперационного периода.

Анализ морфологического материала. В указанные периоды времени после операции имплантации клеточной матрицы забирали морфологический материал для приготовления гистологических парафино-восковых срезов тканей спинного мозга. Для этого препараты спинного мозга получали путем тщательного и осторожного выделения ткани из позвоночного канала. Далее осуществляли классическую гистологическую проводку ткани на оборудовании фирмы Leica (Германия), часть поперечных серийных гистологических срезов спинного мозга окрашивали гематоксилин-эозином с целью обзорного анализа ткани в месте дислокации имплантата и в его непосредственном окружении. При обзорной микроскопии гистологических срезов оценивали степень глиальной реакции в зоне травмы, окружающей ткани, состояние нейронов серого вещества спинного мозга, состояние межу точного пространства белого и серого вещества спинного мозга в 5-ти полях зрения каждого среза. Подсчитывали количество клеток макроглии: астроциты, олигодендроциты; микроглии: макрофаги и количество клеток нейронального ряда.

Часть гистологических срезов подвергали иммуногистохимической обработке на предмет выявления состояния имплантированной клеточной массы: обнаружение трансплантированных клеток, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок GFP на флуоресцентном микроскопе «0lympus BX-51» с применением программных продуктов «AppliedSpectralImaging» (USA).

Результаты. Анализ неврологических нарушений после моделирования спинальной травмы и имплантации в диастаз спинного мозга трехмерных матриц показал положительную динамику сенсорного и моторного восстановления спинного мозга. После имплантации клеточной матрицы с предшественниками нейрональных клеток, полученных в результате дифференцировки ЭСК мыши, происходит существенное улучшение неврологических показателей, таких как моторная и сенсорная активность задних конечностей, отсутствие патологической двигательной активности, восстановление состояния равновесия, улучшение выполнения тестов на горизонтальной поверхности и передвижений по суживающей дорожке. Через 1 неделю после частичной транссекции спинного мозга интегральная сумма баллов составила 8.94. что соответствует средней степени тяжести спинальной травмы. Животные в тесте «беговая суживающая дорожка» проходили за лимитное время в среднем 13,8 см. Через 2 недели после нанесения спинальной травмы интегральная сумма баллов при оценке неврологических функций экспериментального животного составила 7,46, что указывает на снижение тяжести нарушений и приближение ее к границе умеренною повреждения. Через 3 недели после экспериментальной травмы спинного мозга интегральная сумма нарушений составила 6,12 балла. Эта величина соответствуют умеренной силе повреждения. Динамика снижения тяжести неврологических нарушений сохраняется к 4-й неделе послеоперационного периода и составляет 5,6 балла. При этом в тесте «беговая суживающая дорожка» крысы наращивают каждую неделю расстояние пробега от 13,8 см через 1 неделю до 47,5 см через 4 недели.

Таким образом, исследования неврологическою статуса у взрослых крыс после экспериментального частичного пересечения спинного мозга и прямой трансплантации коллаген-хитозановой губки. содержащей нейрональное микроокружение и предшественники нейрональных клеток мыши. подтверждает положительную неврологическую динамику в тестах Neurological Severity Scores - NSS в течение 1-4 недель после операции, восстанавливая сенсорную и двигательную функции спинного мозга.

Результаты детекции флуоресценции в образцах спинного мозга методом проточной цитометрии в сроки 1-4 недель показали, что прямая трансплантация предшественников нейрональных клеток, полученных путем культивирования и создания нейронального микроокружения с помощью кондиционированной среды и нейрональной добавки N2 компонента сохраняет предшественники нейронов жизнеспособными, которые пролиферируют в течение 4-х недель (рис.4). На рис.4 с помощью проточной цитофлуориметрии диспергатов спинного мозга и детекции зеленой флуоресценции (в красной-зеленой области) показано относительное количество клеток, экспрессирующих фактор GFP, которое не изменяется на протяжении двух недель и составляет около 34%: рис.4а - контроль (без клеток): рис.4б - 3-я неделя после имплантации матрицы с клетками; рис.4в - 4-я неделя после имплантации матрицы с клепками.

В имплантированной матрице с предшественниками нейрональных клеток мыши с увеличением длительности срока имплантации отмечалось более выраженное резорбирование ее волокон. К 28-м суткам большая часть предшественников нейрональных клеток мигрировала на периферию матрицы. Анализ препаратов показывает, что клетки в матрицах не только выживают, а, заполняя всю ее структуру, мигрируют по направлению к материнской нервной ткани (рис.5). На рис.5а показана гистограмма имплантированной коллаген-хитозановой матрицы в зоне спинальной травмы, не содержащей предшественников нейрональных клеток мыши. На рис.5б показана гистограмма имплантированной матрицы, содержащей бывшие эмбриональные стволовые клетки мыши - предшественники нейрональных клеток (окраска среза азур-эозином).

Более того, уменьшение количества волокон биополимера свидетельствует о высокой метаболической активности клеток