Новый лиганд рецептора цитокина zcytor17

Новый лиганд рецептора цитокина zcytor17

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Ссылка на родственные заявки

Настоящая заявка родственна предварительной заявке на патент США № 60/435315, поданной 19 декабря 2002 г., предварительной заявке на патент США № 60/375323, поданной 25 апреля 2002 г., и предварительной заявке на патент США № 60/350325, поданной 18 января 2002 г. На основании раздела 35 Кодекса законов США § 119(е)(1) данная заявка претендует на приоритет по указанным предварительным заявкам.

Предпосылки изобретения

Пролиферацию и дифференцировку клеток многоклеточных организмов контролируют гормоны и полипептидные факторы роста. Указанные диффузионные молекулы позволяют клеткам взаимодействовать друг с другом и кооперативно действовать в процессе образования клеток, тканей и органов и восстановления поврежденных тканей. Примеры гормонов и факторов роста включают в себя стероидные гормоны (например, эстроген, тестостерон), паращитовидный гормон, фолликулостимулирующий гормон, интерлейкины, тромбоцитарный фактор роста (PDGF), эпидермальный фактор роста (EGF), колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF), эритропоэтин (ЕРО) и кальцитонин.

Гормоны и факторы роста влияют на клеточный метаболизм в результате связывания с рецепторами. Рецепторы могут быть встроенными в мембрану белками, связанными с путями передачи сигналов в клетке, такими как системы вторичных мессенджеров. Рецепторы других классов являются растворимыми молекулами, такими как факторы транскрипции.

Цитокины обычно стимулируют пролиферацию или дифференцировку клеток гемопоэтической линии или участвуют в механизмах иммунной и воспалительной реакции организма. Примерами цитокинов, влияющих на гемопоэз, являются эритропоэтин (ЕРО), стимулирующий образование эритроцитов; тромбопоэтин (ТРО), стимулирующий образование клеток линии мегакариоцитов; и колониестимулирующий фактор гранулоцитов (G-CSF), стимулирующий образование нейтрофилов. Указанные цитокины способствуют восстановлению нормальных уровней кровяных клеток у пациентов, страдающих анемией, тромбоцитопенией и нейтропенией, или проходящих курс химиотерапии при лечении рака.

Интерлейкины образуют семейство цитокинов, опосредующих иммунологические реакции, включая воспалительные реакции. Интерлейкины опосредуют целый ряд воспалительных патологий. Центральное место в иммунной реакции занимают Т-клетки, которые продуцируют множество цитокинов и вызывают искусственный иммунитет против антигенов. Цитокины, продуцируемые Т-клетками, классифицированы как тип 1 и тип 2 (Kelso, A. Immun. Cell Biol. 76:300-317, 1998). Цитокины типа 1, включая IL-1, IFN-γ, LT-α, участвуют в воспалительных реакциях, вызывают противовирусный иммунитет, иммунитет к внутриклеточным паразитам и отторжение аллотрансплантата. Цитокины типа 2, включая IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 и IL-13, участвуют в гуморальных реакциях, вызывают иммунитет к гельминтам и аллергические реакции. Цитокины, занимающие промежуточное положение между типами 1 и 2, включают в себя IL-3, GM-CSF и TNF-α. Имеются данные, позволяющие предположить, что популяции Т-клеток, продуцирующих цитокины типа 1 и типа 2, мигрируют преимущественно в воспаленные ткани разных типов.

Зрелые Т-клетки могут быть активированы, например, антигеном или другим стимулом, в результате чего они начинают продуцировать цитокины, молекулы, осуществляющие биохимическую передачу сигналов, или рецепторы, которые далее влияют на судьбу популяции Т-клеток.

В-клетки могут быть активированы рецепторами на поверхности клеток, включая В-клеточный рецептор и другие вспомогательные молекулы, выполняющие вспомогательные функции клеток, такие как продуцирование цитокинов.

Моноциты/макрофаги и Т-клетки могут быть активированы рецепторами на поверхности клеток, при этом они играют главную роль в иммунной реакции, представляя антиген лимфоцитам, а также действуют в качестве вспомогательных клеток для лимфоцитов, секретируя множество цитокинов.

Естественные клетки-киллеры (NK) имеют общую клетку-предшественник с Т-клетками и В-клетками и играют определенную роль в иммунологическом надзоре. NK-клетки, которые составляют до 15% лимфоцитов крови, не экспрессируют рецепторы антигенов и поэтому не используют функцию распознавания МНС в качестве необходимого условия для связывания с клеткой-мишенью. NK-клетки участвуют в распознавании и уничтожении некоторых опухолевых клеток и вирусинфицированных клеток. Считается, что in vivo NK-клетки требуют активации, однако установлено, что in vitro NK-клетки уничтожают некоторые типы опухолевых клеток без активации.

Рассмотренные действия семейства цитокинов in vivo иллюстрируют большой клинический потенциал и потребность в других цитокинах, агонистах и антагонистах цитокинов. Настоящее изобретение позволяет удовлетворить такие потребности благодаря созданию нового цитокина, стимулирующего клетки гемопоэтической линии, получению композиций, содержащих указанный цитокин, и разработке способов его применения.

Настоящее изобретение относится к таким полипептидам, предназначенным для вышеуказанных и других применений, которые должны быть очевидны специалистам в данной области из приведенного ниже описания изобретения.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлены результаты сравнительного анализа zcytor17lig человека (SEQ ID NO:2) (zcytor17lig), zcytor17lig мыши (SEQ ID NO:11) (mzcytor17lig), IL-3 мыши (mIL-3) (SEQ ID NO:100) и IL-3 человека (hIL-3) (SEQ ID NO:102).

На фиг.2 представлены результаты сравнительного анализа zcytor17lig человека (SEQ ID NO:2) (zcytor17lig) и zcytor17lig мыши (SEQ ID NO:11) (mzcytor17lig).

На фиг.3 показан график гидрофильности Хоппа-Вудса zcytor17lig человека (SEQ ID NO:2).

Подробное описание изобретения

Подробному описанию изобретения предшествует определение следующих терминов, ознакомление с которыми может способствовать лучшему пониманию изобретения.

Термин «аффинная метка» использован в данном описании для обозначения полипептидного сегмента, который может быть присоединен ко второму полипептиду для очистки или обнаружения второго полипептида или создания сайтов для присоединения второго полипептида к субстрату. В частности, в качестве аффинной метки можно использовать любой пептид или белок, для которого существует антитело или другой специфический связывающий агент. Аффинные метки включают в себя белок А полигистидинового тракта (Nilsson et al., EMBO J. 4:1075, 1985; Nilsson et al., Methods Enzymol. 198:3, 1991), глутатион-S-трансферазу (Smith and Johnson, Gene, 67:31, 1988), аффинную метку Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985), вещество Р, пептид Flag™ (Hopp et al., Biotechnology 6:1204-10, 1988), связывающий стрептавидин пептид или другой эпитоп или связывающий домен. См., например, Ford et al., Protein Expression and Purification 2:95-107, 1991. ДНК-кодирующие аффинные метки можно приобрести у коммерческих поставщиков (например, Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ).

Термин «аллельный вариант» использован в данном описании для обозначения любой из двух или большего числа альтернативных форм гена, занимающих один и тот же хромосомный локус. Аллельная вариабельность возникает естественным путем в результате мутации и может вызывать фенотипический полиморфизм в популяциях клеток. Мутации гена могут быть молчащими (не вызывающими изменений в кодированном полипептиде) или могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин «аллельный вариант» использован в данном описании также для обозначения белка, кодированного аллельным вариантом гена.

Термины «аминоконцевой» и «карбоксиконцевой» использованы в данном описании для обозначения положений в полипептидах. В зависимости от контекста, указанные термины использованы применительно к определенной последовательности или части полипептида для обозначения пространственной близости или относительного положения. Например, расположение последовательности у карбоксильного конца контрольной последовательности в полипептиде означает, что данная последовательность находится рядом с карбоксильным концом указанной контрольной последовательности, но необязательно у карбоксильного конца всего полипептида.

Термин «пара комплемент/антикомплемент» означает неидентичные части, образующие нековалентно связанную, устойчивую пару в соответствующих условиях. Например, биотин и авидин (или стрептавидин) являются предполагаемыми членами пары комплемент/антикомплемент. Другие типичные пары комплемент/антикомплемент включают в себя пары рецептор/лиганд, антитело/антиген (или гаптен или эпитоп), смысловой/антисмысловой полинуклеотид и тому подобное. При желании дальнейшего расчленения пары комплемент/антикомплемент следует отметить, что пара комплемент/антикомплемент характеризуется сродством связывания <10⁹ M^-1.

Термин «комплементы молекулы полинуклеотида» означает молекулу полинуклеотида, содержащую комплементарную последовательность оснований и имеющую обратную ориентацию по сравнению с контрольной последовательностью. Например, последовательность 5' ATGCACGGG 3' комплементарна последовательности 5' CCCGTGCAT 3'.

Термин «смежная последовательность» означает полинуклеотид, который имеет участок идентичной или комплементарной последовательности, смежный с другим полинуклеотидом. Считается, что смежные последовательности «перекрывают» данный участок полинуклеотидной последовательности на протяжении всей длины или части указанного полинуклеотида. Например, типичными смежными последовательностями для полинуклеотидной последовательности 5'-ATGGCTTAGCTT-3' являются 5'-TAGCTTgagtct-3' и 3'-gtcgacTACCGA-5'.

Термин «вырожденная нуклеотидная последовательность» означает последовательность нуклеотидов, которая включает в себя один или несколько вырожденных кодонов (по сравнению с контрольной молекулой полинуклеотида, кодирующей полипептид). Вырожденные кодоны содержат разные триплеты нуклеотидов, но кодируют один и тот же аминокислотный остаток (то есть каждый триплет GAU и GAC кодирует Asp).

Термин «экспрессирующий вектор» служит для обозначения молекулы ДНК, линейной или кольцевой, которая содержит сегмент, кодирующий представляющий интерес полипептид, функционально связанный с дополнительными сегментами, предназначенными для его транскрипции. Такие дополнительные сегменты содержат промоторную и терминаторную последовательности и могут включать в себя один или несколько ориджинов репликации, один или несколько селектируемых маркеров, энхансер, сигнал полиаденилирования и т.д. Экспрессирующие векторы обычно выделяют из плазмидной или вирусной ДНК, либо они могут содержать элементы ДНК обоих типов.

Термин «выделенный» применительно к полинуклеотиду означает, что данный полинуклеотид был удален из естественной генетической среды и, следовательно, не содержит других периферических или нежелательных кодирующих последовательностей и имеет форму, пригодную для использования в генетически конструируемых системах продуцирования белка. Такие выделенные молекулы представляют собой молекулы, удаленные из естественного окружения, и включают в себя кДНК и геномные клоны. Выделенные молекулы ДНК согласно изобретению не содержат других генов, с которыми они обычно ассоциированы, но могут включать в себя естественные 5'- и 3'-концевые нетранслированные области, такие как промоторы и терминаторы. Идентификация ассоциированных областей должна быть очевидна специалисту в данной области (см., например, Dynan and Tijan, Nature 316:774-78, 1985).

«Выделенный» полипептид или белок является полипептидом или белком, который находится в условиях, отличных от естественного окружения, такого как кровь и ткани животного. В предпочтительной форме выделенный полипептид по существу не содержит других полипептидов, в частности, других полипептидов животного происхождения. Полипептиды предпочтительно должны быть получены в высоко очищенной форме, то есть со степенью чистоты более 95%, более предпочтительно со степенью чистоты более 99%. При использовании в данном контексте термин «выделенный» не исключает наличия такого же полипептида в альтернативных физических формах, таких как димеры либо гликозилированные или производные формы.

Термин «неопластический» применительно к клеткам означает клетки, подвергающиеся новой и аномальной пролиферации, в частности, в ткани, где такая пролиферация является неконтролируемой и прогрессирующей, приводя к возникновению новообразования. Неопластические клетки могут быть злокачественными, то есть инвазивными и метастатическими, или доброкачественными.

Термин «функционально связанный» применительно к сегментам ДНК означает такое расположение сегментов, при котором они кооперативно выполняют присущие им функции, например, транскрипция начинается в промоторе, продолжается в кодирующем сегменте и заканчивается в терминаторе.

Термин «ортолог» означает полипептид или белок, полученный из одного вида, который в функциональном отношении противоположен полипептиду или белку, полученному из другого вида. Различие последовательностей у ортологов является результатом видообразования.

«Паралоги» являются разными, но структурно родственными белками, продуцируемыми организмом. Считается, что паралоги образуются в результате дупликации гена. Например, α-глобин, β-глобин и миоглобин являются паралогами друг друга.

«Полинуклеотид» является одноцепочечным или двухцепочечным полимером дезоксирибонуклеотидных или рибонуклеотидных оснований, считываемых от 5'-конца к 3'-концу. Полинуклеотиды включают в себя РНК и ДНК и могут быть выделены из природных источников, синтезированы in vitro или получены из комбинации природных и синтетических молекул. Величина полинуклеотидов выражается в виде пар нуклеотидов (сокращенно «п.н.»), нуклеотидов («н.») или тысяч пар нуклеотидов («т.п.н.»). В зависимости от контекста два последних термина могут описывать одноцепочечные или двухцепочечные полинуклеотиды. Когда данный термин служит для определения двухцепочечных молекул, он используется для обозначения всей длины и является эквивалентным термину «пары оснований». Специалисту в данной области должно быть понятно, что две цепи в двухцепочечном полинуклеотиде могут иметь немного разную длину, и концы таких цепей могут быть неравномерными в результате ферментативного расщепления, таким образом, не все нуклеотиды в молекуле двухцепочечного полинуклеотида могут быть спарены.

«Полипептид» является полимером аминокислотных остатков, соединенных пептидными связями, которые могут быть продуцированы естественным или синтетическим путем. Полипептиды длиной менее примерно 10 аминокислотных остатков обычно определяются как «пептиды».

Термин «промотор» использован в данном описании в значении, принятом в данной области, и означает часть гена, содержащего последовательности ДНК, которые связывают РНК-полимеразу и инициируют транскрипцию. Промоторные последовательности обычно, но не всегда, находятся в 5'-концевых некодирующих областях генов.

«Белок» представляет собой макромолекулу, содержащую одну или несколько полипептидных цепей. Белок может также содержать непептидные компоненты, такие как углеводородные группы. Углеводороды и другие непептидные заместители могут быть введены в белок клеткой, в которой продуцирован данный белок, и могут изменяться в зависимости от типа клетки. Белки определяются в данном описании с учетом их аминокислотных скелетных структур; заместители, такие как углеводородные группы, обычно не указываются, но, тем не менее, могут присутствовать.

Термин «рецептор» означает ассоциированный с клеткой белок, который связывается с биоактивной молекулой (то есть лигандом) и опосредует действие данного лиганда на клетку. Мембраносвязанные рецепторы характеризуются мультипептидной структурой, включающей в себя внеклеточный лигандсвязывающий домен и внутриклеточный эффекторный домен, который обычно участвует в передаче сигналов. В результате связывания лиганда с рецептором происходит конформационное изменение рецептора, которое вызывает взаимодействие между эффекторным доменом и другой молекулой (молекулами) в клетке. Данное взаимодействие в свою очередь ведет к изменению метаболизма клетки. Метаболические изменения, связанные с взаимодействием рецептор-лиганд, включают в себя транскрипцию гена, фосфорилирование, дефосфорилирование, увеличение продукции циклического АМФ, мобилизацию клеточного кальция, мобилизацию мембранных липидов, клеточную адгезию, гидролиз инозитлипидов и гидролиз фосфолипидов. Как правило, рецепторы могут быть мембраносвязанными, цитозольными или ядерными; мономерными (например, рецептор тироидстимулирующего гормона, бета-адренергический рецептор) или многомерными (например, рецептор PDGF, рецептор гормона роста, рецептор IL-3, рецептор GM-CSF, рецептор G-CSF, рецептор эритропоэтина и рецептор IL-6).

Термин «секреторная сигнальная последовательность» означает последовательность ДНК, кодирующую полипептид («секреторный пептид»), который в качестве компонента более крупного полипептида направляет более крупный полипептид по секреторному пути клетки, в которой он синтезирован. Более крупный полипептид обычно расщепляется для удаления секреторного пептида при прохождении по секреторному пути.

Термин «сплайсированный вариант» использован в данном описании для обозначения альтернативных форм РНК, транскрибированной из гена. Сплайсированный вариант образуется естественным путем в результате использования чередующихся сайтов сплайсинга в молекуле транскрибированной РНК или реже между молекулами отдельно транскрибированной РНК и может вызывать образование нескольких мРНК, транскрибированных из одного гена. Сплайсированные варианты могут кодировать полипептиды, имеющие измененную аминокислотную последовательность. Термин «сплайсированный вариант» использован в данном описании также для обозначения белка, кодируемого сплайсированным вариантом мРНК, транскрибированной из гена.

Вполне понятно, что молекулярные массы и длины полимеров, определяемые неточными аналитическими методами (например, гель-электрофорезом), представляют собой примерные величины. Величина Х, определяемая как «около» Х или «примерно» Х, является точной в пределах погрешности ±10%.

Все приведенные публикации включены в данное описание в качестве ссылки.

В основе настоящего изобретения частично лежит открытие новой последовательности ДНК, которая кодирует белок, имеющий структуру четырехспирального цитокина. В результате выполнения анализов методами клонирования и пролиферации, которые подробно рассмотрены в данном описании, было установлено, что полинуклеотидная последовательность, кодирующая новый полипептидный лиганд, является лигандом с высокой специфичностью в отношении рецептора zcytor17 (SEQ ID NO:5) и имеет по меньшей мере одну дополнительную субъединицу, содержащую бета-рецептор онкостатина М (OSMRbeta) (SEQ ID NO:7) и WSX-1 (SEQ ID NO:9). Данный полипептидный лиганд, получивший название zcytor17lig, был выделен из библиотеки кДНК, созданной из активированных клеток периферической крови человека (hPBC), которые были отобраны при мечении CD3. CD3 является маркером клеточной поверхности, специально предназначенным для клеток лимфоидного происхождения, в частности, Т-клеток.

В нижеследующих примерах для скрининга источника кДНК, кодирующей zcytor17lig, была использована линия клеток, выживание и рост которых при отсутствии других факторов роста зависит от пути, связанного с OSMRbeta и рецептором zcytor17, или от пути, связанного с OSMRbeta, WSX-1 и рецептором zcytor17. Предпочтительной линией клеток, зависящей от фактора роста, которая была использована для трансфекции и экспрессии рецептора zcytor17, была линия клеток BaF3 (Palacios and Steinmetz, Cell 41:727-734, 1985; Mathey-Prevot et al., Mol. Cell. Biol. 6:4133-4135, 1986). Однако для вышеуказанной цели пригодны и другие линии клеток, зависящих от фактора роста, такие как FDC-P1 (Hapel et al., Blood 64:786-790, 1984) и МО7е (Kiss et al., Leukemia 7:235-240, 1993).

Аминокислотная последовательность для рецепторов OSMR, WSX-1 и zcytor17 показала, что кодируемые рецепторы относятся к подсемейству рецепторов цитокина класса I, которое включает в себя, не ограничиваясь ими, рецепторы для IL-2, IL-4, IL-7, Lif, IL-12, IL-15, EPO, TPO, GM-CSF и G-CSF (см. Cosman, "The Hematopoietin Receptor Superfamily" in Cytokine 5(2):95-106, 1993). Рецептор zcytor17 всесторонне описан в принадлежащей на правах общей собственности заявке на патент РСТ № US01/20484 (публикация WIPO № WO 02/00721), и WSX-1 всесторонне описан в патенте США № 5925735. Анализ распределения в тканях мРНК рецептора zcytor17 позволил выявить экспрессию в субпопуляции активированных CD4+ и CD8+ Т-клеток, CD14+-моноцитах и более слабую экспрессию в CD19+ В-клетках. Кроме того, указанная мРНК присутствовала как в покоящихся, так и в активированных линиях клеток моноцитов ТНР-1 (АТСС № TIB-202), U937 (ATCC № CRL-1593.2) и HL60 (ATCC № CCL-240).

Экспрессия WSX-1 является наиболее сильной в тимусе, селезенке, PBL и лимфатическом узле, кроме того, повышенная экспрессия наблюдалась в активированных Т-клетках. Было обнаружено весьма обширное распределение в тканях рецептора OSMRbeta. Распределение в тканях трех вышеуказанных рецепторов позволяет предположить, что мишенью для предполагаемого лиганда zcytor17lig являются клетки гемопоэтической линии, в частности, Т-клетки, моноциты/макрофаги, клетки-предшественники лимфоидных клеток и лимфоидные клетки. Другие известные четырехспиральные цитокины, воздействующие на лимфоидные клетки, включают в себя IL-2, IL-4, IL-7 и IL-15. Для ознакомления с четырехспиральными цитокинами см. Nicola et al., Advances in Protein Chemistry 52:1-65, 1999 and Kelso, A., Immunol. Cell Biol. 76:300-317, 1998.

Кондиционированная среда (СМ), полученная из CD3+-селектированных, РМА/иономицин-стимулированных клеток периферической крови человека, поддерживала рост клеток BaF3, экспрессирующих рецепторы zcytor17, OSMRbeta и WSX-1 и зависящих от IL-3. Кондиционированные клетками среды, которые: 1) не были стимулированы РМА/иономицином или 2) не были CD3-селектированы (при стимуляции РМА/иономицином или без указанной стимуляции), не поддерживали рост клеток BaF3, экспрессирующих рецепторы zcytor17, OSMRbeta и WSX-1 (BaF3/zcytor17/WSX-1/OSMRbeta). Контрольные эксперименты показали, что указанная пролиферативная активность не была присуща другим известным факторам роста и что способность таких кондиционированных сред стимулировать пролиферацию клеток, экспрессирующих рецепторы zcytor17/WSX-1/OSMRbeta, можно было нейтрализовать растворимой формой рецептора zcytor17.

Кондиционированная среда из CD3+-селектированных клеток, активированных РМА/иономицином, также поддерживала рост клеток BaF3, экспрессирующих рецепторы zcytor17 и OSMRbeta (zcytor17/OSMRbeta), в то время как указанная кондиционированная среда не стимулировала клетки BaF3, экспрессирующие только рецепторы zcytor17 и WSХ-1 (zcytor17/WSХ-1) или содержащие только рецептор OSMRbeta.

Пролиферация клеток BaF3, экспрессирующих рецепторы zcytor17/WSX-1/OSMRbeta под действием кондиционированной среды из CD3+-селектированных, РМА/иономицин-стимулированных клеток периферической крови человека, была идентифицирована при визуальном осмотре культур и/или при помощи анализа пролиферации. В данной области известны многие пригодные анализы пролиферации, которые включают в себя восстановление красителя, такого как аламаровый синий (AlamarBlue™) (AccuMed International, Inc. Westlake, Ohio), бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия (Mosman, J. Immunol. Meth. 65:55-63. 1983); 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-5-3-карбоксиметоксифенил-2Н-тетразолий; гидроксид 2,3-бис(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-5-[(фениламино)карбонил]-2H-тетразолия и хлорид цианодитолилтетразолия (которые можно приобрести коммерческим путем в компании Polysciences, Inc., Warrington, PA); анализы митогенеза, такие как измерение включения ³Н-тимидина; вытеснение красителя с использованием, например, нафталинового черного или трипанового синего; поглощение красителя с использованием диацетилфлуоресцеина; и высвобождение хрома. См., например, публикацию Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 3rd ed., Wiley-Liss, 1994, которая включена в данное описание в качестве ссылки.

Библиотека кДНК была получена из CD3+-селектированных, РМА- и иономицин-стимулированных первичных клеток периферической крови человека. Библиотеку кДНК CD3+-селектированных, РМА- и иономицин-стимулированных клеток периферической крови человека делили на пулы, содержащие несколько молекул кДНК, и трансфицировали в линию клеток-хозяев, например, клетки ВНК 570 (АТСС, номер доступа 10314). Трансфицированные клетки-хозяева культивировали в среде, которая не содержала экзогенных факторов роста (например, 5% FBS), и собирали кондиционированную среду. Кондиционированные среды анализировали в отношении способности стимулировать пролиферацию клеток BaF3, трансфицированных рецепторами zcytor17, WSX-1 и OSMRbeta. Были идентифицированы пулы кДНК, продуцирующие кондиционированную среду, которая стимулировала клетки BaF3, содержащие рецепторы zcytor17/WSX-1/OSMRbeta. Собранную плазмидную кДНК электропорировали в E. coli. кДНК выделяли из единичных колоний и трансфицировали в клетки ВНК 570. Положительные клоны идентифицировали по положительному результату при выполнении анализа пролиферации клеток BaF3, содержащих рецепторы zcytor17/WSX-1/OSMRbeta, и указанную активность подтверждали нейтрализацией пролиферации с использованием растворимого рецептора zcytor17.

Положительный клон выделяли, и выполняли анализ последовательности, результаты которого показали, что полинуклеотидная последовательность в плазмидной ДНК обладает признаками новизны. Секреторная сигнальная последовательность включает в себя аминокислотные остатки с 1 (Met) по 23 (Ala), и зрелый полипептид содержит аминокислотные остатки с 24 (Ser) по 164 (Thr) (как показано в SEQ ID NO:2). Другой анализ методом секвенирования N-конца очищенного лиганда zcytor17lig из клеток 293Т показал, что N-конец соответствует остатку 27 (Leu), как показано в SEQ ID NO:2, при этом зрелый полипептид содержит аминокислотные остатки с 27 (Leu) по 164 (Thr) (как показано в SEQ ID NO:2).

Как правило, считается, что цитокины имеют структуру, состоящую из четырех альфа-спиралей, в которой спирали А, С и D выполняют особенно важную функцию при взаимодействии лиганд-рецептор и являются более консервативными среди членов данного семейства. На основании аминокислотной последовательности zcytоr17lig человека, показанной в SEQ ID NO:2, был выполнен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей zcytоr17lig человека, IL-3 человека и цитокина человека, результаты которого позволили предположить, что спираль А zcytor17lig состоит из аминокислотных остатков 38-52; спираль В состоит из аминокислотных остатков 83-98; спираль С состоит из аминокислотных остатков 104-117, и спираль D состоит из аминокислотных остатков 137-152, как показано в SEQ ID NO:2. Структурный анализ показывает, что петля А/В является длинной, петля В/C является короткой и петля C/D является длинной. Указанная структура петель ведет к организации спиралей по принципу вверх-вверх-вниз-вниз. Благодаря четырехспиральной структуре консервативные остатки цистеина в zcytor17lig соответствуют аминокислотным остаткам 72, 133 и 147 SEQ ID NO:2 и остаткам 74, 137 и 151 описанной ниже SEQ ID NO:11. Сопоставимое расположение цистеина является еще одним подтверждением четырехспиральной структуры. Кроме того, высококонсервативным остатком в zcytor17lig является остаток Glu, показанный в SEQ ID NO:2 в положении остатка 43.

Кроме того, предполагаемая аминокислотная последовательность zcytor17lig мыши на 31% идентична предполагаемому белку человека по всей длине последовательностей (SEQ ID NO:2 и SEQ ID NO:11). В результате сравнения последовательностей человека и мыши консервативные остатки zcytor17lig были обнаружены в областях, предположительно кодирующих альфа-спирали С и D. Соответствующие полинуклеотиды, кодирующие полипептидные области, домены, фрагменты, остатки и последовательности zcytor17lig человека, аналогичны показанным в SEQ ID NO:1.

Хотя спираль D является относительно консервативной в zcytor17lig человека и мыши, наиболее консервативной является спираль С. Хотя у обоих видов в данной области доминируют кислые аминокислоты, расхождения могут быть обусловлены видовой специфичностью взаимодействия между лигандом zcytor17lig и его рецептором, при этом рецептор zcytor17 включает в себя мономерные, гетеродимерные (например, zcytor17/OSMRbeta, WSX-1/OSMRbeta, zcytor17/WSX-1) или многомерные (например, zcytor17/OSMRbeta/WSX-1) рецепторы. Петля А/B и спираль В лиганда zcytor17lig являются маргинально консервативными, и спираль С при переходе петли C/D в спираль D является наиболее консервативной у двух видов; консерватизм данной области позволяет предположить, что она является функционально значимой. Спирали D лиганда zcytor17lig человека и мыши также являются консервативными. Антагонисты рецептора zcytor17 могут быть созданы в результате введения мутаций в спираль D лиганда zcytor17lig. Указанные мутации могут включать в себя усечение белка от остатка Thr156 (SEQ ID NO:2) или сохранение остатков, которые вызывают связывание лиганда с рецептором, но ослабляют активность передачи сигналов.

Четырехспиральные цитокины сгруппированы также по длине спиралей. «Длинноспиральные» цитокины обычно состоят из 24-30 остатков и включают в себя IL-6, ресничный нейтротрофный фактор (CNTF), фактор ингибирования лейкоза (LIF) и гормон роста человека (hGH). «Короткоспиральные» цитокины обычно состоят из 18-21 остатка и включают в себя IL-2, IL-4 и GM-CSF. Считается, что zcytor17lig является новым членом группы короткоспиральных цитокинов. Исследования с использованием CNTF и IL-6 показали, что спираль CNTF может быть заменена эквивалентной спиралью в IL-6, благодаря чему химерам сообщаются CNTF-связывающие свойства. Таким образом, очевидно, что функциональные домены четырехспиральных цитокинов определены на основе структурной гомологии независимо от идентичности последовательностей и могут сохранять функциональную целостность в химере (Kallen et al., J. Biol. Chem. 274:11859-11867, 1999). Следовательно, домены спирали zcytor17lig могут быть пригодны для получения химерных молекул, слитых с другими короткоспиральными цитокинами, для определения и модуляции специфичности связывания с рецептором. Особый интерес представляют слитые белки, созданные с использованием спирали А и/или спирали D, и слитые белки, которые объединяют домены спирали и петли из других короткоспиральных цитокинов, таких как IL-2, IL-4, IL-15, Lif, IL-12, IL-3 и GM-CSF.

Полинуклеотидная последовательность для IL-2 человека показана в SEQ ID NO:161, и соответствующая аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:162. Секреторная сигнальная последовательность включает в себя аминокислотные остатки с 1 (Met) по 20 (Ser) SEQ ID NO:162; нуклеотиды 48-107 SEQ ID NO:161. Зрелый полипептид содержит аминокислотные остатки с 21 (Ala) по 156 (Thr) SEQ ID NO:162; нуклеотиды 108-515 SEQ ID NO:161. Спираль А IL-2 человека содержит аминокислотные остатки с 27 (Thr) по 48 (Leu) SEQ ID NO:162; нуклеотиды 126-191 SEQ ID NO:161. Спираль В IL-2 человека включает в себя спираль В1 и спираль В2. Спираль В1 IL-2 человека содержит аминокислотные остатки с 73 (Ala) по 80 (Gln) SEQ ID NO:162; нуклеотиды 264-287 SEQ ID NO:161. Спираль В2 IL-2 человека содержит аминокислотные остатки с 83 (Glu) по 92 (Val) SEQ ID NO:162; нуклеотиды 294-323 SEQ ID NO:161. Таким образом, спираль В (включающая в себя спирали В1 и В2) IL-2 представлена аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:168 (нуклеотидная последовательность SEQ ID NO:167), в которой аминокислотные остатки 9 и 10 могут быть любой аминокислотой. SEQ ID NO:168 идентична аминокислотам с 73 (Ala) по 92 (Val) SEQ ID NO: 162, в которой аминокислоты 81 и 82 могут быть любой аминокислотой. В предпочтительной форме спираль В IL-2 содержит аминокислоты с 73 (Ala) по 92 (Val) SEQ ID NO:162; нуклеотиды 264-323 SEQ ID NO:161. Спираль С IL-2 человека содержит аминокислотные остатки со 102 (His) по 116 (Val) SEQ ID NO:162; нуклеотиды 351-395 SEQ ID NO:161. Спираль D IL-2 человека содержит аминокислотные остатки со 134 (Thr) по 149 (Gln) SEQ ID NO:162; нуклеотиды 447-494 SEQ ID NO:161.

Полинуклеотидная последовательность для IL-4 человека показана в SEQ ID NO:163, и соответствующая аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:164. Секреторная сигнальная последовательность содержит аминокислотные остатки с 1 (Met) по 24 (Gly) SEQ ID NO:164; нуклеотиды 64-135 SEQ ID NO:163. Зрелый полипептид содержит аминокислотные остатки с 25 (His) по 153 (Ser) SEQ ID NO:164; нуклеотиды 136-522 SEQ ID NO:163. Спираль А IL-4 человека содержит аминокислотные остатки с 30 (Thr) по 42 (Thr) SEQ ID NO:164; нуклеотиды 151-189 SEQ ID NO:163. Спираль В IL-4 человека содержит аминокислотные остатки с 65 (Glu) по 83 (His) SEQ ID NO:164; нуклеотиды 256-312 SEQ ID NO:163. Спираль С IL-4 человека содержит аминокислотные остатки с 94 (Ala) по 118 (Ala) SEQ ID NO:164; нуклеотиды 343-417 SEQ ID NO:163. Спираль D IL-4 человека содержит аминокислотные остатки со 133 (Leu) по 151 (Cys) SEQ ID NO:164; нуклеотиды 460-516 SEQ ID NO:163.

Полинуклеотидная последовательность для GM-CSF человека представлена в SEQ ID NO:165, и соответствующая аминокислотная последовательность показана в SEQ ID NO:166. Секреторная сигнальная последовательность содержит аминокислотные остатки с 1 (Met) по 17 (Ser) SEQ ID NO:166; нуклеотиды 9-59 SEQ ID NO:165. Зрелый полипептид содержит аминокислотные остатки с 18 (Ala) по 144 (Glu) SEQ ID NO:166; нуклеотиды 60-440 SEQ ID NO:165. Спираль А GM-CSF человека содержит аминокислотные остатки с 30 (Trp) по 44 (Asn) SEQ ID NO:166; нуклеотиды 96-140 SEQ ID NO:165. Спираль В GM-CSF человека содержит аминокислотные остатки с 72 (Leu) по 81 (Gln) SEQ ID NO:166; нуклеотиды 222-251 SEQ ID NO:165. Спираль С GM-CSF человека содержит аминокислотные остатки с 85 (Gly) по 103 (Gln) SEQ ID NO:166; нуклеотиды 261-317 SEQ ID NO:165. Спираль D GM-CSF человека содержит аминокислотные остатки со 120 (Phe) по 131 (Leu) SEQ ID NO:166; нуклеотиды 366-401 SEQ ID NO:165.

Спирали А, В, С и D, содержащие аминокислотные остатки для zcytor17lig, IL-3, IL-2, IL-4 и GM-CSF, показаны в таблице 1.

Таблица 1
	Спираль А	Спираль В	Спираль С	Спираль D
zcytor17lig	38-52	83-98	104-117	137-152	SEQ ID NO:2
IL-3	35-45	73-86	91-103	123-141	SEQ ID NO:102
IL-2	27-48	73-92	102-116	134-149	SEQ ID NO:162 или спираль В, показанная в SEQ ID NO:168
IL-4	30-42	65-83	94-118	133-151	SEQ ID NO:164
GM-CSF	30-44	72-81	85-103	120-131	SEQ ID NO:166

Настоящее изобретение относится к молекулам полинуклеотидов, включая молекулы ДНК и РНК, кодирующие полипептиды zcytor17lig, рассмотренные в данном описании. Специалистам в данной области должно быть понятно, что, с учетом вырожденности генетического кода, возможны значительные вариации последовательностей в указанных молекулах полинуклеотидов. SEQ ID NO:3 является вырожденной последовательностью ДНК, которая включает в себя все ДНК, кодирующие полипептид zcytor17lig, и его фрагменты SEQ ID NO:2. Специалистам должно быть понятно, что вырожденная последовательность SEQ ID NO:3 также включает в себя все последовательности РНК, кодирующие SEQ ID NO:2, в результате замены остатка Т остатком U. Таким образом, полинуклеотиды, кодирующие полипептид zcytor17lig, которые содержат нуклеотиды с 1 или 70 по 492 SEQ ID NO:3 и их эквивалентные РНК, входят в объем настоящего изобретения. В таблице 2 приведены однобуквенные коды, используемые в SEQ ID NO:3 для обозначения положений вырожденных нуклеотидов. В столбцах «Расшифровка» указаны нуклеотиды, обозначенные кодовым символом. В столбце «Комплемент» указан код для комплементарных нуклеотидов. Например, код Y означает остаток С или Т, и их комплемент R означает остаток А или G, при этом остаток А комплементарен остатку Т, и остаток G комплементарен остатку С.

Таблица 2
Нуклеотид	Расшифровка	Комплемент	Расшифровка
A	A	T	T
C	C	G	G
G	G	C	C
T	T	A	A
R	A/G	Y	C/T
Y	C/T	R	A/G
M	A/C	K	G/T
K	G/T	M	A/C
S	C/G	S	C/G
W	A/T	W	A/T
H	A/C/T	D	A/G/T
B	C/G/T	V	A/C/G
V	A/C/G	B	C/G/T
D	A/G/T	H	A/C/T
N	A/C/G/T	N	A/C/G/T

Вырожденные кодоны, используемые в SEQ ID NO:3, которые включают в себя все возможные кодоны для данной аминокислоты, приведены в таблице 3.

Таблица 3
Амино-кислота	Однобуквенный код	Кодоны	Вырожденный кодон
Cys	C	TGC TGT	TGY
Ser	S	AGC AGT TCA TCC TCG TCT	WSN
Thr	T	ACA ACC ACG ACT	ACN
Pro	P	CCA CCC CCG CCT	CCN
Ala	A	GCA GCC GCG GCT	GCN
Gly	G	GGA GGC GGG GGT	GGN
Asn	N	AAC AAT	AAY
Asp	D	GAC GAT	GAY
Glu	E	GAA GAG	GAR
Gln	Q