Элемент, связывающийся с -рецептором интерлейкина-4 (il-4r )-173

Элемент, связывающийся с -рецептором интерлейкина-4 (il-4r )-173

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к элементам, связывающимся с α-рецептором интерлейкина-4 (IL-4Rα, известным также как CD124), прежде всего к молекулам антител и к их терапевтическому применению, например, при лечении или профилактике нарушений, ассоциированных с IL-4Rα, IL-4 и/или IL-13, примерами которых является астма и ХОЗЛ.

Субъединица IL-4Rα человека (Swiss Prot, рег. №Р24394) представляет собой мембранный белок типа I (MM 140 кДа), который с высокой аффинностью связывается с IL-4 человека (Andrews и др., J. Biol. Chem., 277, 46073-46078 (2002)). Комплекс IL-4/IL-4Rα может димеризоваться с общей γ-цепью (γ-цепью CD132) или с субъединицей рецептора IL-13Rα1 (с участием доменов IL-4) с образованием двух различных сигнальных комплексов, обычно обозначаемых как рецепторы типа I и типа II, соответственно. В другом варианте IL-13 может связываться с IL-13Rα1 с образованием комплекса IL-13/IL-13Rα1, который связывается с субъединицей IL-4Rα с образованием комплекса рецептора типа II. Таким образом, IL-4Rα опосредует биологическую активность IL-4 и IL-13 (см. обзор Gessner и др., Immunobiology, 201, 285 (2000)). При проведении испытаний in vitro было установлено, что IL-4 и IL-13 активируют эффекторные функции в ряде клеток, например в Т клетках, В клетках, эозинофилах, тучных клетках, базофилах, клетках гладких мышц дыхательных путей, эпителиальных клетках дыхательных путей, фибробластах легких и эндотелиальных клетках (см. обзор Steinke и др., Resp.Res., 2, 66 (2001) и Willis-Karp, Immunol. Rev., 202, 175 (2004)).

В ограниченной степени IL-4Rα экспрессируется (100-5000 молекул/клетке) на многих типах клеток (Lowenthal и др., J. Immunol., 140, 456 (1988)), например на Т клетках периферической крови, на моноцитах, на эпителиальных клетках дыхательных путей, на В клетках и на фибробластах легких. Рецептор типа I преобладает в кроветворных клетках, в то время как рецептор типа II экспрессируется на кроветворных клетках и некроветворных клетках.

В литературе описаны полиморфные формы IL-4Rα в популяции человека (см. обзор Gessner и др., Immunobiology, 201, 285 (2000)) и сообщается об ассоциации с IgE или клинической атопии в некоторых популяциях. Например, V75R576 IL-4Rα ассоциируется с аллергической астмой и повышенной функцией IL-4Rα (Risma и др. J. Immunol., 169(3), 1604-1610 (2002)).

В литературе приводится ряд фактов, свидетельствующих о важной роли пути IL-4/IL-13 в патологии астмы (см. обзор Chatila, Trends in Molecular Med, 10, 493 (2004)), а также, как описано в тексте заявки, в развитии ряда других патологических состояний. Принято считать, что патологический процесс инициируется, и поддерживается благодаря повышенной секреции IL-4 и IL-13. Полагают, что IL-13 является основным партнером в запуске гиперреактивности дыхательных путей (ГРДП), гиперсекреции слизи и коррекции дыхательных путей, тогда как IL-4 является главным индуктором поляризации Th2 и продуцирования IgE (Wynn, Annu. Rev. Immunol., 21, 425 (2003)).

О роли IL-4Rα в заболевании астмой свидетельствуют также результаты испытания на модели животных. Введение функционального антагониста мышиного IL-4R (мутант IL-4, делеция С118) во время аллергенной стимуляции овальбумином (ОВА, модельный аллерген) подавляло развитие аллергической эозинофилии дыхательных путей и AHR у мышей, предварительно сенсибилизированных ОВА (Tomkinson и др. J. Immunol., 166(9), 5792-5800 (2001)). Кроме того, в ряде испытаний in vivo получены положительные результаты при блокировании IL-13 или IL-4 на модели животных с заболеванием астмой. Например, терапевтическое введение мА анти-IL-13 на модели ОВА-индуцированного хронического стойкого воспаления дыхательных путей подавляло AHR, останавливало развитие субэпителиального фиброза и воспалительного процесса и восстанавливало гиперплазию слизи до нормального уровня (Yang и др., J. Pharmacol. Exp.Ther., 313(1), 8-15 (2005)). На модели мышей, обработанных ОВА, было установлено, что ингибирование IL-4 антителами анти-IL-4 заметно снижало инфильтрацию эозинофилов при введении во время иммунизации (Coyle и др., Am. J. Resp.Cell Mol/ Biol/, 13, 54 (1995)). На аналогичной модели у мышей, дефицитных по IL-4, было установлено, что в бронхоальвеолярном смыве присутствует существенно меньше эозинофилов и наблюдается существенно более низкий уровень перибронхиального воспалительного процесса после воздействия ОВА (Brusselle и др., Clin. Exp.Allergy, 24, 73 (1994)).

При проведении клинических испытаний (фаза IIa) установлено, что антагонист IL-4Rα (так называемый мутеин IL-4) понижает аллерген-индуцированную позднюю астматическую реакцию и ослабляет остаточный статус воспалительного процесса в легких у пациентов с астмой (Wenzel и др., Lancet, 370, 1422 (2007)). Указанные результаты являются дополнительным подтверждением того, что антагонист IL-4Rα может найти клиническое применение при заболевании астмой.

Кроме астмы IL-4Rα имеет отношение к ряду других патологических состояний, указанных ниже.

Хроническое обструктивное заболевание легких (ХОЗЛ) включает популяции пациентов с различным уровнем хронического бронхита, заболеванием тонких дыхательных путей и эмфиземой и характеризуется прогрессирующим необратимым ухудшением функции легких, которое практически резистентно к современным методам лечения астмы. Причины заболевания ХОЗЛ фактически не установлены. В "голландской гипотезе" предполагается, что существует общая предрасположенность к заболеванию ХОЗЛ и астмой и, следовательно, патогенез указанных нарушений развивается по аналогичным механизмам (Sluiter и др., Eur. Respir. J., 4(4), 479-489 (1991)). В работе других авторов (Zheng и др., J. Clin. Invest., 106(9), 1081-1093 (2000)) установлено, что повышенная экспрессия IL-13 в легких мыши вызывает эмфизему, повышенное образование слизи, и воспаление, т.е. наблюдаются все признаки ХОЗЛ, сопровождающие заболевание человека. Кроме того, установлено, что AHR, IL-13-зависимая ответная реакция на модели аллергического воспаления у мышей, является признаком ухудшения функции легких у курильщиков (Tashkin и др., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 153 (6 Pt 1), 1802-1811 (1996)). Установлена также связь между промотором полиморфизма IL-13 и предрасположенностью к ХОЗЛ (Van Der Pouw Kraan и др., Genes Immun., 3(7), 436-439 (2002)). Все изложенное свидетельствует о том, что путь IL-4/IL-13, и прежде всего IL-13, играет важную роль в патогенезе ХОЗЛ.

IL-13 принимает участие в патогенезе воспалительного заболевании кишечника. В работе Heller и др. (Immunity, 17(5), 629-638 (2002)) сообщается, что нейтрализация IL-13 за счет введения растворимого IL-13Rα2 ослабляет симптомы воспаления ободочной кишки на модели язвенного колита человека у мышей. Соответственно, экспрессия IL-13 была выше в образцах, полученных ректальной биопсией у пациентов с язвенным колитом, по сравнению с контролем (Inoue и др., Am. J. Gastroenterol, 94(9), 2441-2446 (1999)).

Наряду с астмой путь IL-4/I1-13 связан с другими фиброзными состояниями, такими как системный склероз (Hasegawa и др., J. Rheumatol., 24(2), 328-332 (1997)), фиброз легких (Hancock и др., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 18(1), 60-65 (1998)), индуцированный паразитом фиброз печени (Fallen и др., J. Immunol., 164(5), 2585-2591 (2000), Chiaramonte и др., J. Clin. Invest., 104(6), 777-785 (1999), Chiaramonte и др., Hepatology, 34(2), 273-282 (2001)) и муковисцидоз (Hauber и др., J. Cyst. Fibr., 2, 189 (2003)).

IL-4 и в некоторой степени IL-13 являются решающими факторами, опосредующими активность В клеток, такую как пролиферация В клеток, секреция иммуноглобулина и экспрессия 141FcεR. Клиническое применение ингибитора IL-4Rα включает, например, применение при терапии аллергии для подавления синтеза IgE (включая, например, атопический дерматит и пищевую аллергию), применение при трансплантационной терапии для предотвращения отторжения трансплантата, а также для подавления поздних реакций гиперчувствительности или контактной гиперчувствительности.

Антагонисты I1-4R могут также найти применение в качестве адъювантов для иммунотерапии аллергии и в качестве адъювантов в составе вакцин.

Описаны антитела против IL-4Rα. Двумя примерами являются нейтрализующие мышиные анти-IL-4Rα моноклональные антитела МАВ230 (клон 25463) и 16146 (клон 25463.11), которые поставляются фирмами R&D (Minneapolis, MN) и Sigma (St Louis, МО), соответственно. Указанные антитела являются подтипом IgG2a и продуцируются в мышиных гибридомах, полученных от мышей, иммунизированных очищенным рекомбинантным IL-4Ra человека (полученным из бакуловируса). Два других препарата нейтрализующих мышиных антител анти-IL-4Rα (М57 и Х2/45-12) поставляются фирмой BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ) и Bioscience (San Diego, CA), соответственно. Известны антитела IgGl, которые продуцируются в мышиных гибридомах, полученных от мышей, иммунизированных рекомбинантным растворимым IL-4Rα.

Полноразмерные антитела человека, по-видимому, являются более пригодными для клинического применения по сравнению с мышиными или химерными антителами, поскольку антимышиные антитела человека (НАМА) против F_C фрагмента иммуноглобулина мыши часто продуцируются, приводя к быстрому клиренсу и возможно анафилактической реакции (Brochier и др., Int. J. Immunopharm., 17, 41-48 (1995)). Хотя химерные антитела (содержащие вариабельные области антител мыши и константные области антител человека) являются менее иммуногенными по сравнению с мышиными мА, сообщается об анти-химерных антителах человека (НАСА) (Bell и Kamm, Aliment. Pharmacol. Ther., 14, 501-514 (2000)).

В WO 01/92340 (фирма Immunex) описаны моноклональные антитела человека против рецептора IL-4, полученные по методикам, включающим иммунизацию трансгенной мыши растворимым пептидом IL-4R и получение линий гибридомных клеток, которые секретируют антитела против IL-4R, причем главные антитела 12В5 являются полноразмерными антителами IgGl человека.

В WO 05/047331 (фирма Immunex) описаны другие антитела, полученные из 12В5 (обозначенные H1L1) с использованием мутагенеза олигонуклеотида, кодирующего область VH. Каждая мутированная цепь VH комплементарно связывалась с одной из 6 определенных цепей VL с образованием небольшого мотива антител.

В WO 07/082068 (фирма Aerovance) описан способ лечения астмы, включающий введение мутантного белка IL-4 человека, содержащего замены R121D и Y124D. В описании заявки указано, что включение такого мутеина IL4 в состав фармацевтической композиции может подавлять связывание huIL-4 дикого типа и huIL-13 дикого типа с рецепторами.

В WO 08/054606 (фирма Regeneron) описаны конкретные антитела против IL-4R человека, которые получают в трансгенных мышах, способных продуцировать антитела человека.

Предпочтительно и необходимо разрабатывать и получать антитела против IL-4Rα человека, которые также способны давать перекрестную реакцию с ортологичным белком из других видов, например макак-крабоедов. Такие антитела облегчают характеризацию таких антител при оценке фармакологии и безопасности in vivo. Для такой оценки пригодны антитела, эффективность или аффинность которых в отношении белка других видов в 10 раз меньше по сравнению с активностью в отношении белка человека. Однако белок IL-4Rα человека относительно мало напоминает ортологичный белок IL-4Ra из других видов за исключением шимпанзе. Следовательно, необходима разработка антител с высокой аффинностью и эффективностью, пригодных для клинического применения, с перекрестной реактивностью с белками других видов, которые пригодны для оценки безопасности и токсикологии, необходимой для клинического применения.

Благодаря применению соответствующих методов селекции и анализа заявители разработали связывающие элементы семейства IL-4Rα, которые ингибируют биологическую активность IL-4Rα человека и макак-крабоедов.

Как подробно описано в разделе Примеры, на основе программы первоначальной идентификации заявители выбрали одно антитело против IL-4Rα человека, которое также слабо связывается и обеспечивает функциональную нейтрализацию IL-4Rα макак-крабоедов. После направленного и произвольного мутагенеза и отбора мутантов указанных исходных антител получали панель антител, обладающих существенно улучшенными свойствами. Области VH и VL, включающие участки комплементарности (CDR) исходных антител (антител 1), и оптимизированных антител, приводятся на фигурах 1, 2, 3 и 4. Указанные молекулы антител, VH, VL, CDR, и связывающие элементы, включающие один или более CDR, являются объектами настоящего изобретения.

Установлено, что кроме рецептора IL-4Rα дикого типа связывающие элементы по настоящему изобретению связываются с I75V IL-4Rα, обычным вариантом рецептора человека.

В заявке описаны связывающие элементы, которые эффективно нейтрализуют биологическое действие IL-4Rα, обладают высокой аффинностью к IL-4Rα и ингибируют передачу сигнала, индуцированного IL-4 и IL-13. Следует отметить, что связывающие элементы подавляют передачу сигнала от высоко аффинных комплексов, например, IL-4:IL-4Rα:γc, IL-4:IL-4Rα:IL-13Rα1, IL-13:IL-13Rα1:IL-4Rα. Такое действие предотвращает передачу сигналов IL-4 и IL-13. Кроме того, указанные результаты свидетельствуют о том, что связывающие элементы ингибируют взаимодействие и передачу сигнала комплексами IL-4Rα типа 1 и типа 2. Указанные и другие свойства и действие связывающих элементов более подробно описаны ниже.

Связывающие элементы можно использовать для лечения нарушений, при которых экспрессируются IL-4Rα, IL-4 или IL-13, например, одного или более IL-4Rα-, IL-4- или IL-13-ассоциированных нарушений, указанных в тексте заявки, таких как астма или ХОЗЛ.

Как описано в тексте заявки, связывание связывающего элемента с IL-4Rα определяют с использованием поверхностного плазменного резонанса, например, BIAcore.

Данные поверхностного плазменного резонанса представляют в виде графика (модель связывания по Ленгмюру, 1:1, k_a и k_d одновременно) и рассчитывают константу аффинности K_D по соотношению констант скорости реакции k_d1/k_a1. Связывающий элемент по изобретению может обладать одновалентной аффинностью при связывании с IL-4Rα человека, которая составляет менее 20 нМ. В других вариантах одновалентная аффинность при связывании с IL-4Rα человека составляет менее 10 нМ, например менее 8 нМ, менее 5 нМ. В других вариантах связывающий элемент также связывается с IL-4Rα макак-крабоедов. В одном варианте связывающий элемент по настоящему изобретению обладает одновалентной аффинностью при связывании с IL-4Rα человека в интервале от 0,05 до 12 нМ. В одном варианте связывающий элемент по настоящему изобретению обладает одновалентной аффинностью при связывании с IL-4Rα человека в интервале от 0,1 до 5 нМ. В одном варианте связывающий элемент по настоящему изобретению обладает одновалентной аффинностью при связывании с IL-4Rα человека в интервале от 0,1 до 2 нМ.

В одном варианте связывающий элемент по настоящему изобретению иммуноспецифично связывается с IL-4Rα человека с аффинностью (K_D) менее 5000 пМ, менее 4000 пМ, менее 3000 пМ, менее 2500 пМ, менее 2000 пМ, менее 1500 пМ, менее 1000 пМ, менее 750 пМ, менее 500 пМ, менее 250 пМ, менее 200 пМ, менее 150 пМ, менее 100 пМ, менее 75 пМ, по данным анализа с использованием способа, описанного в тексте заявки или известного специалисту в данной области (например, анализа BIAcore, ИФА, фирма Biacore International AB, Uppsala, Швеция).

В конкретном варианте связывающий элемент по настоящему изобретению иммуноспецифично связывается с IL-4Rα человека с аффинностью (K_D) от 25 до 5000 пМ, от 25 до 4000 пМ, от 25 до 3500 пМ, от 25 до 3000 пМ, от 25 до 2500 пМ, от 25 до 2000 пМ, от 25 до 1500 пМ, от 25 до 1000 пМ, от 25 до 750 пМ, от 25 до 500 пМ, от 25 до 250 пМ, от 25 до 100 пМ, от 25 до 75 пМ, от 25 до 50 пМ, по данным анализа, описанного в тексте заявки или известного специалисту в данной области (например, анализа BIAcore, ИФА). В другом варианте связывающий элемент (включая антитела анти-IL-4Rα) по настоящему изобретению иммуноспецифично связывается с IL-4Rα человека с аффинностью (K_D) 500 пМ, 100 пМ, 75 пМ или 50 пМ, по данным анализа, описанного в тексте заявки или известного специалисту в данной области (например, анализа BIAcore, ИФА).

Как более подробно описано в разделе Примеры, связывающие элементы по настоящему изобретению эффективно нейтрализуют IL-4Rα. Нейтрализация обозначает ингибирование биологической активности, опосредованной IL-4Rα. Связывающие элементы по изобретению могут нейтрализовать одну или более активностей, опосредованных IL-4Rα. Ингибирование биологической активности вероятно опосредуется блокированием образования сигнального комплекса (IL-4Rα) у цепи (или IL-13Rα) и одного из ассоциированных растворимых лигандов, например, IL-4 или IL-13.

Нейтрализацию передачи сигнала IL-4 или IL-13 с участием комплекса, содержащего рецептор IL-4Rα, оценивают по подавлению пролиферации TF-1 клеток, стимулированных IL-4 или IL-13.

Эпитоп IL4Rα человека, с которым связываются антитела по изобретению, локализовали с использованием комбинации мутагенеза и замены домена. Химеры с полной заменой домена позволяют локализовать эпитоп в домене 1 (D1) IL4Ra человека (остатки М1-Е119). IL-4Rα человека содержит пять петлевых областей, которые в кристаллической структуре расположены вблизи IL4 (Hage и др., Cell. 97, 271-281 (1999)). Химеры с заменой петли позволяют локализовать эпитоп IL-4Rα человека в комплексе с антителами по изобретению в основном в петле 3 (остатки L89-N98) и частично в петле 2 (остатки V65-H72). Химеры, не содержащие петлю 3, неспособны ингибировать связывание IL-4Rα человека с антителами, а химеры, не содержащие петлю 2, характеризуются величиной IC₅₀, которая в 100 раз превышает IC₅₀ IL-4Rα человека (таблица 5). В соответствии с данными, полученными при замене домена, обе петли 2 и 3 локализованы в домене 1 (D1) (Hage и др., Cell, 97, 271-281 (1999)).

Эпитоп, узнаваемый антителами, представляет собой структурный эпитоп из 18 аминокислот, локализованных в двух петлевых областях IL-4Rα человека, V65-H72 и L89-N98. Эпитоп включает остатки L67 и L68 петли 2 и D92 и V93 петли 3 (относительно остатков 67, 68, 92 и 93 см. SEQ ID NO: 454 или 460). Наиболее существенными для связывания с анализируемыми антителами, которые еще способны связываться с химерным IL-4Rα, не содержащим остатков L67 и/или L68 в петле 2, являются D2, за которым следует V93. Возможно, что антитела по изобретению могут также связываться с белком IL-4Кα человека, содержащим наряду с одним из указанных остатков L67, L68, D92 и V93 другие аминокислоты.

Одним объектом изобретения является изолированный связывающий элемент, способный связываться с α-рецептором интерлейкина-4 (hIL-4Rα) человека по меньшей мере по одному аминокислотному остатку, выбранному из аминокислоты в положении 67, 68, 92 и 93 в SEQ ID NO: 460. Соответственно, одним объектом изобретения является изолированный связывающий элемент, способный связываться по меньшей мере по одному аминокислотному остатку 67, 68, 92 и 93 в SEQ ID NO: 460 нативного α-рецептора интерлейкина-4 человека (hIL-4Rα). В конкретном варианте изолированный связывающий элемент способен связываться с аминокислотой в положении 92 hIL-4Rα (SEQ ID NO:460). В другом варианте изолированный связывающий элемент способен связываться с D92 и по меньший мере с другим аминокислотным остатком, выбранным из L67, L68 и V93. В другом варианте изолированный связывающий элемент способен связываться с D92 и V93. В другом варианте изолированный связывающий элемент способен связываться с D92, V93 и L67 или L68. В другом варианте антитела способны связываться с каждым из аминокислотных остатков L67, L68, D92 и V93. Каждый из указанных вариантов обозначает положения аминокислот в hIL-4Rα, которые определяются в соответствии с полной аминокислотной последовательностью hIL-4Rα (положения 1-229), представленной в SEQ ID NO:460. В одном варианте связывающий элемент способен связываться с указанными аминокислотными остатками в составе эпитопа (т.е. по меньшей мере по одному из положений 67,68, 92 и 93) полноразмерного hIL-4Rα. В одном варианте связывающий элемент способен связываться с указанными аминокислотными остатками в составе эпитопа (т.е. по меньшей мере по одному из положений 67, 68, 92 и 93) нативного hIL-4Rα, экспрессированного на клеточной поверхности. В одном варианте связывающий элемент способен связываться с указанными аминокислотными остатками в составе эпитопа (т.е. по меньшей мере по одному из положений 67, 68, 92 и 93) рекомбинантно экспрессированного полноразмерного (включающего 229 аминокислот) hIL-4Rα.

Другим объектом изобретения является изолированный связывающий элемент, способный связываться с α-рецептором интерлейкина-4 (hIL-4Rα) человека. В конкретном варианте изолированный связывающий элемент представляет собой антитела человека. В другом варианте изолированный связывающий элемент

способен также связываться с α-рецептором интерлейкина-4 (cyIL-4Rα) макак-крабоедов.

В другом варианте изобретения предлагается изолированный элемент, способный связываться с α-рецептором интерлейкина-4 (hIL-4Rα) человека, причем указанный элемент характеризуется величиной IC50 (среднее геометрическое) менее 50 пМ при ингибировании пролиферации клеток, индуцированной IL-4 (hIL-4) человека, например, при анализе ингибирования пролиферации клеток TF-1 с использованием 18 пМ растворимого IL-4 человека, причем связывающий элемент способен также связываться с cyIL-4Rα.

В конкретных вариантах указанного объекта изобретения связывающий элемент характеризуется величиной IC₅₀ (среднее геометрическое) менее 50 пМ, менее 35 пМ, менее 25 пМ или менее 20 пМ при ингибировании пролиферации клеток, индуцированной IL-4 (hIL-4) человека, например, при анализе пролиферации клеток TF-1 с использованием 18 пМ растворимого IL-4 человека, В конкретных вариантах связывающий элемент по изобретению характеризуется величиной IC₅₀ (среднее геометрическое) от 1 до 50 пМ, от 1 до 35 пМ, от 2 до 30 пМ, от 2 до 25 пМ, от 2 до 12 пМ при анализе ингибирования пролиферации клеток, индуцированной IL-4 (hIL-4) человека, с использованием 18 пМ растворимого IL-4 человека, описанном в тексте заявки (например, пример 3.2.1), или методом, известным специалисту в данной области.

Связывание с cyIL-4Rα измеряют любым пригодным способом.

Аналогичным образом связывающий элемент по изобретению характеризуется величиной IC₅₀ (среднее геометрическое) менее 200 пМ при анализе ингибирования (за счет нейтрализации hIL-4Rα) пролиферации клеток TF-1, опосредованной IL-13 (hIL-13) человека, с использованием 400 пМ растворимого IL-13 (hIL-13) человека. В конкретном варианте величина IC₅₀ составляет от 5 до 75 пМ или от 5 до 45 пМ (среднее геометрическое) при анализе ингибирования (за счет нейтрализации hIL-4Rα) пролиферации клеток TF-1, опосредованной IL-13 (hIL-13) человека, с использованием 400 пМ растворимого IL-13 (hIL-13) человека.

В конкретных вариантах связывающий элемент по изобретению практически неспособен связываться с мышиным IL-4Rα. Таким образом можно считать, что связывающий элемент по изобретению способен по меньшей мере в 500 раз (например, по меньшей мере в 500 раз, по меньшей мере в 1000 раз, по меньшей мере в 1500 раз, по меньшей мере в 2000 раз, по меньшей мере в 3000 раз, по меньшей мере в 4000 раз) более эффективно связываться с α-рецептором интерлейкина-4 человека по сравнению с мышиным IL-4Rα (т.е. связывание с мышиным IL-4Rα является по меньшей мере в 500 раз менее эффектным по сравнению с IL-4Rα человека). Взаимодействие с рецептором оценивают методом конкурентного связывания с использованием ГФРВ, описанным в примере 5.1.2.

Термин «среднее геометрическое», используемый в описании заявки, обозначает среднее логарифмическое (log₁₀) значение полученных данных. Для этого необходимо выполнить по меньшей мере два измерения, например по меньшей мере 2, предпочтительно по меньшей мере 5, более предпочтительно по меньшей мере 10 повторов. Для специалиста в данной области представляется очевидным, что чем больше повторов, тем более достоверным является среднее геометрическое. Выбор числа повторов определяется специалистом в данной области.

Ингибирование биологической активности является частичным или полным. В конкретных вариантах изобретения предлагаются связывающие элементы, которые ингибируют биологическую активность IL-4Rα по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 60% или по меньшей мере на 50% по сравнению с активностью в отсутствии связывающего элемента. Степень нейтрализации IL-4Rα связывающим элементом обозначают как эффективность нейтрализации. Эффективность нейтрализации определяют или измеряют с использованием одного или более методов анализа, известных специалисту в данной области и/или описанных или упомянутых в тексте заявки. Например, эффективность оценивают с использованием следующих методов анализа:

- анализ связывания рецептор/лиганд при измерении флуоресценции (например, ГФРВ или DELFIA) или радиоактивности,

- анализ конкурентного связывания с эпитопом при измерении флуоресценции (ГФРВ или DELFIA),

- функциональные анализы на культуре клеток, включающие фосфорилирование STAT6 человека или МКПК макак-крабоедов, пролиферацию клеток TF-1, высвобождение эотаксина из линий клеток фибробластов человека или макак-крабоедов, регуляцию с повышением VCAM-1 на эндотелиальных клетках вены человека, или пролиферацию Т-клеток человека.

Некоторые из указанных методов анализа описаны в разделе Примеры.

Эффективность нейтрализации связывающего элемента, рассчитанную по данным анализа с использованием IL-4Rα одних видов (например, человека), сравнивают с эффективностью нейтрализации связывающего элемента при аналогичном анализе с использованием IL-4Rα других видов (например, макак-крабоедов) с целью оценки перекрестной реактивности связывающего элемента с IL-4Rα двух видов. Таким образом, существует необходимость в разработке связывающего элемента, например, антител или фрагмента антител, которые связываются с мишенью в организме человека и в ортологичной мишени из других видов. При этом наиболее предпочтительно, чтобы связывающее элемента было пригодно для терапевтического применения, а испытания на безопасность (например, токсичность) можно было проводить на других видах животных. Для такой оценки пригодной является такая эффективность или аффинность в отношении других видов, которая, например, в 10 раз ниже по сравнению с активностью в организме человека.

Соотношение связывания связывающих элементов по настоящему изобретению с IL-4Rα человека и "других видов" (например, макак-крабоедов) определяют с использованием ряда способов. Одним из таких способов является анализ связывания рецептор/лиганд, описанный в примере 4.3.

В конкретном варианте связывающих элементов по настоящему изобретению соотношение связывания связывающего элемента, такого как scFv, с hIL-4Rα и cyIL-4Rα, измеренное анализом связывания рецептор/лиганд, составляет по меньшей мере 6:1. Термин "по меньшей мере" 6:1 включает 8:1, 10:1 и т.д., предпочтительно 2:1, 1:1.

Связывающие элементы по изобретению связываются с IL-4Rα человека и IL-4Rα макак-крабоедов, при этом эффективность нейтрализации IL-4Rα человека в 250 раз или менее, например в 150 раз или менее, в 100, 75, 50, 25, 20, 15, в 10 раз, превышает эффективность нейтрализации L-4Rα макак-крабоедов по данным анализа связывания рецептор/лиганд, описанного в примере 4.3, где связывающим элементом является формат scFvt,

Например, согласно приведенным данным антитела №2, 4-8, 12, 16, 19, 20, 22, 23, 24, 26, 28, 32, 33, 34, 37 и 37GL, например, характеризуются эффективностью нейтрализации L-4Rα человека, которая в 25 раз или менее превышает эффективность нейтрализации L-4Rα макак-крабоедов, соответственно, по данным анализа связывания рецептор/лиганд в формате scFv, описанного в примере 4.3 (см. таблицу 1). Таким образом, в некоторых вариантах эффективность нейтрализации связывающих элементов по изобретению (в формате scFv) в отношении IL-4Rα человека и макак-крабоедов, измеренная с использованием анализа связывания рецептор/лиганд, различается в 25 раз или менее. В заявке описаны конкретные примеры антител, которые проявляют 10-кратную или менее эффективность нейтрализация IL-4Rα человека по сравнению с нейтрализацией IL-4Rα макак-крабоедов, включая антитела №2, 4, 5, 20 и 22. В одном варианте эффективность нейтрализации связывающих элементов по изобретению IL-4Rα человека и макак-крабоедов различается в 210 раз или менее, т.е. связывание с IL-4Rα человека IL-4Rα в 210 раз и не более превышает связывание с IL-4Rα макак-крабоедов. В другом варианте указанная разница в эффективности нейтрализации составляет от 5:1 до 210:1, например от 5:1 до 100:1.

При функциональном анализе на культуре клеток эффективность нейтрализации обычно представляют в виде величины IC₅₀ в нМ, если не указано иное. При функциональном анализе величина IC₅₀ представляет собой концентрацию связывающего элемента (в молях), при которой наблюдается снижение биологической (или биохимической) ответной реакции на 50% по сравнению с максимальным значением. Величину IC₅₀ рассчитывают по графику зависимости биологической ответной реакции (%) от концентрации (log) связывающего элемента с использованием программы Prism (фирма GraphPad) или Origin (фирма Origin Labs) для сигмоидной функции данных для расчета значений IC₅₀.

При анализе связывания рецептор/лиганд эффективность нейтрализации обычно представляют в виде величины К_i (константы ингибирования), концентрации связывающего элемента, при которой наблюдается блокирование 50% рецептора при отсутствии меченого лиганда. В то время как величина IC₅₀ может изменяться в зависимости от концентрации лиганда, константа K_i является абсолютной величиной, рассчитанной по уравнению Ченга Пруссоффа. Связывающий элемент по изобретению может обладать эффективностью нейтрализации с константой K_i до и включительно 5 нМ при анализе связывания с IL-4Rα человека ГФВР^®, описанном в тексте заявки. Указанный анализ можно использовать для определения K_i связывающего элемента в формате scFv. Константа K_i может, например, составлять 5,0, 4,0, 3,0, 2,0, 1,0, 0,5, 0,2, 0,1, 0,05 или 0,02 нМ. Примеры константы ингибирования К_i приводятся в примере 4.3 (см. таблицу 1), где при анализе связывания рецептор-лиганд ГФВР^® используется конечная концентрация 0,125 нМ IL-4Rα человека и 2 нМ IL-4 и подробно описана методика проведения анализа.

Кроме того, кинетику связывания и аффинность (в виде константы диссоциации K_D) элемента, связывающегося с IL-4Rα, определяют, например, методом поверхностного плазменного резонанса, такого как BIAcore®, или K_D оценивают при анализе рА2.

Поверхностный плазменный резонанс является известным способом определения аффинности связывающего элемента в отношении мишени. Анализ проводят в жидкой фазе в присутствии лиганда, иммобилизованного на подложке, и определяют связывание анализируемого элемента с лигандом. При этом поверхностный плазменный резонанс можно, например, проводить, пропуская рекомбинантный IL-4Rα в жидкой фазе над связывающим элементом, иммобилизованным на подложке. Данные поверхностного плазменного резонанса могут соответствовать модели бивалентного анализируемого элемента или одновалентного анализируемого элемента. Как показано в разделе Примеры, установлено, что модель одновалентного анализируемого элемента прежде всего соответствует определению аффинности связывающего элемента в отношении IL-4Rα. Константу аффинности K_D можно рассчитать по отношению констант скорости ассоциации и диссоциации k_d1/k_a1, которые определяют методом поверхностного плазменного резонанса на модели связывания 1:1 Ленгмюра.

Примеры оценки значений K_D для связывания с IL-4Rα, рассчитанных с использованием поверхностного плазменного резонанса, приводятся в примере 4.7 (см. таблицу 4). Указанные данные свидетельствуют о высокой связывающей активности антител 37GL с рекомбинантно продуцируемыми IL-4Rα человека и макак-крабоедов. Связывание с IL-4Rα клеток HEK-EBNA свидетельствует о том, что антитела связываются с нативным гликозилированным IL-4Rα человека. Поскольку антитела 37GL связываются с нативным гликозилированным IL-4Rα человека, можно предположить, что все антитела, описанные в заявке (например, антитела 1-42), также способны связываться с нативным гликозилированным IL-4Rα человека, т.е. все указанные антитела получены из одного исходного антитела (антитела 1) и таким образом можно считать, что все они связываются с одним и тем же или подобным ему эпитопом IL-4Rα.

Таким образом, согласно конкретным вариантам, связывающие элементы по изобретению способны связываться с гликозилированным hIL-4Rα.

Как показано в примере 4.7 и таблице 4, высокую перекрестную реактивность при связывании с IL-4Rα человека и макак-крабоедов определяют поверхностным плазменным резонансом на характерной панели антител, полученных из антитела 1.

Связывающие элементы по изобретению необязательно специфичны в отношении IL-4Rα по сравнению с другими структурно подобными элементами (например, другими рецепторами интерлейкина) и таким образом связываются с IL-4Rα селективно. Например, связывающие элементы по изобретению могут не давать перекрестную реакцию с любым из IL-13Rα1 или IL-13Rα2 и общей γ-цепью (γс). Указанное свойство можно определить или демонстрировать, например, анализом конкурентного связывания с эпитопом DELFIA, описанном в примере 4.6.

Связывающие элементы по изобретению включают антитела, например антитела человека. Связывающие элементы включают домен VH и/или VL антител. VH домены связывающих элементов также являются объектом изобретения. Каждый из доменов VH и VL содержит участки комплементарности (CDR) и каркасные участки (FR). VH домен включает несколько HCDR, а VL домен включает несколько LCDR. Антитела содержат VH домен, включающий CDR1, CDR2 и CDR3 и каркасные участки. В другом варианте или одновременно антитела также содержат VL домен, включающий CDR1, CDR2 и CDR3 и каркасные участки. Каркасные участки VH или VL домена представляют собой четыре каркасных области, FR1, FR2, FR3 и FR4, чередующиеся с CDR, как показано ниже:

FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4.

Примеры VH и VL доменов антител, FR и CDR по настоящему изобретению приводятся в прилагаемом перечне аминокислотных последовательностей, который также является частью настоящего изобретения. Все аминокислотные последовательности VH и VL, аминокислотные последовательности CDR, наборы CDR и наборы HCDR и наборы LCDR, приведенные в описании заявки, являются объектами и вариантами изобретения. Термин "набор CDR", используемый в описании заявки, включает CDR1, CDR2 и CDR3. Таким образом, набор HCDR обозначает HCDR1, HCDR2 и HCDR3, а набор LCDR обозначает LCDR1, LCDR2 и LCDR3. Если не указано иное, "полный набор CDR" включает HCDR и LCDR. Обычно связывающие элементы по изобретению являются моноклональными антителами.

Другим объектом изобретения являются антитела, включающие VH домен, у которого по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% аминокислотной последовательности идентичны аминокислотной последовательности VH домена любого из антитела 1-42, приведенных в прилагаемом перечне аминокислотных последовательностей, и/или включающие VL домен, у которого по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99% аминокислотной последовательности идентичны аминокислотной последовательности VL домена любого из антитела 1-42, приведенных в прилагаемом перечне аминокислотных последовательностей. Для расчета идентичности двух аминокислотных последовательностей можно использовать программу "MacVector™" (фирма Accelerys).

Связывающие элементы по изобретению могут включать антиген-связывающий участок в составе другого белка, обычно в составе одного или более CDR, например HCDR3 и/или LCDR3, или в наборе CDR, например в составе каркасной белковой структуры, которая описана ниже.

Как подробно описано в разделе Примеры, заявители выделили исходные антитела (антитела 1), содержащие набор CDR, приведенный на фиг.1 (VH домен) и 2 (VL домен). В процессе оптимизации была получена панель клонов антител, включающая клоны 2-20, содержащие аминокислотные последовательности CDR3, полученные из исходного CDR3, и содержащие замены в положениях, указанных на фиг.1 (VH домен) и фиг.2 (VL домен). Таким образом, например, на фиг.1 (а и б) показано, что антитела 2 включают исходные участки HCDR1, HCDR2, LCDR1 и LCDR2 и исходный участок LCDR3, в которых аминокислотный остаток 95 (согласно Kabat) заменен на остаток Q, каждый из аминокислотных остатков 95А, 95В и 96 (согласно Kabat) заменен на остаток Р, а аминокислотный остаток 97 заменен на остаток L, а также содержат исходный участок HCDR3, в котором аминокислотный остаток 101 (согласно Kabat) заменен на остаток Y, а аминокислотный остаток 102 (согласно Kabat) заменен на остаток N.

Описанные в заявке исходные антитела и антитела 2-20 обозначают соответственно антитела, содержащие CDR исходных антител, и антитела, содержащие CDR антител 2-20. Благодаря последующей оптимизации заявители получили панель клонов антител 21-42, содержащих дополнительные замены в VH и VL доменах. Таким образом, например, антитела 21 содержат LCDR1, LCDR2, LCDR3, HCDR1 и HCDR3 антител 20, а также HCDR2 антител 20, в котором аминокислотный остаток 57 заменен на остаток А, а остатки 85 и 87 (в LFW3) заменены на остатки V и F, соответственно.

В заявке описано контрольные связывающие элементы, включающее набор CDR антител 20, см. фиг.3 (VH) и 4 (VL), в котором HCDR1 обозначает SEQ ID NO:193 (остатки по Kabat 31-35), HCDR2 обозначает SEQ I