Бакуловирусные векторы с двойным промотором, включающим в себя промотор позвоночного и промотор бакуловируса, контролирующим иммуногенный слитый ген

Бакуловирусные векторы с двойным промотором, включающим в себя промотор позвоночного и промотор бакуловируса, контролирующим иммуногенный слитый ген

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к новому вектору для переноса, рекомбинантному бакуловирусу, полученному гомологичной рекомбинацией вектора для переноса и бакуловирусной ДНК, и к способам их получения.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к фармацевтическим препаратам (например, вакцинам и профилактическим или терапевтическим лекарственным средствам для лечения инфекционных болезней, таких как малярия и грипп), содержащим рекомбинантный бакуловирус в качестве активного ингредиента.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Бакуловирус применяли в качестве вектора в способах промышленного получения требуемого белка с использованием клеток насекомых. В последние годы было обнаружено, что бакуловирус может вводить чужеродный ген не только в клетки насекомых, но также в клетки млекопитающих, и была выявлена возможность его применения в качестве вектора для введения терапевтического гена. В патентном документе 1 описан рекомбинантный бакуловирусный экспрессирующий вектор, содержащий множество независимых промоторов, включая промотор, полученный из раннего гена бакуловируса, который имеет область ДНК, содержащую ген, кодирующий неструктурный белок вируса, и промотор, полученный из позднего гена бакуловируса, который имеет область ДНК, содержащую ген, кодирующий структурный белок вируса.

В патентном документе 2 раскрыт способ, включающий в себя введение в клетки млекопитающих вирусного вектора, содержащего ДНК организма, отличного от млекопитающего, который содержал множество независимых промоторов, регулируемых так, чтобы экспрессировать требуемый чужеродный ген, связанный с промоторами; и экспрессию чужеродного гена в клетках млекопитающих.

Кроме того, в патентном документе 3 раскрыт способ получения белка способом на основе рекомбинации генов с использованием бакуловируса. Такой способ включает в себя экспрессию слитого гена, полученного связыванием гена gp64 бакуловируса с геном, кодирующим требуемый белок, чтобы получить требуемый белок в слитой с вирусными частицами форме, сбор вирусных частиц, слитых с требуемым белком, и отщепление требуемого белка от вирусных частиц, чтобы собрать белок.

Что касается бакуловирусной системы экспрессии, то в патентом документе 4 описан рекомбинантный бакуловирусный экспрессирующий вектор, имеющий несколько независимых промоторов, содержащий первую последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую регистрируемый маркер, который связан в способной к функционированию форме с первым промотором, который является активным в клетках-хозяевах и неактивным в не соответствующих клетках, и вторую последовательность нуклеиновой кислоты, содержащую чужеродную последовательность нуклеиновой кислоты, которая связана в способной к функционированию форме со вторым промотором, который является активным в не соответствующих клетках.

В патентном документе 5 описано, что рекомбинантный бакуловирусный вектор, экспрессирующий антиген гемагглютинин (HA) вируса гриппа, связанный с промотором CAG, полученным из β-актина цыпленка, оказывает профилактический эффект в отношении инфекции вирусом гриппа и поэтому применим в качестве вакцинного препарата.

В патентном документе 6 раскрыт способ получения бакуловирусного вектора, включающий в себя стадию котрансфекции в клетки насекомых плазмиды, содержащей бакуловирусный промотор и промотор, полученный из клеток млекопитающих, с которым связан ген, кодирующий белок, экспрессируемый на клеточной поверхности, или плазмиды, содержащей два бакуловирусных промотора, с которыми связан ген, кодирующий белок, экспрессируемый на клеточной поверхности.

В патентном документе 7 описано исследование активности против вируса гриппа, т.е. активности, направленной против инфекции вирусом гриппа, рекомбинантного бакуловируса, содержащего кДНК HA вируса гриппа, введенную в промотор CAG, и указано, что не только рекомбинантный бакуловирус, но также бакуловирус дикого типа обладает активностью против вируса гриппа.

Как указано выше, в последние годы разработаны различные рекомбинантные бакуловирусные векторы, и были предприняты многочисленные попытки разработать фармацевтические средства для млекопитающих, содержащие такой рекомбинантный бакуловирусный вектор в качестве активного ингредиента.

В данной области техники требуется разработка фармацевтических препаратов, особенно препаратов вакцин, содержащих в качестве активного ингредиента новый рекомбинантный бакуловирус, который представляет собой рекомбинантный бакуловирусный вектор, имеющий новую структуру и эффективный против малярии, гриппа, туберкулеза и подобных инфекционных болезней, или таких заболеваний, как злокачественная опухоль.

Патентный документ 1: патент Японии No. 3366328. Multiple Promoter Baculovirus Expression System and Defect Particle Products.

Патентный документ 2: WO98/011243, Non-mammalian DNA Virus Having Modified Coating Protein.

Патентный документ 3: JP No. 2002-235236-A, Methods of Producing Proteins.

Патентный документ 4: JP No. 2003-284557-A, Novel Baculovirus-Transfecting Vector and Recombinant Baculovirus for Expression of Foreign Gene.

Патентный документ 5: WO 02/062381, Baculovirus Vector Vaccine.

Патентный документ 6: WO 04/029259, Baculovirus Vector, Method of Producing Baculovirus Vector, and Method of Introducing Gene.

Патентный документ 7: JP No. 2005-15346-A, Baculovirus-containing Anti-viral Agent.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 показывает результаты тестирования экспрессии антигенов вакцины рекомбинантными бакуловирусами согласно настоящему изобретению в клетках насекомых, как описано в примере 3.

Выявление с использованием моноклонального антитела против gp64 (AcV5)

Дорожка 1: AcNPV-WT

Дорожка 2: AcNPV-CAP-PfCSP

Дорожка 3: AcNPV-CAP-HA1/Anhui

Дорожка 4: AcNPV-CAP-HA1/Vietnam.

На фиг.2 (A) показан основанный на Вестерн-блоттинге анализ, показывающий экспрессию гена CSP (PfCSP) малярии человека в вирусных частицах рекомбинантных бакуловирусов, полученных из рекомбинантных векторов для переноса.

Выявление с использованием моноклонального антитела против PfCSP (2A10)

Дорожка 1: AcNPV-CAP-PfCSP

Дорожка 2: AcNPV-CAP-PfCSP/272

Дорожка 3: AcNPV-CAP-PfCSP/467.

На фиг.2 (B) показан основанный на Вестерн-блоттинге анализ, показывающий экспрессию гена H5N1/HA1 в вирусных частицах рекомбинантных бакуловирусов, полученных из рекомбинантных векторов для переноса.

Выявление с использованием поликлонального антитела против H5N1/Vietnam (IT-003-005)

Дорожка 1: AcNPV-WT (лизат клеток)

Дорожка 2: AcNPV-CAP-HA1/Anhui (лизат клеток)

Дорожка 3: AcNPV-CAP-HA1/Vietnam (лизат клеток)

Дорожка 4: AcNPV-WT (вирион)

Дорожка 5: AcNPV-CAP-HA1/Vietnam (вирион)

Дорожка 6: Очищенный антиген H5N1/Anhui (IT-003-0053p).

На фиг.3 показаны клетки HepG2, окрашенные флуоресцентно меченым антителом, и показано, что антиген экспрессировался рекомбинантным бакуловирусом, содержащим слитый ген, состоящий из гена PfMSP1 и гена PfCSP, в клетках HepG2. Результаты, представленные на фиг.3 (A) подтвердили экспрессию антигена PfCSP. Результаты, представленные на фиг.3 (B) подтвердили экспрессию антигена PfMSP-119.

На фиг.4 показаны результаты измерения титров антител, полученных в примере 6.

На фиг.5 показаны векторы для переноса согласно настоящему изобретению.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ПРОБЛЕМЫ, РЕШАЕМЫЕ ИЗОБРЕТЕНИЕМ

Целью настоящего изобретения является получение нового рекомбинантного вектора для переноса, рекомбинантного бакуловируса, полученного в результате гомологичной рекомбинации между рекомбинантным вектором для переноса и бакуловирусной ДНК, и способы его получения. Другой целью настоящего изобретения является получение фармацевтического препарата, в частности, вакцинного препарата, содержащего рекомбинантный бакуловирус в качестве активного ингредиента.

СПОСОБЫ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ

Авторы настоящего изобретения получили вектор для переноса, имеющий новую структуру, способный экспрессировать слитый белок, состоящий из белка, имеющего требуемую иммуногенность, или части такого белка и структурного белка вируса, в клетках насекомых и в клетках позвоночных (в частности, в клетках млекопитающих и птиц); и рекомбинантный бакуловирус, полученный в результате гомологичной рекомбинации вектора для переноса и бакуловирусной ДНК. Используя полученный рекомбинантный бакуловирус, авторы настоящего изобретения осуществили всестороннее исследование фармацевтических препаратов, содержащих в качестве активного ингредиента рекомбинантный бакуловирус, обладающий профилактическим и терапевтическим действием против инфекционных заболеваний. В результате авторы изобретения обнаружили, что полученный рекомбинантный бакуловирус обладает требуемым фармацевтическим действием.

Таким образом, авторы настоящего изобретения получили рекомбинантный вектор для переноса, имеющий новую структуру, рекомбинантный бакуловирус, полученный в результате гомологичной рекомбинации вектора для переноса и бакуловирусной ДНК, и предложили способы их получения, и установили, что рекомбинантный бакуловирус как таковой применим в качестве фармацевтического препарата, обеспечивающего возможность экспрессии белка, обладающего требуемой иммуногенностью, в клетках-мишенях, и в качестве фармацевтического препарата для профилактики инфекционных заболеваний, таких как малярия и грипп.Настоящее изобретение осуществлено на основе указанных открытий.

Настоящее изобретение относится к объектам изобретения, указанным в следующих пунктах 1-22:

Пункт 1. Вектор для переноса, который представляет собой любой из векторов pCAP-PfCSP, pCAP-PfCSP/272, pCAP-PfCSP/467, pCAP-PfCSP(A361E), pCAP-PfCSP(A361E)/272, pCAP-PfCSP(A361E)/467, pCAP-PfCSP-76, pCAP-PfCSP-76/467, pCAP-PfCSP+209, pCAP-PfCSP+209/467, pCAP-PfCSP+76/209, pCAP-PfCSP+76/209/467, pCAP-HA1/Anhui, pCAP-HA1/Anhui/272, pCAP-HA1/Anhui/467, pCAP-HA1/Vietnam, pCAP-HA1/Vietnam/51, pCAP-HA1/Vietnam/101, pCAP-HA1/Vietnam/154, pCAP-HA1/Vietnam/201, pCAP-HA1/Vietnam/272, pCAP-HA1/Vietnam/467, pCAP-AH/345, pCAP-AH/345/467, pCAP-AH/410, pCAP-AH/410/467, pCAP-AH/473, pCAP-AH/473/467, pCAP-AH/520, pCAP-AH/520/467, pCAP-VN/346, pCAP-VN/346/467, pCAP-VN/410, pCAP-VN/410/467, pCAP-VN/473, pCAP-VN/473/467, pCAP-VN/520, pCAP-VN/520/467, pCAP-CO/full, pCAP-CO/full/467, pCAP-CO/19, pCAP-CO/19/467, pCAP-CO/76, pCAP-CO/76/467, pCAP-CO/205, pCAP-CO/205/467, pCA39-HA1/Anhui, pCA64-HA1/Anhui, pCA39-PfCSP(A361E), pCA64-PfCSP(A361E), pCAP-CO/full/VSV, pCAP-CO/19/VSV, pCAP-CO/76/VSV, pCAP-CO/205/VSV, pDual-Pfs25-PfCSP-gp64 и pDual-PfMSP1-PfCSP-gp64.

Пункт 2. Рекомбинантный бакуловирус, который представляет собой любой из бакуловирусов AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui, AcNPV-CA64-HA1/Anhui, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 и AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64.

Пункт 3. Композиция для лечения инфекционных болезней, содержащая рекомбинантный бакуловирус по п.2 в качестве активного ингредиента.

Пункт 4. Композиция для лечения инфекционных болезней, содержащая рекомбинантный бакуловирус по п.2 в качестве активного ингредиента, при этом композицию вводят внутримышечным, респираторным или назальным путем.

Пункт 5. Вакцина, содержащая рекомбинантный бакуловирус по п.2 в качестве активного ингредиента.

Пункт 6. Вакцина, содержащая рекомбинантный бакуловирус по п.3 в качестве активного ингредиента, при этом композицию вводят внутримышечным, респираторным или назальным путем.

Пункт 7. Терапевтическое или профилактическое средство против инфекции вирусом гриппа, содержащее в качестве активного ингредиента любой из AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui и AcNPV-CA64-HA1/Anhui.

Пункт 8. Терапевтическое или профилактическое средство против инфекции вирусом гриппа по п.7, которое вводят внутримышечным, респираторным или назальным путем.

Пункт 9. Вакцина против инфекции вирусом гриппа, содержащая в качестве активного ингредиента любой из AcNPV-CAP-HA1/Anhui, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/272, AcNPV-CAP-HA1/Anhui/467, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/51, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/101, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/154, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/201, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/272, AcNPV-CAP-HA1/Vietnam/467, AcNPV-CAP-AH/345, AcNPV-CAP-AH/345/467, AcNPV-CAP-AH/410, AcNPV-CAP-AH/410/467, AcNPV-CAP-AH/473, AcNPV-CAP-AH/473/467, AcNPV-CAP-AH/520, AcNPV-CAP-AH/520/467, AcNPV-CAP-VN/346, AcNPV-CAP-VN/346/467, AcNPV-CAP-VN/410, AcNPV-CAP-VN/410/467, AcNPV-CAP-VN/473, AcNPV-CAP-VN/473/467, AcNPV-CAP-VN/520, AcNPV-CAP-VN/520/467, AcNPV-CA39-HA1/Anhui и AcNPV-CA64-HA1/Anhui.

Пункт 10. Вакцина против инфекции вирусом гриппа по п.7, которую вводят внутримышечным, респираторным или назальным путем.

Пункт 11. Терапевтическое или профилактическое средство против малярийной инфекции человека, содержащее в качестве активного ингредиента любой из AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 и AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64.

Пункт 12. Терапевтическое или профилактическое средство против малярийной инфекции человека по п.11, которое вводят внутримышечным, респираторным или назальным путем.

Пункт 13. Терапевтическое или профилактическое средство против малярийной инфекции человека, содержащее в качестве активного ингредиента любой из AcNPV-CAP-PfCSP, AcNPV-CAP-PfCSP/272, AcNPV-CAP-PfCSP/467, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/272, AcNPV-CAP-PfCSP(A361E)/467, AcNPV-CAP-PfCSP-76, AcNPV-CAP-PfCSP-76/467, AcNPV-CAP-PfCSP+209, AcNPV-CAP-PfCSP+209/467, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209, AcNPV-CAP-PfCSP+76/209/467, AcNPV-CAP-CO/full, AcNPV-CAP-CO/full/467, AcNPV-CAP-CO/19, AcNPV-CAP-CO/19/467, AcNPV-CAP-CO/76, AcNPV-CAP-CO/76/467, AcNPV-CAP-CO/205, AcNPV-CAP-CO/205/467, AcNPV-CA39-PfCSP(A361E), AcNPV-CA64-PfCSP(A361E), AcNPV-CAP-CO/full/VSV, AcNPV-CAP-CO/19/VSV, AcNPV-CAP-CO/76/VSV, AcNPV-CAP-CO/205/VSV, AcNPV-Dual-Pfs25-PfCSP-gp64 и AcNPV-Dual-PfMSP1-PfCSP-gp64.

Пункт 14. Терапевтическое или профилактическое средство против малярийной инфекции человека по п.13, которое вводят внутримышечным, респираторным или назальным путем.

Пункт 15. Способ профилактики малярийной инфекции или инфекции гриппа или лечения малярии или гриппа, включающий в себя введение субъекту эффективного количества рекомбинантного бакуловируса по п.2, композиции для лечения инфекционных болезней по п.3 или 4, или вакцины по п.5, 6, 9, 10, 13 или 14.

Пункт 16. Способ по п.15, в котором рекомбинантный бакуловирус, композицию или вакцину вводят субъекту в качестве липосомного препарата.

Пункт 17. Способ по п.15, в котором рекомбинантный бакуловирус, композицию или вакцину вводят субъекту внутримышечным, респираторным или назальным путем.

Пункт 18. Способ по п.16, в котором рекомбинантный бакуловирус, композицию или вакцину вводят субъекту внутримышечным, респираторным или назальным путем.

Пункт 19. Способ иммуностимуляции, включающий в себя введение субъекту эффективного количества рекомбинантного бакуловируса по п.2, композиции для лечения инфекционных болезней по п.3 или 4, или вакцины по п.5, 6, 9, 10, 13 или 14.

Пункт 20. Способ по п.19, в котором рекомбинантный бакуловирус, композицию или вакцину вводят субъекту в виде липосомного препарата.

Пункт 21. Способ по п.19, в котором рекомбинантный бакуловирус, композицию или вакцину вводят субъекту внутримышечным, респираторным или назальным путем.

Пункт 22. Способ по п.20, в котором рекомбинантный бакуловирус, композицию или вакцину вводят субъекту внутримышечным, респираторным или назальным путем.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предлагается новый рекомбинантный вектор для переноса, рекомбинантный бакуловирус, полученный в результате гомологичной рекомбинации рекомбинантного вектора для переноса и бакуловирусной ДНК, и способы его получения. Фармацевтические препараты, содержащие рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, применимы в качестве терапевтических или профилактических лекарственных средств для лечения инфекционных болезней, таких как малярия и грипп, или в качестве клеточных лекарственных средств и препаратов вакцин.

НАИЛУЧШИЙ СПОСОБ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сокращенные названия, используемые в настоящем описании для обозначения аминокислот, пептидов, последовательностей оснований, основаны на сокращениях, принятых комиссией ИЮПАК-ИЮБ по биохимической номенклатуре, Eur. J. Biochem., 138: 9 (1984) и «Guideline for Preparing Specifications Including Base Sequences and Amino Acid Sequences» (патентное ведомство), и сокращениях, обычно используемых в данной области техники. В настоящем описании молекула ДНК может включать не только двунитевую ДНК, но также однонитевую ДНК, т.е., смысловую цепь и антисмысловую цепь, составляющие двунитевую ДНК, и не ограничена полной длиной. Полинуклеотид (молекула ДНК), кодирующая иммуногенный чужеродный ген согласно настоящему изобретению, охватывает двунитевую ДНК, содержащую геномную ДНК, однонитевую ДНК (смысловую нить), содержащую кДНК, и однонитевую ДНК (антисмысловую нить), имеющую последовательность, комплементарную смысловой нити, синтетическую ДНК и их фрагменты, если не оговорено особо.

Термины «полинуклеотид» или «молекула ДНК», используемые в настоящем описании, не ограничены функциональной областью и могут включать в себя, по меньшей мере, одну область подавления экспрессии, кодирующую область, лидерную последовательность, экзон и интрон.

Кроме того, примерами полинуклеотида являются РНК и ДНК. Полипептид, содержащий конкретную аминокислотную последовательность, и полинуклеотид, содержащий конкретную последовательность ДНК, включают фрагменты, гомологи, производные и мутанты полинуклеотида.

Примерами мутантов полинуклеотида, например, мутантной ДНК, являются встречающиеся в природе аллельные мутанты; искусственные мутантны; и мутанты, имеющие делецию, замену, присоединение и/или инсерцию. Однако следует понимать, что такие мутанты кодируют полипептиды, обладающие по существу такой же функцией, как и полипептид, кодируемый исходным немутантным полинуклеотидом.

В настоящем изобретении термин «вектор для переноса» относится к плазмиде для получения рекомбинантного бакуловируса, имеющего структуру, в которую включен слитый ген, образованный связыванием, по меньшей мере, одного гена, кодирующего белок, способный быть компонентом вирусных частиц, по меньшей мере, с одним иммуногенным чужеродным геном, ниже двойного промотора, содержащего два связанных промотора, т.е. один промотор позвоночного (например, промотор млекопитающего или промотор птицы) и один бакуловирус промотор.

В одном предпочтительном варианте осуществления изобретения иммуногенный чужеродный ген расположен ниже двойного промотора и выше гена, кодирующего белок, способный быть компонентом вирусных частиц. Рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению применяют в качестве активного ингредиента фармацевтических препаратов или вакцин для позвоночных. Примерами позвоночных являются млекопитающие, такие как человек, крупный рогатый скот, лошади, свиньи, овцы, козы, обезьяны, мыши, собаки и кошки. Примерами птиц являются куры, перепела, гуси, дикие утки, голуби, индейки, цесарки и попугаи.

В одном варианте настоящее изобретение относится к вектору для переноса, содержащему новую структуру, имеющую в своем составе слитый ген из одного иммуногенного чужеродного гена и гена, кодирующего мембранный белок вируса, который может быть экспрессирован в клетках насекомых под контролем двойного промотора, содержащего один промотор позвоночных и один промотор бакуловируса, связанные друг с другом. Совместная трансфекция такого вектора для переноса с бакуловирусной ДНК в клетки насекомых индуцирует гомологичную рекомбинацию и, таким образом, приводит к получению рекомбинантного бакуловируса с включенным в него слитым геном, который экспрессируется под контролем бакуловирусного промотора в клетках насекомых и который может продуцировать слитый белок, способный быть компонентом отпочкованных вирусных частиц.

В настоящем изобретении при введении рекомбинантного бакуловируса позвоночным слитый белок, состоящий из белка, способного быть компонентом отпочкованных вирусных частиц, и иммуногенного белка, по-видимому, функционирует как многокомпонентная вакцина. Кроме того, рекомбинантный бакуловирус, введенный позвоночному, проникает в клетку позвоночного, и в клетке позвоночного с вирусного генома продуцируется слитый антиген с требуемым иммуногенным чужеродным антигеном и функционирует как ДНК-вакцина.

Таким образом, например, в том случае, когда рекомбинантный бакуловирус согласно настоящему изобретению вводят млекопитающему, слитый белок, состоящий из белка, способного быть компонентом вирусных частиц, и иммуногенного белка, презентируется в виде антигена на поверхности вирусных частиц, и слитый белок, состоящий из белка, способного быть компонентом вирусных частиц, и иммуногенного белка, продуцируется в клетке млекопитающего и, по-видимому, функционирует в качестве профилактического или терапевтического средства против инфекционных болезней, таких как вирусная, протозойная и бактериальная инфекция, благодаря своему иммуностимулирующему действию.

Бакуловирусная ДНК, трансфицируемая совместно с вектором для переноса, может представлять собой бакуловирусную ДНК дикого типа, мутантную или рекомбинантную бакуловирусную ДНК. Примерами клеток-хозяев, подвергаемых котрансфекции, являются клетки насекомых, такие как клетки Spodoptera frugiperda.

В настоящем изобретении термин «иммуногенный чужеродный ген» относится к гену, кодирующему аминокислотную последовательность антигенного белка, используемого в качестве иммуногена в иммунотерапии, такой как вакцинная терапия, для профилактики и лечения инфекционных болезней, таких как малярия и грипп.Конкретными примерами являются гены, кодирующие аминокислотные последовательности белков, таких как малярийный антиген и антиген вируса гриппа.

«Чужеродный» ген в используемом в настоящем описании смысле относится к гену, вводимому извне. Даже если такой же ген присутствует в клетке, ген, вводимый извне, называют «чужеродным» геном.

В настоящем изобретении ген, кодирующий аминокислотную последовательность белка, используемого в качестве иммуногена, особым образом не ограничен, при условии, что ген способен кодировать аминокислотную последовательность антигенного белка, обладающего иммуногенностью, направленной против вещества, которое вызывает заболевания, такие как инфекционные болезни. Примеры генов, кодирующих аминокислотную последовательность антигенного белка, обладающего иммуногенностью, приведены ниже.

Примеры генов, кодирующих аминокислотную последовательность малярийного антигена, включают гены, кодирующие аминокислотные последовательности поверхностного антигена спорозоита CSP (белок циркумспорозоита) малярийных паразитов, поверхностного мембранного белка мерозоита MSP1 (поверхностный белок мерозоита 1), малярийного S-антигена, секретируемого из эритроцитов, инфицированных возбудителем малярии, белка PfEMP1, присутствующего в выростах эритроцитов, инфицированных возбудителем малярии, белка SERA, белка TRAMP, белка AMA1 и подобных белков.

Примерами генов, кодирующих аминокислотные последовательности антигенов вируса гриппа, являются гены, кодирующие аминокислотные последовательности антигена HA (антиген гемагглютинина) антигена NA (антиген нейраминидазы), антигена M2 (антиген белка матрикса), антигена NP (нуклеопротеидный антиген) и подобных белков.

Среди генов позвоночных примерами генов млекопитающих являются гены, кодирующие аминокислотные последовательности антигенных белков инфекционных болезней человека, крупного рогатого скота, лошадей, свиней, овец, обезьян, мышей, собак и кошек. Примерами генов птиц являются гены антигенов (например, антигена HA гриппа птиц) инфекционных болезней кур, диких уток, голубей, индеек, цесарок и попугаев.

Гены патогенов, об ассоциации которых с инфекционными болезнями млекопитающих и птиц, которые указаны выше, сообщалось ранее, легко доступны от организаций, в которых хранятся зарегистрированные опубликованные данные о генах патогенов, таких как Genbank.

В настоящем изобретении предлагается вектор для переноса, содержащий такой иммуногенный чужеродный ген, и рекомбинантный бакуловирус, полученный в результате гомологичной рекомбинации вектора для переноса. Кроме того, в настоящем изобретении предлагается фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента рекомбинантный бакуловирус, имеющий иммуногенный чужеродный ген, и вакцинный препарат, содержащий фармацевтическую композицию.

Бакуловирус, используемый в настоящем изобретении, относится к патогенным вирусам насекомых, которые вызывают инфекцию насекомых и которые составляют одну группу (Baculoviridae) ДНК-вирусов, имеющих циклическую двунитевую ДНК в качестве гена. Среди таких вирусов одна группа вирусов, называемых вирусами ядерного полиэдроза (NPV), продуцируют тело включения, называемое полиэдром, в ядре инфекционных клеток в поздней фазе инфекции. Даже если чужеродный ген, который необходимо экспрессировать, встроен на участке гена полиэдрина, вирусная инфекция и рост осуществляются в достаточной степени для получения большого количества требуемого продукта чужеродного гена. Поэтому в последние годы такой вирус использовали для получения требуемых белков.

Примерами бакуловирусов, используемых в настоящем изобретении, являются вирус ядерного полиэдроза Autographa californica: AcNPV, вирус ядерного полиэдроза Bombyx mori: BmNPV, вирус ядерного полиэдроза Orgyia pseudotsugata: OpNPV, и вирус ядерного полиэдроза Lymantria disper: LdNPV.

Бакуловирусная ДНК может представлять собой любую ДНК, которая может подвергаться гомологичной рекомбинации с вектором для переноса согласно настоящему изобретению. Более конкретно вирусный ген в бакуловирусной ДНК, который может подвергаться гомологичной рекомбинации с вектором для переноса согласно настоящему изобретению, имеет размер до 130 т.п.н., и в него может быть встроен иммуногенный чужеродный ген длиной 15 т.п.н. или более. Поскольку бакуловирусный ген сам по себе вряд ли экспрессируется в клетках позвоночных, то едва ли существует необходимость учитывать его цитотоксичность. Таким образом, полагают, что он не индуцирует опасного иммунного ответа.

(1) Вектор для переноса и получение вектора для переноса согласно настоящему изобретению

Получение ДНК иммуногенного чужеродного гена

ДНК иммуногенного чужеродного гена, которую можно сливать с вирусным геном, являющимся одним из компонентов бакуловирусного вектора для переноса, легко можно продуцировать или получить в результате синтеза на основании информации о последовательности нуклеиновой кислоты полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность антигенного белка, имеющего требуемую иммуногенность, описанного в настоящей публикации, или в результате непосредственного синтеза ДНК, соответствующей последовательности нуклеиновой кислоты кодирующей области иммуногенного чужеродного гена, на основании информации о последовательности нуклеиновой кислоты иммуногенного чужеродного гена (способ химического синтеза ДНК). Для такого получения можно использовать общие способы конструирования гена (смотри, например, «Molecular Cloning» 2d Ed, Cold Spring Harbor Lab. Press (1989); Zoku Seikagaku Jikken Kouza, «Idenshi Kenkyuho I, II, III», edited by Japanese Biochemistry Society, 1986).

Примерами способов синтеза ДНК являются способы химического синтеза, такие как фосфаттриэфирный способ и фосфатамидитный способ (J. Am. Chem. Soc., 89, 4801 (1967); там же, 91, 3350 (1969); Science, 150, 178 (1968); Tetrahedron Lett., 22, 1859 (1981); там же, 24, 245 (1983)) и способы на основе их сочетания. ДНК также может быть химически синтезирована фосфорамидитным способом или триэфирным способом или синтезирована с использованием коммерчески доступного автоматического синтезатора олигонуклеотидов. Двунитевой фрагмент может быть получен в результате синтеза комплементарной нити и отжига комплементарной нити с химически синтезированной первой нитью в подходящих условиях, или при добавлении комплементарной нити с подходящими последовательностями праймеров к химически синтезированной первой нити с использованием ДНК-полимеразы.

Конкретными примерами ДНК иммуногенного чужеродного гена, получаемой в настоящем изобретении, являются ДНК, содержащие последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность антигенного белка возбудителя малярии, и последовательность ДНК, кодирующую аминокислотную последовательность антигенного белка вируса гриппа.

ДНК, применяемая в настоящем изобретении, не ограничена полноразмерной последовательностью ДНК, кодирующей аминокислотную последовательность полипептида антигенного белка, обладающего иммуногенностью, и может представлять собой последовательность ДНК, кодирующую его частичную последовательность, при условии, что белок с аминокислотной последовательностью, кодируемой такой последовательностью ДНК, обладает иммуногенностью.

ДНК иммуногенного чужеродного гена, используемая в настоящем изобретении, не ограничена молекулами ДНК, имеющими такую конкретную последовательность ДНК, и может представлять собой молекулы ДНК, имеющие последовательность ДНК, получаемую посредством соответствующей селекции кодонов для каждого аминокислотного остатка. Выбор кодонов можно осуществлять стандартным способом, например, учитывая частоту использования кодонов у хозяина (Nucleic Acids Res., 9, 43 (1981)).

ДНК иммуногенного чужеродного гена, используемая в настоящем изобретении, может быть получена способами генной инженерии, более конкретно с помощью получения библиотеки кДНК из подходящего источника, который экспрессирует ДНК иммуногенного чужеродного гена, стандартным способом, и отбора требуемого клона из библиотеки с использованием соответствующего зонда или антитела против экспрессируемого продукта, которое специфично по отношению к иммуногенному чужеродному гену (смотри, например, Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 78, 6613 (1981); Science, 222, 778 (1983)).

Примерами источника геномной ДНК являются различные клетки, ткани и полученные из них культивируемые клетки, которые экспрессируют ДНК иммуногенного чужеродного гена. Особенно предпочтительны экстракты эритроцитов, инфицированных малярийными паразитами, и экстракты клеток, инфицированных вирусами гриппа. Экстракцию и разделение суммарной ДНК и РНК из источника, разделение и очистку мРНК и получение и клонирование кДНК можно осуществлять стандартными способами.

Как описано выше, ДНК иммуногенного чужеродного гена может быть получена с использованием библиотеки кДНК для каждого иммуногена, полученной в результате экстракции, разделения и очистки мРНК иммуногенной ткани или клеток из указанного выше экстракта. ДНК иммуногенного чужеродного гена также может быть получена с использованием фаговой библиотеки, получаемой экстракцией мРНК каждого иммуногена, добавлением поли-A к РНК, сбором поли A-РНК, получением кДНК с использованием обратной транскриптазы, добавлением сайтов для ферментов рестрикции к обоим концам кДНК и включением кДНК в фаг.

Способ скрининга ДНК иммуногенного чужеродного гена из библиотеки кДНК особым образом не ограничен и может быть осуществлен обычным способом. Конкретными примерами таких способов являются: способ отбора соответствующего клона кДНК в результате иммунологического скрининга с использованием специфичного антигена (например, противомалярийное антитело, антитело против вируса гриппа и т.д.) против белка, продуцируемого кДНК; способ гибридизации на бляшках с использованием зонда, избирательно связывающегося с последовательностью ДНК-мишенью; способ гибридизации колоний; и их сочетания.

Зонд, используемый в таких способах гибридизации, обычно представляет собой фрагмент ДНК, химически синтезированный на основании информации о последовательности ДНК иммуногенного чужеродного гена. Уже полученные последовательности ДНК иммуногенного чужеродного гена или их фрагменты также успешно можно использовать в качестве зонда. Смысловой праймер и антисмысловой праймер, сконструированные на основе информации о последовательности ДНК иммуногенного чужеродного гена, также могут быть использованы в качестве зонда для скрининга.

ДНК (нуклеотиды), используемая в качестве зонда, представляет собой часть ДНК (нуклеотидов), соответствующей последовательности ДНК иммуногенного чужеродного гена. ДНК (нуклеотиды) имеет, по меньшей мере, 15 последовательных нуклеотидов ДНК, предпочтительно, по меньшей мере, 20 последовательных нуклеотидов ДНК и более предпочтительно, по меньшей мере, 30 последовательных нуклеотидов последовательности ДНК. Позитивный клон для получения ДНК, который описан выше, как таковой также может быть использован в качестве зонда.

Чтобы получить ДНК иммуногенного чужеродного гена, предпочтительно используют способ ДНК/РНК-амплификации с помощью ПЦР (Science, 230, 1350 (1985)). В частности, когда из библиотеки трудно получить полноразмерную кДНК, предпочтительно используют способ RACE (быструю амплификацию концов кДНК; Jikken Igaku 12(6), 35(1994)), в частности, способ 5'-RACE (M. A. Frohman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 8, 8998(1988)).

Праймеры, используемые для ПЦР, могут быть сконструированы на основе информации о последовательности ДНК иммуногенного чужеродного гена и синтезированы стандартными способами. В качестве праймеров также можно использовать части ДНК (промотор/праймер SP6 и терминатор/праймер T7), добавляемые к обоим концам плазмидного вектора, содержащего ДНК иммуногенного чужеродного гена, включенную в такой вектор, как описано в примерах ниже.

Выделение/очистку фрагмента ДНК/РНК, амплифицированного в ПЦР, можно осуществить стандартными способами, например, гель-электрофорезом.

Последовательность ДНК иммуногенного чужеродного гена, полученная таким образом, или различных фрагментов такой ДНК, может быть определена стандартными способами, например, способом с использованием дидезоксинуклеотидов (Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 74, 5463(1977)) или способом Максама-Гильерта (Methods in Enzymology, 65, 499(1980)), или просто с использованием коммерчески доступного набора для секвенирования.

Ген, кодирующий аминокислоты белка, который может быть компонентом вирусных частиц, может представлять собой любой ген, который может кодировать белок, который образует слитый белок с белком иммуногенного чужеродного гена, как описано выше, в клетках-мишенях, и может быть экспрессирован в виде белка, который может быть компонентом вирусных частиц в клетках насекомых.

Примерами гена, кодирующего аминокислоты белка, который может быть компонентом вирусных частиц, являются гены белка gp64 (GenBank, номер доступа L22858), гликопротеина G вируса везикулярного стоматита (VSVG: GenBank, номер доступа J02428), гликопротеина вируса простого герпеса (KOS: GenBank, номер доступа K01760), gp120 вируса иммунодефицита человека типа I (GenBank, номер доступа U47783), мембранного гликопротеина респираторно-синцитиального вируса человека (GenBank, номер доступа M86651), белка гемагглютинина вируса гриппа A (GenBank, номер доступа U38242) и гены белков оболочки вирусов, близкородственных бакуловирусу. В настоящем изобретении предпочтительно можно использовать ген gp64, описанный в примерах ниже.

ДНК гена, кодирующего аминокислоты белка, который может быть компонентом вирусных частиц, может быть легко продуцирован или получен в результате синтеза на основании информации о последовательности нуклеиновой кислоты полинуклеотида, кодирующего аминокислотную последовательность полипептида гена, кодирующего аминокислоты белка-мишени, который может быть компонентом вирусных частиц; или в результате непосредственного синтеза ДНК, соответствующей нуклеотидной последовательности, кодирующей аминокислотную последовательность, на основании информации об аминокислотной последовательности полипептида гена, кодирующего аминокислоты белка, который может быть компонентом вирусных частиц (химический синтез ДНК), как и в случае получения ДНК иммуногенного чужеродного гена.

Последовательность ДНК, соответствующая последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей аминокислоты белка, который может быть компонентом вирусных