Иммунологические анализы активности ботулинического токсина серотипа а

Иммунологические анализы активности ботулинического токсина серотипа а

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Текст описания приведен в факсимильном виде

1. Композиция для продукции антител α-SNAP-25, которые могут связываться с эпитопом, содержащим С-конец (карбоксильный) на остатке P₁ расщепляемой связи сайта расщепления BoNT/A продукта расщепления SNAP-25, содержащая носитель, гибкий линкер и антиген SNAP-25, где гибкий линкер содержит по меньшей мере три аминокислоты, и антиген SNAP-25 содержит аминокислотную последовательность, приведенную на SEQ ID NO:148.

2. Композиция по п.2, где аминокислотная последовательность гибкого линкера и антигена SNAP-25 представляет собой аминокислотную последовательность, приведенную на SEQ ID NO:38.

3. Выделенное антитело α-SNAP-25,где выделенное антитело α-SNAP-25 связывается с эпитопом, содержащим C-концевой глутамин расщепляемой связи сайта расщепления BoNT/A продукта расщепления SNAP-25;где антитело a-SNAP-25 имеет константу скорости ассоциации для эпитопа, не содержащего C-концевой глутамин расщепляемой связи сайта расщепления BoNT/A продукта расщепления SNAP-25, составляющую менее 1·10¹ M^-1 с¹; и где антитело α-SNAP-25 имеет равновесную константу диссоциации для эпитопа, составляющую менее 0,450 нМ.

4. Выделенное антитело α-SNAP-25 по п.3, где эпитоп представляет собой аминокислотную последовательность, приведенную на SEQ ID NO:32.

5. Выделенное антитело α-SNAP-25, связывающееся с эпитопом, содержащим C-концевой глутамин расщепляемой связи сайта расщепления BoNT/A продукта расщепления SNAP-25, содержащее:а. вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную на SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:80 или SEQ ID NO:82; иб. вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную на SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90 или SEQ ID NO:92.

6. Выделенное антитело α-SNAP-25, связывающееся с эпитопом, содержащим C-концевой глутамин расщепляемой связи сайта расщепления BoNT/A продукта расщепления SNAP-25, содержащее:а. вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную на SEQ ID NO:93, SEQ ID NO:121 или SEQ ID NO:100; иб. вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, приведенную на SEQ ID NO:105, SEQ ID NO:110 или SEQ ID NO:115.

7. Выделенное антитело α-SNAP-25, связывающееся с эпитопом, содержащим C-концевой глутамин расщепляемой связи сайта расщепления BoNT/A продукта расщепления SNAP-25, содержащее по меньшей мере V_H CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную на SEQ ID NO:100, V_H CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную на SEQ ID NO:101 или V_H CDR3, имеющий аминокислотную последовательность, приведенную на SEQ ID NO:102.

8. Способ обнаружения активности BoNT/A, включающий стадии:а. обработки клетки из стабильной клеточной линии образцом, содержащим BoNT/A, где клетка из стабильной клеточной линии чувствительна к интоксикации BoNT/A в концентрации BoNT/A приблизительно 500 пМ или менее;б. выделения из обработанной клетки компонента SNAP-25, содержащего продукт расщепления SNAP-25, имеющий С-концевой глутамин расщепляемой связи сайта расщепления BoNT/A;в. приведения в контакт компонента SNAP-25 с антителом α-SNAP-25, связанным с твердофазным носителем,где антитело α-SNAP-25 связывается с эпитопом, содержащим C-концевой глутамин расщепляемой связи сайта расщепления BoNT/A продукта расщепления SNAP-25, где антитело α-SNAP-25 имеет константу скорости ассоциации для эпитопа из SNAP-25, не содержащего C-концевой глутамин расщепляемой связи сайта расщепления BoNT/A продукта расщепления SNAP-25, составляющую менее 1·10¹ M^-1 c^-1; и антитело α-SNAP-25 имеет равновесную константу диссоциации для эпитопа, составляющую мене 0,450 нМ;г.обнаружения наличия комплекса антиген-антитело, содержащего антитело α-SNAP-25 и продукт расщепления SNAP-25, имеющий C-концевой глутамин расщепляемой связи сайта расщепления BoNT/A;где обнаружение при помощи комплекса антиген-антитело является показателем активности BoNT/A.

9. Способ по п.8, где продукт расщепления SNAP-25 представляет собой SNAP-25₁₉₇.

10. Способ по п.8, где присутствие комплекса антиген-антитело обнаруживают с использованием сэндвич ИФА.

11. Способ по п.8, где способ имеет отношение сигнала к шуму на нижней асимптоте по меньшей мере 3:1 и отношение сигнала к шуму на верхней асимптоте по меньшей мере 10:1.

12. Способ по п.8, где образец содержит максимально 100 пМ BoNT/A.

13. Способ по п.8, где клетка из стабильной клеточной линии чувствительна к интоксикации BoNT/A в концентрации BoNT/A приблизительно 100 пМ или менее.

14. Способ по п.8, где способ осуществляют в моноплексном варианте или мультиплексном варианте.

15. Способ определения иммунорезистентности к BoNT/A у млекопитающего, включающий стадии:а. добавления BoNT/A к тестируемому образцу, полученному у млекопитающего, тестируемого на наличие или отсутствие антител, нейтрализующих α-BoNT/A;б. обработки клетки из стабильной клеточной линии тестируемым образцом, где клетка из стабильной клеточной линии чувствительна к интоксикации BoNT/A;в. выделения из обработанных клеток компонента SNAP-25, содержащего продукт расщепления SNAP-25, имеющего C-концевой глутамин расщепляемой связи сайта расщепления BoNT/A;г. приведения в контакт компонента SNAP-25 с антителом α-SNAP-25, связанным с твердофазным носителем;где антитело α-SNAP-25 связывается с эпитопом, содержащим C-концевой глутамин расщепляемой связи сайта расщепления BoNT/A продукта расщепления SNAP-25, где антитело α-SNAP-25 имеет константу скорости ассоциации для эпитопа из SNAP-25, не содержащего С-концевой глутамин расщепляемой связи сайта расщепления BoNT/A продукта расщепления SNAP-25, составляющую менее 1·10¹ M^-1 с^-1; и антитело α-SNAP-25 имеет равновесную константу диссоциации для эпитопа, составляющую менее 0,450 нМ;д. обнаружения наличия комплекса антиген-антитело, содержащего антитело α-SNAP-25 и продукт расщепления SNAP-25, имеющий C-концевой глутамин расщепляемой связи сайта расщепления BoNT/A;е. повторения стадий б-д с отрицательным контрольным образцом вместо тестируемого образца, где отрицательный контрольный образец содержит BoNT/A и сыворотку, о которой известно, что она не содержит нейтрализующие антитела α-BoNT/A; иж. сравнения количества комплекса антиген-антитело, обнаруженного на стадии д, с количеством комплекса антиген-антитело, обнаруженного на стадии е,где обнаружение меньшего количества комплекса антиген-антитело, обнаруженного на стадии д, по сравнению с количеством комплекса антиген-антитело, обнаруженного на стадии е, является показателем присутствия нейтрализующих антител α-BoNT/A.