Консорциум бифидобактерий для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных добавок к пище, предназначенных для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта детей в возрасте до 3-х лет, и способ его получения, биологически активная добавка к пище для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта детей в возрасте до 3-х лет и бактериальный препарат для лечения дисбиотических состояний желудочно-кишечного тракта детей в возрасте до 3-х лет

Консорциум бифидобактерий для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных добавок к пище, предназначенных для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта детей в возрасте до 3-х лет, и способ его получения, биологически активная добавка к пище для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта детей в возрасте до 3-х лет и бактериальный препарат для лечения дисбиотических состояний желудочно-кишечного тракта детей в возрасте до 3-х лет

Реферат

Изобретение относится к медицине и биотехнологии и может быть использовано для приготовления лечебно-профилактических средств пробиотической направленности, предназначенных для коррекции дисбиотических нарушений микрофлоры желудочно-кишечного тракта и поддержания ее колонизационной резистентности у детей в возрасте от рождения до 3-х лет. Средства для профилактики и лечения конструируются преимущественно на основе двух групп микроорганизмов - бифидобактерий и лактобацилл. Бифидобактерий являются наиболее значимыми представителями микрофлоры человеческого организма - как по удельному весу в составе микробиоценоза, так и по их многофункциональной роли в поддержании гомеостаза организма. У детей на грудном вскармливании они составляют практически 100% микрофлоры толстой кишки. Бифидобактерий оказывают положительное воздействие на становление систем пищеварения, иммунитета, кроветворения ребенка [1, 2, 3]. Бифидобактерий обеспечивают колонизационную резистентность в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов; обладают иммуномодулирующим действием; синтезируют аминокислоты, витамины, летучие жирные кислоты, ферменты, участвующие в процессах пищеварения и обмена веществ; способствуют усвоению железа, кальция, поддержанию водно-солевого баланса [4, 5]. Частичная или полная элиминация бифидобактерий приводит к угнетению иммунных сил организма, развитию дисбиоза.

Многофакторное позитивное воздействие на организм ребенка позволяет рассматривать бифидобактерий как эффективный биокорректор и основу для создания препаратов, обладающих регулирующим и стимулирующим воздействием на организм.

В России традиционным подходом к бактериотерапии является назначение больным препаратов на основе культур штаммов бифидобактерий с доказанным пробиотическим действием преимущественно в виде монокультур штаммов Bifidobacterium bifidum 1, В. bifidum 791, B.bifidum ЛВА-3, B.longum B379M, B.adolescentis MC-42. Это, прежде всего, широко применяющийся лечебный препарат "Бифидумбактерин" [6].

При этом следует отметить, что в микробиоценозе кишечника человека бифидобактерий представлены одновременно многими видами - как отдельными, так и в ассоциациях [7]. Это позволяет предположить, что введение в состав пробиотических препаратов сразу нескольких видов бифидобактерий будет способствовать повышению их лечебной и профилактической эффективности.

Подобный подход предлагается в Российском патенте [8], касающемся консорциума на основе штаммов бифидобактерий для коррекции микрофлоры ЖКТ у детей в возрасте от 3 месяцев до 3-х лет, биопрепарата на его основе и БАДа к пище.

Вместе с тем, указанный консорциум не учитывает, что рациональный подход к конструированию и применению новых средств коррекции микрофлоры должен основываться на таком явлении, как аутогенная сукцессия - последовательность смены биоценозов в определенной экологической нише [9, 10]. В ходе этого процесса в видовом сообществе происходит последовательное вытеснение одних видов другими вследствие их биоэкологических преимуществ в определенных условиях. При этом образуется так называемый сукцессионный ряд с образованием конечного -устойчивого биоценоза. Все биоценозы в живой природе развиваются по законам сукцессии. Что касается микроэкологии человеческого организма, данная закономерность прослеживается в смене видового состава бифидофлоры в процессе онтогенеза, совпадающей с критическими периодами развития в детском и подростковом возрасте: становлением иммунной и ферментативной систем, изменением гормонального фона, сменой пищевого рациона. В то же время, видовой состав бифидофлоры взрослых людей относительно стабилен [11, 12].

Таким образом, препараты должны представлять собой ассоциации доминирующих микроорганизмов, которые максимально приближены по составу к естественному микробиоценозу желудочно-кишечного тракта человека в определенный возрастной период. Это является обоснованным подходом, обеспечивающим индивидуализацию бактериотерапии и повышение ее эффективности, способствуя устойчивой локализации или новому заселению биотопа теми видами бифидобактерий, которые преобладают в микробиоценозе конкретного человека.

В настоящее время для изучения таксономии представителей микробиоты, в том числе бифидобактерий и лактобацилл, разработаны и широко применяются различные молекулярно-генетические методы, включая секвенирование, мультилокусное генотипирование и другие, что существенно пополнило наши представления о видовом многообразии этих бактерий, позволило реклассифицировать известные и выявить новые виды [13, 14]. Это тесным образом связано с разработкой новых пробиотических препаратов, обладающих иммуномодулирующим действием, широким набором свойств, определяющих метаболическую и антагонистическую активность.

Изучение видового состава бифидофлоры детей в возрасте до 3 лет на основе амплификации и секвенирования фрагментов двух генов: 16S рибосомальной РНК (16S) и трансальдолазы (tal) показало, что виды B.infantis и В. breve, которые ранее считались постоянными обитателями желудочно-кишечного тракта ребенка, в численном отношении уступают такому виду, как B.pseudocatenulatum (10% и 17%) [15]. Вид B.bifidum остается преобладающим в микробиоценозе ребенка. Постоянно и в высоком процентном соотношении к другим видам в последние годы присутствует вид B.longum [16]. Вместе с тем, вид B.pseudocatenulatum, по мнению ряда авторов [17], ассоциируется с атопической экземой у детей. Это касается также вида B.animalis [18]. Reiter [19] причисляет их к подвидам B.adolescentis, который нехарактерен для микробиоценоза детей. Такие виды нефизиологичны для детей и не могут быть использованы в составе средств коррекции микрофлоры данной возрастной группы.

Представленные данные убедительно показывают, что для эффективной коррекции дисбиотических нарушений микробиоценоза детей данной возрастной группы в состав препарата должны входить штаммы с доказанным пробиотическим эффектом и в видовом отношении комплементарных бифидофлоре детей до 3-х лет. Важное значение имеет включение в состав средств коррекции микрофлоры штаммов, выделенных от современных детей.

Это относится к всесторонне изученным и запатентованным штаммам бифидобактерий, выделенным от здоровых детей на грудном вскармливании: штамм В.breve OV-12 [20], штамм В.bifidum OV-19 [21]. Штамм В. breve OV-12 обладает более высокой антагонистической активностью к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, чем штамм В.breve 79-88. Патент РФ №2373274 на штамм В.breve OV-12 отмечен дипломом, как вошедший в 100 лучших изобретений 2011 года под номером 39.

Штамм В.bifidum OV-19, помимо пробиотических свойств, обладает устойчивым генотипом, в отличие от штамма В.Bifidum 1, который оказался природным рекомбинантом, состоящим из двух клонов: В.bifidum и B.breve.

Задачей настоящего изобретения является создание консорциума бифидобактерий, по составу максимально приближенного к микробиоценозу детей в возрасте до 3-х лет, а также разработка способа его получения, учитывающего биосовместимость штаммов в процессе культивирования и при дальнейшем хранении.

Техническим результатом настоящего изобретения является тот факт, что заявляемый консорциум является высокотехнологичным, накапливает биомассу на питательных средах в короткие сроки с высокой концентрацией пробиотических микроорганизмов, обладает кислотообразующими и антагонистическими свойствами в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры. Синергидный эффект совместного использования штаммов в консорциуме проявляется в повышении всех перечисленных свойств по сравнению с отдельными штаммами.

Предлагаемый консорциум имеет следующий видовой состав.

Консорциум бифидобактерий для препаратов и БАД, предназначенных для для детей от рождения до 3-х лет:

1. Bifidobacterium bifidum OV-19 - ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского

№216, выделен из содержимого кишечника здорового ребенка, RU 2375444.

2. Bifidobacterium B.bifidum 791 - ВНИИгенетика в ЦМПМ №В-3300, ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №80, выделен из содержимого кишечника здорового ребенка.

3. Bifidobacterium longum B379M - ВНИИгенетика в ЦМПМ №В-2000, ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №79, выделен из содержимого кишечника здорового человека.

4. Bifidobacterium breve OV-12 - ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №217, выделен из содержимого кишечника здорового ребенка, RU 2373274.

5. Bifidobacterium infantis 73-15 - ГКНМ МНИИЭМ им. Г.Н.Габричевского №155, выделен из содержимого кишечника здорового ребенка, RU 2112034.

Задачей настоящего изобретения является также разработка определенной схемы совместного культивирования отдельных штаммов для получения консорциума.

Техническим результатом предлагаемой схемы культивирования отдельных штаммов для получения консорциума является отсутствие взаимного ингибирования штаммов и расширение спектра ферментативной и антагонистической активности.

Способ получения консорциума основан на предварительном изучении и подборе для совместного культивирования штаммов по принципу биосовместимости и с учетом кинетики роста каждого из них.

Алгоритмом к созданию консорциума бифидобактерий является совместное культивирование входящих в него штаммов с учетом длительности экспоненциальной фазы роста каждого из них, на основании чего определяется временная точка засева питательной среды при поэтапном внесении инокулятов монокультур.

Для этого подбирают строго количественное соотношение посевного материала каждого из штаммов. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию ОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток бифидобактерий.

Посев каждой из культур в ферментер, по 2% к объему среды культивирования, проводят поэтапно, с периодичностью в 30 минут, коррегируя рН культуральной жидкости 20% NaOH перед засевом нового штамма до 6,8. Очередность засева зависит от длительности экспоненциальной фазы роста каждого из штаммов и в данном консорциуме является следующей:

1) - Bifidobacterium infantis 73-15 - 2%;

2) - Bijidobacterium bifidum 791 - 2%;

3) - Bifidobacterium breve OV-2 - 2%;

4) - Bifidobacterium bifidum OV-19 - 2%;

5) - Bifidobacterium longum B379M - 2%.

Процесс длится 10-12 часов; рН конечного продукта составляет 5,1-5,5.

Культурально-морфологические признаки консорциума.

Клетки представляют Грам+ полиморфные палочки, расположенные преимущественно в виде скоплений; в стационарной фазе роста часто отмечаются клетки с раздвоениями на концах или булавовидными утолщениями.

При выращивании в ферментере в экспоненциальной фазе роста при микроскопии культура имеет вид ровных палочек, расположенных цепочками или скоплениями.

В полужидких питательных средах биомасса консорциума бифидобактерий растет по всему объему питательной среды, кроме зоны аэробиоза. Морфология колоний неоднородна и зависит от входящих в консорциум штаммов, сохраняя признаки каждого из них в совокупной культуре.

Физиолого-биохимические признаки микроорганизмов, входящих в консорциум.

Облигатные анаэробы. Оптимальная температура выращивания составляет 37,5-38°С, рН питательных сред 7,2-7,4. Каталазу не образуют, желатин не разжижают, газообразование отсутствует. Сбраживают глюкозу с образованием кислоты без образования газа, закисляя среду выращивания до рН 4,3-5,1.

Сравнительные данные культивирования отдельных штаммов и их консорциума показывают, что при совместном культивировании при предложенной схеме внесения посевного материала не происходит взаимного ингибирования культур (таблица 1).

Таблица 1
Сравнительные данные культивирования монокультур и консорциума бифидобактерий
Наименование культуры	совместное культивирование	раздельное культивирование
	Число КОЕ/ мл	°T	Число КОЕ/ мл	°T
В. bifidum OV-19	1,8±0,2×109	-	1,9±10,2×109	100°
В. bifidum 791	1,5±0,3×109		1,8±0,1×109	100°
B.longum B379M	1,4±0,2×109		1,6±0,3×109	120°
В. breve OV-12	1,6±0,4×109		2,0±0,16×109	110°
В. infantis 73-15	1,1±0,3×109		0,8±0,2×109	110°
Консорциум	7,4±0,6×109	160°	-

Консорциум культивируют при 37°С при периодическом перемешивании в течение 8-10 часов; рН культуральной жидкости после окончания процесса составляет 3,9-4,3.

Консорциум активно размножается как на средах, принятых в производстве, со стабильно высокими показателями КОЕ/мл пробиотических микроорганизмов и продуцируемых органических кислот (таблица 2).

Таблица 2
Результаты культивирования консорциума на разных питательных средах
Среда выращивания	Консорциум бифидобактерий
Число КОЕ/мл	°T
Блаурокка	8,4±0,2×109	140°
Гидролизатно-молочная	7,2±0,6×109	190°
Среда для культивирования бифидобактерий согласно изобретению	9,1±0,3×109	180°

Как видно из результатов, представленных в таблицах 1 и 2, не происходит взаимного ингибирования штаммов. При этом отмечается тенденция к синергидному эффекту.

Наиболее перспективной в производстве препаратов и БАД для детей младшего возраста является гидролизатно-молочная среда. В настоящее время среди детей широко распространена непереносимость коровьего молока. Данная среда гипоаллергенна, так как ее основой является гидролизат молока, состоящий из низкомолекулярных пептидов и аминокислот, которые легко усваиваются детским организмом. Среда, изготовленная на основе гидролизата молока, имеет следующий состав (в расчете на 100 л).

Таблица 3
Состав гидролизатно-молочной среды
Гидролизат молока	50 л
Цистеин солянокислый	20 г
Лактоза	1000 г
Пептон ферментативный	200 г
Агар-агар микробиологический	100 г
Хлористый натрий	400 г
Вода водопроводная очищенная	до 100 л

Среда проста в приготовлении, экономически выгодна; вместе с тем, как видно из результатов, представленных в таблице 2, по ростовым свойствам уступает остальным средам.

Для устранения данного недостатка в нее были дополнительно включены добавки, стимулирующие рост пробиотических микроорганизмов - пребиотики инулин и олигофруктоза и дрожжевой аутолизат, содержащий витамины группы В, необходимые для их развития и аскорбиновая кислота, как антиоксидант.Состав усовершенствованной таким образом среды представлен в таблице 4.

Таблица 4
Состав заявляемой среды (в расчете на 100 л)
Гидролизат молока	50 л
Аутолизат дрожжей	500 г
Цистеин солянокислый	20 г
Лактоза	1000 г
Пептон ферментативный	200 г
Агар-агар микробиологический	100 г
Хлористый натрий	400 г
Аскорбиновая кислота	250 г
Инулин	500 г
Олигофруктоза	500 г
Вода водопроводная очищенная	до 100 л

При изучении ростовых свойств заявляемой среды было показано, что они превосходят ростовые свойства гидролизатно-молочной среды, т.е. желаемый результат был достигнут. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5
Сравнительные результаты культивирования консорциума на гидролизатно-молочной и заявляемой средах
Среда выращивания	Консорциум бифидобактерий
Число КОЕ/мл	°T
Гидролизатно-молочная	7,2±0,6×109	140°
Заявляемая среда	8,5±0,3×109	180°

Таким образом, заявляемая среда является перспективной в производстве препаратов и БАД для детей младшего возраста.

Синергидный эффект, который был отмечен при культивировании консорциума, проявляется также при определении спектра биохимической активности.

В качестве иллюстрации в таблице 6 представлено, как расширяется спектр ферментативной активности штаммов при совместном культивировании - увеличивается число усвоенных субстратов.

Синергидный эффект консорциума проявляется также в большей антагонистической активности консорциума по сравнению с монокультурами, что повышает пробиотическую значимость препарата. Данный эффект можно наблюдать по зонам задержки роста тест-культур (табл.7).

Таблица 7
Зоны задержки роста тест-культур (в мм) в присутствии консорциума и отдельных штаммов бифидобактерий
Объект исследования	Sh. sonnel 5063	Sh. flexneri l70	E..coli 157	Staph. aureus 209	Proteus vulgaris 177
В. bifidum OV-19	19±2	16±1	17±3	14±2	18±2
В. bifidum 791	17±3	15±2	15±3	15±1	17±2
В. longum В379М	18±2	17±2	18±1	17±3	18±2
B.breve OV-12	29±2	25±2	27±3	25±3	31±1
B.infantis 73-15	12±2	12±1	15±2	13±2	17±2
Консорциум бифидобакт	29±1	26±1	28±2	30±2	28±1

Как показывают данные, представленные в таблице 7, по антагонистической активности в отношении тест-штаммов патогенных микроорганизмов консорциум превосходят отдельные штаммы, входящие в его состав.

Таким образом, полученные результаты говорят не только о возможности совместного культивирования различных видов бифидобактерий, но и о синергидном эффекте консорциума штаммов, что позволяет решить сложную биотехнологическую задачу получения многокомпонентных пробиотических препаратов, имеющих определенный состав и назначение.

В предлагаемом консорциуме помимо определенного видового состава бифидобактерий, отмечается определенное количественное соотношение микробных культур после культивирования. Количественный учет долевого участия отдельных штаммов производится путем подсчета числа колоний, выросших в полужидкой среде. Культура каждого штамма имеет колонии определенной морфологии и размера, что позволяет их различать. Соотношение отдельных видов бифидобактерий в консорциуме представлено в таблице 8.

Таблица 8
Соотношение отдельных видов бифидобактерий в консорциуме
№ п/п	Штамм микроорганизма	Морфология колоний	Число КОЕ/г	Массовая доля микроорганизмов в %
1.	В. bifidum OV-19	Гвоздик 0,7 м	109-1010	18,0-20,0
2.	В. bifidum 791	Комета-елочка 0,5-0,7 см	109-1010	20,0-18,0
3.	В. longum B379M	Шарик диаметром 0,1-0,3 см	109-1010	24,0-27,0
4.	В. breve OV-12	Плотная комета-елочка 0,5-0,7 см	109-1010	23,5-23,0
5.	B.infantis 73-15	Комета в форме иголочек 1,0 см	109-1010	14,5-12,0

Примеры

1. Консорциум бифидобактерий для бактерийных препаратов и БАД, предназначенных для детей от рождения до 3-х лет, и способ его получения

1-й пассаж - лиофилизированный материал штаммов В.bifidum OV-19, В.bifidum 791, В.longum В379М, В.breve OV-12, В.infantis 73-15 по отдельности регидратируют физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведении в питательной среде до 10^7-8. Инкубируют при температуре 37,5-38°С в течение 36 ч.

2-й пассаж - каждую из выросших культур из разведения 10^6-8 в объеме 5% засевают в заявляемую полужидкую среду заявляемого состава (30 мл) и культивируют 7 ч. при 37,0-38°С.

3-й пассаж - каждую из выросших культур засевают в заявляемую полужидкую среду и выращивают в течение 16 ч при 37,0-38°С.

Выращивание консорциума.

Консорциум бифидобактерий получают путем совместного культивирования вышеперечисленных штаммов на питательной среде, содержащей следующие ингредиенты (в расчете на 100 л):

Гидролизат молока	50 л
Аутолизат дрожжей	500 г
Цистеин солянокислый	20 г
Лактоза	1000 г
Пептон ферментативный	200 г
Агар-агар микробиологический	100 г
Хлористый натрий	400 г
Аскорбиновая кислота	250 г
Инулин	500 г
Олигофруктоза	500 г
Вода водопроводная очищенная	до 100 л

Для этого подбирают строго определенное количественное соотношение посевного материала каждого из штаммов. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию ОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток бифидобактерий.

Посев культур штаммов в ферментер по 2% каждой к объему засеваемой среды проводят последовательно, с периодичностью в 30 мин, коррегируя рН культуральной жидкости 20% NaOH перед засевом каждого штамма до 6,8:

1) - Bifidobacterium infantis 73-15; 2) - В.bifidum 791; 3) - В.breve OV-12; 4) - В.bifidum OV-19; 5) - В.longum B379M.

Процесс культивирования ведут при 37-38°С. до достижения рН конечного продукта 5,1.

2. Биологически активная добавка к пище для нормализации микрофлоры детей в от рождения до 3 лет и способ ее производства

1-й пассаж - лиофилизированный материал штаммов В.bifidum OV-19, В.bifidum 791, В.longum B379M, В.breve OV-12, В.infantis 73-15 по отдельности регидратируют физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведении в питательной среде до 10^7-8. Инкубируют при температуре 37,5-38°С в течение 24 ч.

2-й пассаж - каждую из выросших культур из разведения 10^6-8 в объеме 5% засевают в питательную полужидкую среду (30 мл) и культивируют 7 ч при 37,0-38°С (маточные культуры).

3-й пассаж - каждую из выросших культур засевают в питательную полужидкую среду и выращивают в течение 16-18 часов при 37,0-38°С.

Выращивание консорциума.

Консорциум бифидобактерий получают путем совместного культивирования вышеперечисленных штаммов. Для этого подбирают строго количественное соотношение посевного материала каждого из штаммов согласно разработанной схеме. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию ОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток бифидобактерий. Состав среды выращивания (в расчете на 100 л):

Гидролизат молока	50 л
Аутолизат дрожжей	500 г
Цистеин солянокислый	20 г
Лактоза	1000 г
Пептон ферментативный	200 г
Агар-агар микробиологический	100 г
Хлористый натрий	400 г
Аскорбиновая кислота	250 г
Инулин	500 г
Олигофруктоза	500 г
Вода водопроводная очищенная	до 100 л

Процесс культивирования ведут 10 ч при при 37-38°С. К выращенной биомассе бифидобактерий добавляют защитную сахарозо-желатиновую среду и обезжиренное 10%-ное молоко по 10% к объему биомассы бифидобактерий и лиофильно высушивают.

Техническим результатом, достигаемым при получении биологически активной добавки с использованием заявляемого консорциума бифидобактерий в качестве активного вещества, является более эффективная и быстрая коррекция микрофлоры ЖКТ ребенка.

При разработке рецептуры руководствовались рекомендациями специалистов в области детского питания [22] и помимо консорциума бифидобактерий на основе штаммов бифидобактерий, физиологичных для детей младшего возраста, включили мальтодекстрин - продукт, полученный путем гидролиза крахмала и содержащий сухой сироп глюкозы, фруктозу и фруктоолигосахариды. Данный ингредиент широко используется в продуктах детского назначения - кашах, детских смесях, препаратах и биологически активных добавках, как полноценный источник легкоусвояемого углеводного питания.

После помола биомасса бифидобактерий смешивается с мальтодекстрином и фасуется по 25 г в стерильные пластиковые баночки с герметично закрывающимися крышками, к которым прилагается мерная ложечка. Рецептура препарата представлена в таблице 9.

Таблица 9
а) Рецептура БАД к пище (состав 1 упаковки)
Наименование сырья	Масса в г
Сухая биомасса бифидобактерий*	12,5
Мальтодекстрин	12,5
Итого:	25,0

состав 1 мерной ложечки:

биомасса бифидобактерий - 0,1 г,

мальтодекстрин - 0,4 г.

* Содержание КОЕ/г бифидобактерий не менее 10⁸

3. Бактерийный препарат для лечения дисбиотических нарушений ЖКТ у детей от рождения до 3 лет и способ его производства

1-й пассаж - лиофилизированный материал штаммов В.bifidum OV-19, В.bifidum 791, В.longum B379M, В.breve OV-12, В.infantis 73-15 по отдельности регидратируют физиологическим раствором в объеме 1 мл и титруют методом десятикратных разведении в питательной среде до 10^7-8. Инкубируют при температуре 37,5-38°С в течение 24 ч.

2-й пассаж - каждую из выросших культур из разведения 10^6-8 в объеме 5% засевают в питательную полужидкую среду (30 мл) и культивируют 6 ч при 37,0-38°С (маточные культуры).

3-й пассаж - каждую из выросших культур засевают в питательную полужидкую среду и выращивают в течение 16 ч при 37,0-38°С.

Выращивание консорциума.

Консорциум бифидобактерий получается путем совместного культивирования вышеперечисленных штаммов. Для этого подбирают строго количественное соотношение посевного материала каждого из штаммов согласно разработанной схеме. По оптическому стандарту мутности устанавливают концентрацию ОЕ/мл, соответствующую 1 млрд клеток бифидобактерий. Состав среды выращивания (в расчете на 100 л):

Гидролизат молока	50 л
Аутолизат дрожжей	500 г
Цистеин солянокислый	20 г
Лактоза	1000 г
Пептон ферментативный	200 г
Агар-агар микробиологический	100 г
Хлористый натрий	400 г
Аскорбиновая кислота	250 г
Инулин	500 г
Олигофруктоза	500 г
Вода водопроводная очищенная	до 100 л

Процесс культивирования ведут 10 ч при при 37-38°С. К выращенной биомассе бифидобактерий добавляют защитную сахарозо-желатиновую среду и обезжиренное 10%-ное молоко по 10% к объему биомассы бифидобактерий, разливают в асептических условиях по 5 мл в стеклянные пенициллиновые флаконы и лиофильно высушивают.

Техническим результатом, достигаемым при получении бактерийного препарата с использованием заявляемого консорциума бифидобактерий в качестве активного вещества, является более эффективная и быстрая коррекция микрофлоры ЖКТ ребенка.

* Содержание КОЕ/г бифидобактерий в готовом препарате не менее 10⁸.

Список цитируемой литературы

1. Mitsuoka Т. Intestinal Flora and Host. // Asian. Med. J. - 1989 - V.31. - N7. - P.400-409.

2. Гончарова Г.И., Лянная A.M., Козлова Э.П., Семенова Л.П. Роль бифидофлоры в повышении устойчивости организма к инфекции. // В сб. материалов международной конференции «Гнотобиология в теоретической и практической медицине». - М. - 1987. - С.62.

3. Шендеров Б.А. Микрофлора пищеварительного тракта - важнейший фактор поддержания микроэкологического гомеостаза хозяина. // Клиническое питание. - 2005. - №2. - С.2-5.

4. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека, ее защитная роль в организме и обоснование сфер применения препарата бифидумбактерин // Автореф.дис…д-рабиол..наук. - M. - 1982. - 48 С.

5. Шендеров Б.А. Функциональное питание и его роль в профилактике метаболического синдрома // Москва: Дели принт. - 2008. - С.317.

6. Гончарова В.В. Изучение бифидобактерий, разработка препарата «сухой бифидумбактерин» и его эффективность при кишечных заболеваниях детей первого года жизни. // Автореф.дисс…канд.биол.наук. - Москва. 1970. - С.15.

7. Mitsuoka Т., Hayakawa К., Kimura N.. The fecal flora of man. II. Communication: the composition of bifidobacterium flora of different age groups. // Zentralbl. Bakteriol. Mikrobiol. Hyg. 1 Abt. Orig. - A 1974. - V.226/ - P.469-478.

8. Патент РФ №2264451.

9. Сукачев В.Н., Дылиса Н.В. Лесной биогеоценоз // М.: Наука. - 1964. - С.574.

10. Рыбальченко О.В., В.М. Бондаренко, Добрица В.П. Атлас ультраструктуры микробиоты кишечника человека. // С-Петербург. - 2008. - С.109.

11. Бифидобактерий и их использование в клинике, медицинской промышленности и сельском хозяйстве. // Сб. научных трудов. - М. - 1986. - С.208.

12. Леванова Л.Л., Алешкин В.А., Воробьев А.Л., и др. Возрастные особенности микробиоценоза кишечника у жителей г.Кемерово. // Журн. Микробиол. - 2001. - №3. - С.72-15.

13. Карзанова М.В., Воронина О.Л., Лунин В.Г., Жиленкова О.Г., Амерханова A.M. Определение видовой принадлежности штаммов бифидобактерий на основе секвенирования фрагментов генов 16S рРНК и трансальдолазы. // Сборник докладов Россельхозакадемии. - М. - 2006. - №5. - С.9-12.

14. Namba К., Hatano М. at all. Method of detecting Bifidobacterium infantis // United States Patent. - Prior Publication data 14.12.2006. - 22 P.

15. Жиленкова О.Г.Селекция производственно перспективных штаммов бифидобактерий, выделенных от детей // Автореф. дисс… канд.биол.наук, Москва, 2011, С.16.

16. Шкопоров А.Н., Кафарская Л.И., Афанасьев С.С. и др. Молекулярно-генетический анализ видового и штаммового разнообразия бифидобактерий у детей раннего возраста. // Вестник Российской АМН." 2006. - №1. - С.45-50.

17. Smehilova М., Vilkova E., Nevoral J. Comparison of intestinal microflora in healthy infants and infants with allergic colitis. Folia Microbiol (Praha) 2008. - 53(3). - P.255-258

18. Ezendam J., de Klerk A., Gremmer E.R., van Loveren H. Effects of Bifidobacterium animalis administered during lactaion on allergic and autoimmune responses in rodents. // Clinical and Experimental Immunology. - 2008. - V.154. - P.424-155.

19. Reiter [24] причисляет их к подвидам B.adolescentis, который нехарактерен для микробиоценоза детей. Такие виды нефизиологичны для детей и не могут быть использованы в составе средств коррекции микрофлоры данной возрастной группы.

20. Патент РФ №2373274 от 20.11.2009. Штамм Bifidobacterium breve OV-12, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.

21. Патент РФ №2375444 от 10.12.2009. Штамм Bifidobacterium bifidum OV-19, используемый для получения бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств.

22. Конь И.Я., Георгиева О.В., Абрамова Е.В. Пребиотики в продуктах детского питания: изучение эффективности каши, обогащенной пребиотиком, в питании детей, первого года жизни // Вопросы детской диетологии - 2008. - т.1 - №6. - С.66-70.

1. Консорциум бифидобактерий Bifidobacterium bifidum OV-19, В. bifidum 791, В. longum B379M, В. breve OV-12, В. infantis 73-15 для приготовления бактерийных препаратов и биологически активных добавок к пище, предназначенных для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта детей в возрасте до 3-х лет.

2. Способ получения консорциума по п.1, предусматривающий совместное культивирование в питательной среде входящих в него штаммов, отличающийся тем, что проводят посев каждого из штаммов в ферментер по 2% к объему питательной среды культивирования поэтапно с периодичность в 30 мин, коррегируя рН культуральной жидкости 20% NaOH перед засевом каждого штамма до 6,8, при этом очередность засева каждого штамма устанавливают в зависимости от длительности экспоненциальной фазы его роста в питательной среде, содержащей следующие ингредиенты в расчете на 100 л:

Гидролизат молока	50 л
Аутолизат дрожжей	500 г
Цистеин солянокислый	20 г
Лактоза	1000 г
Пептон ферментативный	200 г
Агар-агар микробиологический	100 г
Хлористый натрий	400 г
Аскорбиновая кислота	250 г
Инулин	500 г
Олигофруктоза	500 г
Вода водопроводная очищенная	до 100 л

3. Биологически активная добавка к пище для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта детей в возрасте до 3-х лет, характеризующаяся тем, что она содержит сухую биомассу консорциума Bifidobacterium bifidum OV-19, В. bifidum 791, В. longum B379M, В.breve OV-12, В. infantis 73-15 и мальтодекстрин в следующем процентном соотношении:

Сухая биомасса консорциума	20%;
Мальтодекстрин	80%

4. Бактериальный препарат для лечения дисбиотических состояний желудочно-кишечного тракта детей в возрасте до 3-х лет, отличающийся тем, что он содержит сухую биомассу консорциума бифидобактерий Bifidobacterium bifidum OV-19, В. bifidum 791, В. longum B379M, В. breve OV-12, В. infantis 73-15 с содержанием КОЕ/г в готовом препарате не менее 10⁸.