Способ репликации вируса гриппа в культуре

Способ репликации вируса гриппа в культуре

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По данной заявке испрашивается приоритет к заявке США №60/875287, поданной 15 декабря 2006, и заявке США №60/882412, поданной 28 декабря 2006, обе из которых включены здесь в качестве ссылок.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Эпидемии и пандемии гриппа выявляются в течение нескольких веков и привели к значительным потерям. Вирус гриппа представляет собой сегментированный РНК-содержащий вирус, принадлежащий к семейству Orthomyxoviridae. Эпидемии и пандемии вызываются присутствием вирусов с новыми компонентами оболочек, иммунитет к которым у населения очень низкий. Эти новые компоненты часто являются результатом мутации и/или смешивания вирусов гриппа человека и животных.

В то время как капсид вируса гриппа некоторым образом является плеоморфным, внешняя поверхность является единообразной для всех вирусов и состоит из липидной оболочки, из которой выходят выступающие гликопротеиновые выступы двух типов: гемагглютинин (НА или Н) и нейраминидаза (NA или N). Существует три типа вирусов гриппа: A, B и C. Только вирусы гриппа А далее классифицированы по подтипам на основе двух основных поверхностных гликопротеинов НА и NA. Подтипы гриппа А далее классифицированы штаммами. Вирусы гриппа В поражают только млекопитающих и вызывают заболевания у человека, но обычно являются не такими тяжелыми, как типы А. Вирусы гриппа С также поражают млекопитающих, но вызывают только умеренное респираторное расстройство у детей. Они генетически и морфологически отличаются от типов А и В.

Вирусы гриппа А поражают множество видов животных, включая млекопитающих, например человека, лошадей, собак, свиней, хорьков, и птицу, например уток, кур и индеек. Существует 16 известных серотипов НА и 9 известных серотипов NA. Птицы являются особенно важными носителями, образуя множество генетически/антигенетически различных вирусов, которые переносятся обратно человеку через тесный контакт человека и животными. Свиньи являются пермиссивными для человеческих и птичьих штаммов. Благодаря этой необычной черте, свиньи считаются «смесительными сосудами», позволяющими генетический обмен между птичьими и человеческими вирусами, когда одни и те же клетки инфицированы обоими типами вируса.

Геном вируса гриппа состоит из одноцепочечной антисмысловой РНК в 8 сегментах (7 в гриппе С). Структура генома известна очень подробно благодаря огромному количеству генетических исследований (обычных и молекулярных), которые были проведены. Каждый сегмент кодирует один или два вирусных белка. Считается, что эпидемии и пандемии возникают из-за генетического изменения в НА и NA белках вируса гриппа двумя различными путями: антигенный дрейф и антигенная изменчивость. Антигенный дрейф возникает постоянно, в то время как антигенная изменчивость возникает только случайно. Вирусы гриппа типа А претерпевают оба вида изменений; вирусы гриппа В изменяются только более постепенным процессом антигенного дрейфа.

Антигенный дрейф относится к небольшим, постепенным изменениям, которые возникают через точечные мутации в двух генах, которые составляют генетический материал, с получением основных поверхностных белков, НА и NA. Антигенная изменчивость относится к внезапным основным изменениям с получением нового подтипа вируса гриппа А у человека, который в данный момент не распространен среди людей. Антигенная изменчивость может возникать либо через прямую передачу животное (птица)-человек или через смешивание генов вируса гриппа А человека и вируса гриппа А животного с получением нового подтипа вируса гриппа А человека через процесс, называемый рекомбинация. Антигенная изменчивость дает новый подтип вируса гриппа человека. Генетическая рекомбинация возникает, когда два различных вируса гриппа заражают одну и ту же клетку и разделяют или обменивают один или более сегментов РНК. Если переносимым сегментом является НА, например, это может дать возникновение нового вирусного штамма, который является антигенно новым при попадании в популяцию, имеющую слабый или не имеющую иммунитет. Результатом может быть эпидемия и/или пандемия.

Попадание вирусов гриппа в клетки способствует связыванию выступов НА с микропротеинами, содержащими концевые группы N-ацетилнейраминовой кислоты (NANA = сиаловой кислоты). После связывания частицы поглощаются эндоцитозом через окаймленные ямки в эндоцитные везикулы и, наконец, эндосомы. Они окисляются клеткой и при рН около 5,0 НА мономеры расщепляются трипсиноподобными ферментами в эндосоме для активации их для интернализации. После интернализации возникает репликация вируса и вызывает симптомы гриппа.

Существует значительный интерес к недавним вспышкам гриппа. Тяжелый тип респираторного заболевания был идентифицирован у собак, который возникает из-за вируса гриппа собаки (ВГС). Было доказано, что это респираторное заболевание является высоко заразным. Более того, ВГС может вызывать 100% заражение с 80% смертностью, и вплоть до 5-8% смертности среди тяжелых инфекций. С тех пор, как в первый раз его выявили в 2004 у собак породы грейхаунд (Crawford et al., Science 310(5747): 482-485 (2005)) ВГС быстро распространился по Соединенным Штатам, где, по крайней мере, в 25 штатах были отмечены вспышки ВГС, и в двадцати семя штатах было отмечено превалирование серотипа ВГС.

Серотип ВГС, вызвавший недавнюю вспышку, был H3N8. Этот серотип ВГС изначально был обнаружен у лошадей, и полагают, что он преодолел видовой барьер в собак. Вероятно, что отсутствие эффективной вакцины против вируса гриппа собаки сыграло основную роль в быстром и обширном распространении у собак этого вируса.

Вирус гриппа A (H5N1, птичий грипп), также называемый "вирус H5N1", является подтипом вируса гриппа А, который возникает в основном у птиц, и может быть смертельным для них. Вирус H5N1 обычно не поражает людей, но инфекции с присутствием этого вируса возникали у человека. До настоящего времени более 200 подтвержденных случаев у человека, вызвавшие около 150 смертей, были описаны в 10 странах, в основном в Азии. К счастью, пока еще вирус нелегко передается от птицы к человеку и от одного человека к другому. Однако это может случиться, что приведет к эпидемии или пандемии. Наилучшей стратегией профилактики смертности, связанной с эпидемией или пандемией, является вакцинация.

Вакцины гриппа в настоящее время вводят людям в случае высокого соотношения польза-риск в смысле профилактики госпитализации и смерти, однако мировая ежегодная мощность производства сезонной вакцины ограничена и не реалистично снижает глобальный высокий риск для населения. Современные вакцины получены в яйцах с применением вируса, полученного от Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) или Центров контроля за заболеваемостью (ЦКЗ), которые предоставляют исходные вакцинные вирусы для производства вакцин каждый год. Изменения в НА распространенных вирусов (антигенный дрейф) требуют периодической замены штаммов вакцин во время интерпандемических периодов. ВОЗ опубликовала полугодовые рекомендации для штаммов, включенных для Северного и Южного полушарий. Для того чтобы было достаточное время для производства, ВОЗ определяет в феврале, какие штаммы вакцин должны быть включены в вакцины следующей зимы. В общем, 1 доза для взрослого содержит эквивалент 45 мкг НА (15 мкг каждого для 3 вирусов). Эта доза приблизительно равна количеству очищенного вируса, полученного из аллантоисной жидкости зараженных оплодотворенных яиц. Если получают 100 миллионов доз вакцин из убитого вируса гриппа, производитель должен произвести 100 миллионов оплодотворенных яиц. Это ставит производство вакцины в зависимость от временной доступности оплодотворенных яиц хорошего качества и штаммов исходных вакцинных вирусов от ВОЗ/ЦКЗ. Большинство прототипов исходных штаммов нелегко вырастить до высокого титра даже в оплодотворенных яйцах. Для преодоления этой проблемы правительственные агентства, прежде всего, создают высокорезультативные лабораторные штаммы через классическую рекомбинацию высокорезультативного лабораторного штамма A/PR/8/34 (в 6:2 рекомбинации получая 6 сегментов из A/PR/8/34 штамма). К сожалению, этот процесс может быть трудным в исполнении и может влиять на антигенность полученной вакцины. Поэтому существует необходимость в получении альтернативных способов производства вакцин, которые защищают от клинических заболеваний, вызванных гриппом, особенно высоко патогенными штаммами, такими как H5N1. Более того, остается необходимость в получении способов производства больших количеств жизнеобеспечивающих вакцин гриппа в достаточно короткий период времени для эффективной профилактики возможных эпидемий и/или пандемий. Данное изобретение отвечает этой и другим потребностям.

Цитирование любой ссылки не должно пониматься как признание, что данная ссылка является «известным уровнем техники» для данной заявки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к вакцинам для профилактики заражения гриппом А и В. Вакцины и относящиеся к ним способы в соответствии с данным изобретением предоставляют множество преимуществ по отношению к вакцинам и способам известного уровня техники. Например, вакцины в соответствии с данным изобретением получают с применением клеток культуры ткани вместо оплодотворенных яиц. Способы производства в соответствии с данным изобретением выдерживают критическое время благодаря обходу классического метода производства вакцины. Кроме того, вакцины в соответствии с данным изобретением применяются у тех, кто страдает аллергией на компоненты яиц. В данном изобретении также представлены новые иммуногенные композиции, которые могут применяться в качестве вакцин. Эти новые композиции могут применяться для иммунизации животных, включая птиц, против вируса гриппа. В конкретных вариантах данного изобретения пациентом для вакцинации является млекопитающее. В одном аспекте в данном изобретении представлена вакцина, которая защищает собак от респираторных заболеваний у собак вследствие заражения вирусом гриппа у собак (ВГС). В другом аспекте в данном изобретении представлена вакцина, которая защищает человека от штаммов вируса гриппа, полученных естественным путем через генетическую рекомбинацию.

В данном изобретении представлены штаммы вируса гриппа, которые были специально адаптированы для выращивания в клетках культуры ткани. В конкретном варианте адаптированные штаммы вируса гриппа выбирают по их способности расти в выбранной колонии клеток культуры ткани с применением клонирования методом серийных разведении. В одном конкретном варианте субпопуляцию вируса гриппа, адаптированного для выращивания в колонии культивированных клеток, выделяют серийным разведением во множестве аликвот, количестве вируса гриппа, которое включает множество субпопуляций гриппа. Затем множество аликвот подвергают контакту с и/или выращивают в колонии культивированных клеток. Субпопуляцию вируса гриппа во множестве субпопуляций гриппа идентифицируют как ту, которая растет в культивированных клетках при низкой множественности заражения (МЗ) и выбирают как субпопуляцию вируса гриппа, которая адаптирована для роста в колонии культивированных клеток. В родственных вариантах данное изобретение представляет способы, которые включают контакт адаптированного к культуре клеток штамма с клетками культуры ткани, выращивание в течение времени, достаточного для получения цитопатического эффекта (ЦПЭ). Этот способ также может включать сбор вируса гриппа. В некоторых подобных вариантах клонирование методом серийных разведении включает серийное разведение штамма вируса гриппа и контакт каждого разведения с культивированными клетками, выращивание клеток в течение времени, достаточного для получения цитопатического эффекта (ЦПЭ), сбор вируса из наивысшего разведения, которое вызывает ЦПЭ, и повтор процесса с собранным вирусом. В некоторых вариантах способ также включает смешивание штамма вируса гриппа с эффективным количеством трипсина до контакта с культивированными клетками. В некоторых вариантах смеси инкубируют в течение времени, достаточного для расщепления трипсином вирусных белков, без отделения клеток от субстрата. Трипсин, применяемый для расщепления вирусных белков, может быть трипсином IX типа. В некоторых случаях стадию контакта штамма, адаптированного к культуре клеток, с клетками культуры ткани проводят при множественности заражения (МЗ) менее около 0,01, включая менее около 0,001 и/или менее около 0,0001. В других случаях штамм вируса гриппа сначала тестируют на клетках культуры ткани для определения оптимальной МЗ. Клетки культуры ткани могут быть клетками мезонефроса человека, такими как клетки мезонефроса человека. Вирусом гриппа может быть вирус гриппа А, В или С. В одном конкретном варианте вирусом гриппа А является штамм H5N1. Штамм вируса гриппа может быть получен из любого количества источников, включая мазки из носа, ткань легких, и/или может быть получен от третьей стороны, например ВОЗ. В некоторых вариантах, штамм вируса гриппа изначально выращивают в оплодотворенных яйцах для получения большого инокулята для адаптации к культуре ткани. Некоторые способы включают очистку собранного вируса. В одном таком способе стадию очистки проводят с применением гель-хроматографии. Способы в соответствии с данным изобретением также могут включать смешивание второго штамма вируса гриппа и первым штаммом до, во время или после очистки, так чтобы второй штамм отличался от первого штамма. В некоторых способах анализ титрования дозы проводят до смешивания двух штаммов вируса для определения смеси, которая позволит равную иммуногенность вирусных белков. В некоторых способах грипп активирован. В некоторых вариантах этого типа, вирус гриппа обрабатывают количеством бинарного этиленимина, эффективного для его активации. В некоторых способах сбор проводят, когда содержание белка гемагглютинина является максимальным.

Другие варианты включают вакцину, полученную сбором штамма вируса, полученного способом выбора вируса гриппа для выращивания в клетках культуры ткани через титрование штамма вируса гриппа с применением клонирования методом серийных разведений таким образом, что выбирают штамм вируса гриппа, адаптированный к клеткам культуры ткани. В некоторых вариантах вирус получают инокуляцией оплодотворенных, не содержащих конкретного патогена, куриных яиц через инокуляцию в хориоаллантоисную (также называемой аллантоисной полостью) или амниотическую оболочку до клонирования методом серийных разведении. В одном варианте вирус гриппа реплицируют сначала инокуляцией через амниотическую оболочку оплодотворенных яиц с получением инокулята для адаптации к клеткам культуры ткани.

Кроме того, в данном изобретении представлены способы выбора вируса гриппа для выращивания в клетках мезонефроса человека. В одном из таких способов штамм вируса гриппа титруют с применением клонирования методом серийных разведений так, чтобы выбрать штамм вируса гриппа, который адаптирован к клеткам НЕК. Этот способ может включать контакт штамма, адаптированного к НЕК с клетками НЕК, и выращивание клеток в течение времени, достаточного для получения цитопатического эффекта (ЦПЭ). В конкретном варианте этого типа полученный вирус гриппа собирают. В данном изобретении также представлена вакцина, которая включает штамм вируса гриппа, полученный этими способами. Способ также может включать смешивание штамма вируса гриппа с эффективным количеством трипсина IX типа до контакта с культивированными клетками, в течение времени, достаточного для того, чтобы трипсин расщепил вирусные белки, без отсоединения клеток от субстрата. В одном варианте стадия контакта адаптированного к НЕК штамма с клетками НЕК проводят при МЗ менее около 0,001.

В некоторых вариантах в данном изобретении также представлены вакцины, содержащие вирус гриппа человека в количестве менее 4 мкг НА человеческого гриппа на дозу. В родственном варианте в данном изобретении представлены вакцины, содержащие вирус гриппа человека в количестве менее 3 мкг НА человеческого гриппа на дозу. В другом варианте в данном изобретении представлены вакцины, содержащие вирус гриппа человека в количестве менее 2 мкг НА человеческого гриппа на дозу. В еще одном варианте в данном изобретении представлены вакцины, содержащие вирус гриппа человека в количестве 1,5-3,5 мкг НА человеческого гриппа на дозу. В особенно предпочтительном варианте вакцины адъювантом является ISCOM. В других вариантах вакцины, по крайней мере, 70% вирусов содержат НА, который имеет одинаковую последовательность аминокислот. В еще одном варианте вакцин, по крайней мере, 80% вирусов содержат НА, который имеет одинаковую последовательность аминокислот. В еще одном варианте вакцины, по крайней мере, 90% вирусов содержат НА, который имеет одинаковую последовательность аминокислот. В еще одном варианте вакцин более 95% вирусов содержат НА, который имеет одинаковую последовательность аминокислот.

В данном изобретении также представлены комбинированные вакцины для усиления защитного иммунитета против вируса гриппа, например вируса гриппа собаки (ВГС), и других заболеваний, например других инфекционных заболеваний собак. В данном изобретении также представлен способ иммунизации млекопитающих, например собак, кошек или лошадей, от гриппа. Также представлены способы получения и применения вакцин для инфекционных заболеваний, например инфекционных заболеваний собак.

В конкретном варианте иммуногенная композиция в соответствии с данным изобретением содержит иммуногенную композицию, содержащую неактивированный ВГС H3N8 и адъювант. Обычно адъювант включает эмульсию масло в воде. В одном таком варианте адъювант также содержит гидроксид алюминия. В конкретном варианте этого типа адъювантом является Emunade®. В другом варианте иммуногенной композицией является вакцина.

Композиция вакцины может включать от около 100 единиц гемагглютинации (ЕГА) до около 1500 ЕГА на дозу. Это может широко варьироваться в зависимости от размера и других параметров состояния здоровья пациента, получающего лечение. Композиция обычно содержит от 250 до 750 ЕГА на дозу. В одном варианте композиция вакцины содержит около 500 ЕГА на дозу.

Необязательно, вакцины в соответствии с данным изобретением также могут включать фармацевтически приемлемый иммуностимулятор, например цитокины, факторы роста, хемокины, надосадочные жидкости из культур клеток лимфоцитов, моноцитов или клеток из лимфоидных органов, клеточных препаратов и/или экстрактов из растений, бактерий или паразитов, или мутогенов.

Вакцины в соответствии с данным изобретением могут вводиться таким путем, как: парентеральное введение, внутримышечная инъекция, подкожная инъекция, внутрибрюшинная инъекция, чрескожная инъекция, пероральное введение, интраназальное введение, скарификация или их сочетание. В предпочтительном варианте вакцины вводят внутримышечной инъекцией.

В изобретении также представлена сыворотка, полученная от вакцинированных животных, которая содержит антитела, которые связываются с ВГС H3N8 и самими очищенными антителами. В конкретном варианте данного изобретения очищенное антитело, которое связывается с ВГС H3N8, является химерным антителом.

В данном изобретении также представлено сочетание вакцин, которые включают один или более штаммов инактивированного ВГС, например ВГС H3N8, в сочетании с одним или более патогенами и/или иммуногенами собак, включая, например, иммуногены для вызова иммунитета к вирусу чумки собак; аденовирусу собак; аденовирусу 2 типа у собак; парвовирусу собак; вирусу парагриппа собак; коронавирусу собак; вирусу гриппа собак; и/или сероваров Leptospira kirschneri, например гриппотифозный серовар Leptospira interrogans, лептоспирозный серовар Leptospira interrogans, иктерогеморрагический серовар Leptospira interrogans, и/или серовар Помона Leptospira interrogans. Дополнительные патогены собак, которые могут быть добавлены в комбинированную вакцину в соответствии с данным изобретением, включают Bordetella bronchiseptica; организмы Leishmania, такие как Leishmania major и Leishmania infantum; виды Borrelia (spp.) спирохет, включая B. burgdorferi в буквальном смысле (ss), B. burgdorferi, B. garinii и B. afzelii; виды Mycoplasma (например, Mycoplasma); вирус бешенства; и Ehrlichia canis.

В данном изобретении представлены способы выращивания ВГС H3N8 в культивированных клетках. В некоторых вариантах культивированными клетками являются клетки почек не собачьих млекопитающих. В одном варианте клетками являются клетки почек коров Madin-Darby (MDBK). В другом варианте клетками являются клетки Vero.

В некоторых вариантах в данном изобретении также представлены вакцины, содержащие ВГС H3N8 в количестве, по крайней мере, 500 ЕГА на дозу. В этих вариантах адъювантом обычно является гидроксид алюминия, и, по крайней мере, 70%, обычно, по крайней мере, 90% НА имеют одинаковую последовательность аминокислот. В других вариантах вакцины, по крайней мере, 80% вирусов содержат НА, который имеет одинаковую последовательность аминокислот. В других вариантах вакцины более 95% вирусов содержат НА, который имеет одинаковую последовательность аминокислот.

Эти и другие аспекты данного изобретения будут более понятны из представленных ниже фигур и подробного описания.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На фигуре 1 показаны средние значения клинической оценки после заражения ВГС у собак. Невакцинированную контрольную группу и вакцинированных собак заражают ВГС и отслеживают ежедневно с -2 дня до 10 дней после заражения для определения клинических признаков, таких как выделения из носа, чихание, кашель, депрессия и затруднение дыхания. Клинические признаки оценивают по инструкции, описанной в примере 1, и среднюю клиническую оценку для каждой леченной группы наносят как функцию от дней.

На фигуре 2 показано распространение назального ВГС у собак после контрольного заражения. Невакцинированную контрольную группу и вакцинированных собак заражают ВГС. Мазки из носа получают за день до заражения (день -1) для подтверждения отсутствия ВГС у собак. Распространение назального вируса отслеживают у зараженных собак сбором мазков из носа ежедневно в течение 10 дней (день 1-10 после заражения) и проведением титрования на монослоях MDCK. Средние значения титра вируса для каждой леченной группы, выраженные как Log₁₀ TCID₅₀/мл, рассчитывают и наносят как функцию от дней после заражения.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Традиционные способы получения вакцин гриппа включают выращивание выделенного штамма в оплодотворенных куриных яйцах, по крайней мере, частично, так как применение яиц является дешевым и эффективным, и так как не существует очевидной альтернативы для выращивания гриппа в больших количествах. Это относится особенно к человеческому гриппу, так как многие колонии клеток, которые могут применяться для репродуцирования вируса гриппа, не были одобрены FDA для производства вакцин для человека и только очень низкие титры были получены в культуре ткани.

Когда вакцину получают в яйцах, это обычно делают следующим образом. Сначала вирус выделяют из мазка из зева или подобного источника и выделяют в яйцах. Исходное выделение в яйцах является трудным, но вирус адаптируется к яйцу и дальнейшее репродуцирование проходит относительно легко. После выращивания в яйце, вирус очищают и инактивируют формалином или бета-пропиолактоном. Все больше фактов говорят о том, что яйцо не является оптимальным для репродуцирования вируса. Например, обычные стада несушек, которые дают яйца для производства, также имеют высокий риск примешивания к препарату вируса эндогенных вирусов, обычно находящихся у таких источников. Также отдельная инокуляция и сбор миллионов яиц, а также усложненная последующая обработка дают огромные возможности для попадания природных примесей в препараты вируса и, похоже, являются причиной отзыва вакцины в 2004. Как указано выше, трудно полностью удалить яичный материал, и это может вызвать чувствительность к вакцине. Кроме того, процесс является абсолютно не гибким при неожиданном увеличении потребности в вакцине, из-за проблемы осуществления поставок из-за недоступности больших количеств подходящих яиц. Также существуют доказательства, что выращивание в яйцах может понизить антигенность вируса. Следовательно, выращивание вирусов гриппа А или В в яйцах дает гетерогенный вирусный продукт, который имеет ряд НА мутаций. Наоборот, соответствующее выращивание в клетках млекопитающего хозяина дает вирусы гриппа, которые структурно идентичны тем, которые первоначально выделены (Rocha, et al. J. Gen. Virol 1993:74:2513-2518). Более того, вирусы гриппа, выращенные в клетках млекопитающих, вызывают нейтрализацию и антитела, ингибирующие НА, в человеческой сыворотке более легко и с большим титром, чем выращенные в яйцах (Oxford, et al. Bull WHO 1987; 65: 181-187).

К сожалению, ввиду того, что все штаммы вируса гриппа выращивают в яйцах, многие из них не растут хорошо в клетках культуры тканей, а те, которые растут в клетках культуры ткани, не растут с количествах, необходимых для получения эффективной вакцины. Авторы данного изобретения обнаружили, что если вирус гриппа выращивать в культуре ткани с применением клонирования методом серийных разведении, могут быть получены штаммы, которые адаптированы к культуре ткани. Неожиданно авторы данного изобретения обнаружили, что репликация вируса, получаемая при инокуляции через амниотическую оболочку оплодотворенных яиц, дает популяцию вируса, которая может реплицировать и производить высокие уровни НА при репродуцировании на клетках культуры ткани (например, клетках Vero). Полученный вирусный штамм вырабатывает НА титр, который практически идентичен тому, который получают с применением оплодотворенных яиц, и НА титр является одним из важных показателей мощности вакцины. Поэтому один из важных объектов данного изобретения связан со способами получения вирусных штаммов вируса гриппа, которые адаптированы к культуре ткани и подходят для применения в производстве вакцин от гриппа, особенно вакцин для человека. Способы включают применение клонирования методом серийных разведений для выделения и идентификации адаптированных к культуре ткани вирусов. Полученный штамм может быть обработан с получением вакцины. Таким образом, данное изобретение также относится к способам получения улучшенных вакцин от вируса гриппа.

Наконец, представлены способы выбора адаптированного к культуре ткани вируса гриппа титрованием вируса с применением клонирования методом серийных разведении, повторяя этот процесс 2 или более раз. В некоторых способах применяемой культурой клеток являются НЕК клетки. Трипсин или эквивалентная протеаза могут применяться для увеличения эффективности внедрения вируса в клетку. Другие способы включают титрование трипсина для идентификации наилучшей концентрации для применяемого трипсина и для применяемых клеток. Идентификация наибольшей множественности заражения (МЗ) для каждого применяемого вируса гриппа и для конкретных клеток также способствует успешной репродукции в культуре ткани. Выделенный адаптированный к культуре ткани вирус может применяться для получения вакцины стандартными способами. В некоторых вариантах вакцины включают применение адъюванта ISCOM. В некоторых вариантах вакцины включают применение адъюванта гидроксида алюминия. Если в вакцину включено более одного вирусного штамма или изолята, способы могут включать смешивание двух в иммунологически равных количествах. Способы и композиции представлены здесь для адаптированных к культуре ткани вирусных штаммов и для полученных из них вакцин.

I. Способы выбора вируса, адаптированного к культуре ткани

Источник вируса, применяемого в способах в соответствии с данным изобретением, не является критическим для данного изобретения. Например, вирус может быть получен выделением из инфицированного животного или пациента, в виде исходных вакцинных вирусов от ВОЗ, покупкой у подходящего агентства (например, АТСС) или от исследовательских лабораторий. В частности, известно, что ВГС вызывает тяжелое респираторное заболевание, включая пневмонию. Таким образом, собаки, имеющие эти симптомы, являются полезными источниками. Подходящие образцы для выделения вируса включают: промывку/аспират из носа, носоглоточный мазок, мазок из горла, бронхоальвеолярный лаваж, аспират из трахеи, пункцию плевральной жидкости, слюну, мазки из клоаки и образцы аутопсии. Образцы от живых животных оптимально должны быть собраны рано, и в некоторых случаях в течение 4 дней после наступления болезни. Образцы могут быть собраны в подходящую транспортную среду для хранения до применения, или применяться немедленно. Если их хранят, вирус может храниться при пониженной температуре, например, такой как 4°С, для сохранения жизнеспособности. Для выделения вируса гриппа из образца, необходимо удалить большое количество примесей (например, центрифугированием), и надосадочную жидкость инокулируют во множество клеток при множестве разведении. Альтернативно, вирус от животного изначально может быть выращен в куриных яйцах. В любой момент процесса могут применяться способы подтверждения того, что вирусный штамм действительно является гриппом.

Для подтверждения присутствия желаемого вируса гриппа в любой момент времени в процессе получения адаптированного к культуре ткани штамма, может применяться множество способов скрининга. Вирус может быть отобран анализом с применением любого известного и/или подходящего анализа для вируса гриппа. Такие анализы включают (отдельно или в сочетании) репликацию вируса, количественное и/или качественное измерение инактивации (например, антисывороткой), транскрипцию, репликацию, введение вириона, вирулентность, НА или NA активность, выход вируса и/или морфгенез, с применением таких методов, как обратная генетика, рекомбинация, комплементация и/или инфекция.

А. Клетки культуры тканей

Любые клетки млекопитающих, в которых возможно выращивание вируса гриппа, могут применяться в представленных здесь способах. Обычно клетки хозяина подходящим образом исключают непредусмотренные агенты и имеют количество пассажей, которое может быть сертифицировано согласно требованиям ВОЗ для производства вакцины. Множество колоний клеток может применяться для выделения и репродуцирования вирусов гриппа. Некоторые колонии клеток, которые могут применяться, включают: клетки Vero (клетки почек обезьяны), клетки MDCK (клетки почек собаки Madin-Darby), клетки ВНК-21 (почки детенышей хомяка) и BSC (клетки почек обезьяны) и клетки НЕК (клетки мезонефроса человека). Таким образом, могут применяться любые клетки культуры тканей, которые позволяют выращивать вирус гриппа. Подходящие клетки включают, но не ограничены ими: Vero, MDBK, BK21, CV-I и любые клетки эмбрионов млекопитающих (например НЕК). В некоторых вариантах применяют клетки Vero или клетки мезонефроса человека. В некоторых вариантах применяют клетки мезонефроса человека (клетки НЕК).

Подходящая среда для культуры клеток для репродуцирования указанных выше колоний клеток известна специалистам в данной области техники. Такая среда может содержать подходящую сыворотку (например, фетальную бычью сыворотку) в концентрации вплоть до 20% об./об. Специалисту в данной области техники будет понятно, что среда, содержащая менее 20% об./об. сыворотки (2-5% об./об.), может применяться для репродуцирования указанных выше колоний клеток.

В. Оптимизация трипсина для клеток

Для выращивания высокого титра штамма вируса в культуре клеток, подходящее количество протеазы может применяться для активации гемагглютинина для интернализации в клетки. Раствор, содержащий протеазу, может быть добавлен непосредственно к изоляту, или изолят может быть разведен в протеазе для выращивания изолята для производства вакцины. Протеаза может применяться для разведения вируса до подходящей МЗ для роста.

Протеазой может быть любая протеаза, которая способна активировать НА для интернализации без повреждения вирусных белков так, что они не могут расти и/или заражать клетки. Такие протеазы включают, но не ограничены ими, прокариотическую протеазу, проназу, трипсин и субтилизин (А), например трипсин IX.

Применяемое количество протеазы должно быть достаточным для активации вируса с очень незначительным токсическим воздействием на клетки. Токсическое действие может быть проанализировано через идентифицирующие характеристики повреждения клетки, такие как отслойка от слоя питательной среды или субстрата, присутствие продуктов распада клеток, появление мертвых клеток и отсутствие живых клеток. Таким образом, «эффективное количество трипсина» является таковым, которое, при применении в течение достаточного количества времени, позволяет трипсину расщеплять вирусные белки, не отслаивая клетки от субстрата и не вызывая другие токсические эффекты. Титрование протеазы также может применяться для повышения производства активного вируса в культуре ткани. Титрование включает идентификацию максимального количества трипсина, которое минимально повреждает клетки. Это количество может варьироваться в зависимости от применяемой культуры клеток и от партии протеазы. Поэтому новые партии протеазы могут быть титрованы для установления оптимального уровня перед применением, и каждая протеаза может быть титрована для каждой культуры клеток. Титрование включает инокуляцию клеток культуры ткани с серийными разведениями протеазы, и инкубацию их в течение подходящего количества времени. Например, могут применяться полушаговые разведения (10^-0,5) протеазы. Время инкубации может варьироваться в зависимости от колонии клеток, но обычно могут составлять от около 2 дней до 7 дней. Уровень протеазы может быть определен с применением типового времени инкубации для применяемых клеток. Например, если 4-дневная инкубация является наилучшей для вируса гриппа, протеаза может быть тестирована инкубацией в течение около 4 дней в присутствии только протеазы. Может применяться наименьшее разведение протеазы, которое не является токсичным или является практически нетоксичным для клеток. Интервал концентрации трипсина, который может применяться в клетках культуры тканей млекопитающих, например, клетках Vero, составляет от около 0,5 мкг/мл до около 10 мкг/мл, но более предпочтительно около 2,5 мкг/мл среды.

Как только идентифицирован оптимальный уровень протеазы, вирус может быть разведен в инфекционной среде с подходящим количеством протеазы (например, трипсина) так, что оптимальный уровень достигается, когда вирус добавляют в клеточную среду. Оптимальное количество трипсина может применяться для клонирования методом серийных разведении с получением адаптированного к культуре ткани изолята, а также роста и сбора изолята.

С. Клонирование методом серийных разведений

Типовая культура вируса является гетерогенной. Таким образом, например, отдельные вирусные частицы в лунке титровального микропланшета может варьироваться в зависимости от инфекционности, репликации и подобных. Серийное разведение применяют для выбора субпопуляций вирусов в культуре, субпопуляций, которые наилучшим образом адаптированы к клеткам, например. Серийное разведение включает разведение в вирусной культуре серийно, вплоть до угасания, например, для определения наилучшей МЗ. Обычно оно включает серию 10-кратных разведений, но может варьироваться в зависимости от титра вируса.

Обычно серийное разведение применяют для идентификации наивысшего разведения, которое оказывает вирусный эффект на клетку. Вирусным эффектом может быть цитопатический эффект (ЦПЭ). Цитопатические эффекты включают любое действие на клетки, вызванное инфекцией вируса гриппа. Они включают, но не ограничены ими: закругление клеток, дегенерацию, отторжение, апоптоз, индуцирование реакционноспособных видов кислорода (РВК), гранулирование и последующее фрагментирование клеток, и отслоение клеток от подложки (такой как чашка Петри). Ячейку с наивысшим разведением собирают. Этот собранный вирус затем разводят до затухания и процесс повторяют. Обычно серийные 10-кратные разведения получают в подходящей сре