Новый способ отделения и определения вирусной нагрузки в образце панкреатина

Новый способ отделения и определения вирусной нагрузки в образце панкреатина

Реферат

Настоящее изобретение относится к способу практически количественного отделения вирусной нагрузки от образца панкреатина и высокочувствительному способу количественного определения вирусной нагрузки в указанном образце панкреатина.

Панкреатин представляет собой уже давно известную смесь различных обладающих физиологической активностью компонентов, которую получают из панкреатических желез млекопитающих. Основными компонентами панкреатина являются пищеварительные ферменты, прежде всего панкреатическая липаза, а также амилазы и протеазы. Благодаря его ценным терапевтическим свойствам и высокой степени безопасности при применении панкреатин в течение длительного времени используют с большим успехом в качестве фармацевтического препарата в ферментной заместительной терапии. В этом отношении наибольшее значение имеет панкреатическая липаза, однако амилазы и протеазы также вносят значительный вклад в терапевтическое благоприятное действие панкреатина. Для терапевтических целей панкреатин, как правило, получают из крупного рогатого скота («бычий панкреатин») или свиней («свиной панкреатин»), при этом свиной панкреатин с количественной точки зрения имеет наибольшее значение. Методы получения панкреатина для терапевтических целей хорошо известны, например, они описаны в публикации ЕР 0115023 А.

Вследствие того, что панкреатин получают из организма животных, исходные продукты могут содержать нежелательные биологические компоненты, такие как бактериальные или вирусные примеси. Однако в течение более чем 100 лет коммерческого применения фармацевтических продуктов, содержащих панкреатин, не было зафиксировано ни одного случая вредного воздействия содержащего вирусные примеси панкреатина на пациентов. Тем не менее, компании, производящие фармацевтические продукты, которые получают из биологических тканей и/или общей воды организма, испытывают все возрастающее давление со стороны регулирующих административных органов в отношении повышения уровня безопасности выпускаемых ими продуктов путем снижения содержания всех примесей до максимального низкого уровня независимо от того, считается ли рассматриваемая примесь патогенной для человека или нет. Таким образом, для применения панкреатина в фармакологических продуктах желательно располагать надежными аналитическими методами обнаружения и количественной оценки таких биологических примесей.

До настоящего времени не был разработан надежный метод количественного обнаружения или выделения вирусных примесей в образце панкреатина. Это, по-видимому, обусловлено тем, что обладающие ферментативной активностью компоненты панкреатина несовместимы с линиями клеток, которые, как правило, применяют для размножения вирусов с помощью методов, известных обычным специалистам в данной области, что затрудняет или даже делает невозможным определение титра вируса в образце панкреатина.

Только в последние годы был разработан метод, позволяющий выделять и определять вирусную нагрузку в образце панкреатина (см. неопубликованную заявку на патент РСТ/ЕР2007/054880). Однако, поскольку вирусная нагрузка в полученных из организма животных препаратах типа панкреатина очень мала, то продолжает сохраняться потребность в разработке обладающих высокой чувствительностью методов выделения и определения вирусной нагрузки в фармацевтических препаратах, прежде всего, в препаратах панкреатина, предназначенных для фармацевтического применения.

Таким образом, в основу изобретения была положена задача разработать высокочувствительный способ практически количественного выделения вирусной нагрузки из образца панкреатина и способ количественного определения вирусной нагрузки в этом образце панкреатина. В частности, задача изобретения заключалась в том, чтобы разработать способ практически количественного выделения инфекционной вирусной нагрузки из образца панкреатина и способ количественного определения инфекционной вирусной нагрузки в этом образце панкреатина.

При создании изобретения неожиданно было установлено, что вирусную нагрузку, прежде всего инфекционную вирусную нагрузку, в образце панкреатина можно практически количественно определять с высокой чувствительностью в том случае, когда вирусную нагрузку сначала выделяют из образца панкреатина с помощью многостадийного процесса центрифугирования и затем выделенную вирусную нагрузку количественно оценивают с использованием хорошо известных вирусологических методов.

В опубликованном JP 12856990 уже был описан метод концентрирования или выделения вирусов гепатита с использованием нестандартной комбинации низкоскоростного центрифугирования и ультрацентрифугирования.

Первый вариант осуществления изобретения относится к способу выделения вирусной нагрузки из образца панкреатина, заключающемуся в том, что осуществляют следующие стадии, на которых:

а) приготавливают жидкий опытный образец панкреатина, пригодный для центрифугирования, из образца панкреатина, не изменяя его вирусной нагрузки;

б) подвергают по меньшей мере одну определенную часть опытного образца панкреатина, полученного на стадии а) способа, по меньшей мере одному низкоскоростному центрифугированию в условиях, в которых вирусы, характеризующиеся константами седиментации ≥120 S, не образуют дебрис;

в) отбрасывают все твердые отложения, которые необязательно образуются на стадии б) способа во время низкоскоростного центрифугирования, и сохраняют супернатант опытного образца панкреатина;

г) подвергают по меньшей мере одну определенную часть супернатанта опытного образца панкреатина, полученного на стадии в) способа, первому ультрацентрифугированию в среде со ступенчатым градиентом, где продолжительность первого ультрацентрифугирования и относительную центробежную силу для первого центрифугирования выбирают таким образом, чтобы вирусная нагрузка количественно транспортировалась из супернатанта опытного образца панкреатина в первую целевую фракцию, находящуюся выше пограничного слоя или в пограничном слое между расположенным сверху компонентом градиента с наименьшей концентрацией и расположенным снизу компонентом градиента со следующей более высокой концентрацией; и количественно выделяют первую целевую фракцию, необязательно включающую любой дебрис, присутствующий после центрифугирования, которая содержит вирусную нагрузку, из супернатанта опытного образца панкреатина;

д) подвергают первую целевую фракцию, полученную на стадии г), второму ультрацентрифугированию, где второе ультрацентрифугирование осуществляют при относительной центробежной силе, превышающей относительную центробежную силу при первом ультрацентрифугировании, в градиентной среде того же типа, который используют для первого ультрацентрифугирования, где градиентная среда представляет собой градиентную среду с более высокой концентрацией по сравнению с концентрацией компонента градиента с наименьшей концентрацией в первой целевой фракции, и

е) получают вторую целевую фракцию, содержащую вирусную нагрузку путем отбрасывания верхних 75 об.% или более жидкости верхнего слоя, соответствующего первой целевой фракции, и получают нижнюю фракцию, соответствующую нижним 25 об.% или менее жидкости верхнего слоя, и полный слой градиентной среды с более высокой концентрацией за исключением любого дебриса, который необязательно присутствует после центрифугирования.

Второй вариант осуществления изобретения относится к способу количественного определения вирусной нагрузки в образце панкреатина, прежде всего инфекционной вирусной нагрузки в образце панкреатина. Например, во втором варианте осуществления изобретения в дополнение к способу, предложенному в первом варианте осуществления изобретения, осуществляют после стадии е) способа дополнительную стадию ж) способа, которая заключается в том, что количественно определяют вирусную нагрузку в образце панкреатина путем определения титра вирусной инфекции в содержащей вирусную нагрузку целевой фракции, что позволяет определять инфекционную вирусную нагрузку в опытном образце.

Если специально не указано иное, то все технические и научные понятия, употребляемые ниже, должны иметь в каждом случае такое же значение, которое обычно подразумевает специалист в конкретной области техники. Диапазоны температур, указанные ниже в настоящем описании, например, в формате «0-15°С», обозначают диапазон температур от 0°С до 15°С, включая в каждом случае границы диапазона. Интервалы времени, указанные ниже в настоящем описании, например, в формате «30-120 мин», обозначают интервал времени от 30 мин до 120 мин, включая в каждом случае границы диапазона. Интервалы времени, указанные ниже в настоящем описании, например, в формате «2-8 ч», обозначают интервал времени от 2 ч до 8 ч, включая в каждом случае границы диапазона. Диапазоны относительной центробежной силы, указанные ниже в настоящем описании, например, в формате «1500-5000×g», обозначают относительную центробежную силу, находящуюся в диапазоне от 1500×g до 5000×g, включая в каждом случае границы диапазона. Диапазоны объема, указанные ниже в настоящем описании, например, в формате «10-15 мл», обозначают диапазон объема от 10 мл до 15 мл, включая в каждом случае границы диапазона. Диапазоны мер длины, указанные ниже в настоящем описании, например, в формате «80-100 мм», обозначают диапазон мер длины от 80 мм до 100 мм, включая в каждом случае границы диапазона.

Способ, предлагаемый в изобретении, можно применять для всех типов панкреатина животного происхождения и в частности его можно применять для обычных поступающих в продажу типов свиного панкреатина и бычьего панкреатина. Предпочтительно способ осуществляют на образцах свиного панкреатина.

Способ, предлагаемый в изобретении, в целом можно применять для выделения вирусной нагрузки из образца панкреатина и последующего количественного определения вирусной нагрузки в образце панкреатина. В частности, способ можно применять для выделения и количественного определения вирусной нагрузки в образцах панкреатина, где вирусная нагрузка представляет собой ротавирус А коров, вирус энцефаломиокардита (EMCV), цирковирус свиней (PCV), парвовирус свиней (PPV), ротавирус А свиней, тешовирус свиней и/или вирус заболевания свиней с везикулярным синдромом (SVDV). Благодаря очень близким свойствам человеческий Коксаки-вирус В 5/1 можно использовать в качестве модели для проверки пригодности способа, предлагаемого в изобретении, для выделения и/или количественного определения SVDV. Благодаря очень близким свойствам ротавирус А коров (например, штамм В 223) можно использовать в качестве модели для проверки пригодности способа, предлагаемого в изобретении, для выделения и/или количественного определения ротавируса А свиней. Способ, предлагаемый в изобретении, можно применять также для определения вирусной нагрузки, обусловленной вирусом гепатита Е (HEV), в образце панкреатина путем выделения вирусной нагрузки согласно описанному способу и последующего анализа с помощью известных методов, например, с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или т.п.

Применяемый на стадии а) способа, предлагаемого в изобретении, жидкий опытный образец панкреатина, который можно использовать для центрифугирования, получают из образца панкреатина без изменения или модификации в нем вирусной нагрузки, прежде всего инфекционной вирусной нагрузки. Это можно осуществлять, например, путем приготовления суспензии опытного образца панкреатина из образца панкреатина. Суспензию опытного образца панкреатина приготавливают, например, путем объединения образца панкреатина со средой для культуры клеток, которая пригодна для линии клеток, используемой для культивирования предназначенных для изучения видов вируса, и с одним или несколькими антибиотиком(ами), пригодным(и) для этой цели. В другом варианте осуществления изобретения суспензию опытного образца панкреатина получают путем объединения образца панкреатина с физиологическим раствором, в частности, с забуференным фосфатом физиологическим раствором («ЗФР», pH 7,2). Как правило, для получения раствора антибиотиков, который необязательно применяют на стадии а) способа, можно использовать любые антибиотики. Как правило, применяют антибиотики широкого спектра действия или смеси таких антибиотиков широкого спектра действия. Пригодные антибиотики можно выбирать, например, из группы, включающей антибиотики β-лактамового типа, такие как пенициллины, цефалоспорины (включая оксацефемы и карбацефемы), карбапенемы и монобактамы; стрептомицин (включая стрептомицина сульфат); неомицины (включая неомицин А, неомицин В и паромомицин); канамицины (включая канамицин, гентамицин, амикацин и тобрамицин); спектиномицин; тетрациклины (включая тетрациклин, окситетрациклин, доксициклин и миноциклин); макролидные антибиотики (включая эритромицин, кларитромицин, рокситромицин, азитромицин, йозамицин и спирамицин); ингибиторы гиразы (включая налидиксиновую кислоту, циноксацин, пипемидиновую кислоту, норфлоксацин, пефлоксацин, ципрофлоксацин, офлоксацин и флероксацин); антагонисты фолиевой кислоты (включая сульфонамидные антибиотики, диаминобензилпиримидины и их комбинации); хлорамфеникол; линкозамиды; гликопептидные антибиотики (включая ванкомицин и теикопланин); фосфомицин; полипептидные антибиотики (включая полимиксин В, колистин, бацитрацин и тиротицин) и мупироцин. Предпочтительными антибиотиками являются стрептомицина сульфат и пенициллин, и смеси стрептомицина сульфата и пенициллина, например, «коктейль» из антибиотиков. Один или несколько антибиотиков можно применять, например, в виде раствора в растворителе, который пригоден для одного или нескольких антибиотиков в каждом случае, т.е. в виде раствора антибиотиков.

Суспензию опытного образца панкреатина, как правило, приготавливают при охлаждении до температуры 0-15°С, например, до температуры 4-10°С. Компоненты для получения суспензии опытного образца панкреатина, как правило, перемешивают при охлаждении на льду в течение по меньшей мере 30 мин, например, 30-120 мин, предпочтительно 45-90 мин, в частности, в течение 50 или 60 мин. Цель охлаждения суспензии опытного образца панкреатина в каждом случае заключается в том, чтобы избежать или по меньшей мере существенно снизить любую нежелательную дезактивацию вирусной нагрузки, обусловленную обладающими ферментативной активностью компонентами, присутствующими в образце панкреатина.

В том случае, когда для приготовления суспензии опытного образца панкреатина используют среду для культур клеток, то выбор среды для культур клеток, применяемой в каждом случае для приготовления суспензии опытного образца панкреатина на стадии а) способа, определяется тем, какие виды вирусов требуется выделять и/или количественно определять с помощью способа, предлагаемого в изобретении. Для культивирования и обнаружения конкретных видов вирусов используют разрешенные для применения культуры клеток, в которых подлежащие изучению виды вирусов инициируют, если это возможно, цитопатический эффект (CPE). СРЕ приводит к модификации зараженных вирусом клеток, которую можно выявлять с помощью световой микроскопии. Если виды вирусов размножаются в культуре клеток без СРЕ, то, как правило, такое размножение можно, тем не менее, выявить с помощью хорошо известных непрямых методов обнаружения.

Если, например, требуется выделить и/или количественно определить ротавирус А коров, то можно, например, применять для его культивирования клетки почки эмбриона обезьяны (клетки линии МА-104). В этом случае в качестве среды для культуры клеток можно применять хорошо известную модифицированную по методу Дульбекко среду Игла (среда Дульбекко). Если требуется выделить и/или количественно определить EMCV, то для его культивирования можно применять клетки почки свиньи (клетки линии РК-15) или клетки почки эмбриона свиньи (клетки линии SPEV). В случае клеток линии РК-15 можно применять в качестве пригодной среды для культуры клеток, например, хорошо известную минимальную незаменимую среду (MEM). В случае клеток линии SPEV в качестве среды для культуры клеток можно применять среду Дульбекко. Если, например, требуется выделить и/или количественно определить PCV, то для его культивирования можно использовать, например, клетки линии РК-15. Если, например, требуется выделить и/или количественно определить PPV, то для его культивирования можно использовать, например, клетки почки свиньи (клетки линии SK-6). В этом случае в качестве среды для культуры клеток можно применять, например, среду Дульбекко. Если, например, требуется выделить и/или количественно определить ротавирус А свиней, то для его культивирования можно использовать, например, клетки линии МА-104. Если, например, требуется выделить и/или количественно определить тешовирус свиней, то для его культивирования можно использовать, например, клетки линии РК-15. Если, например, требуется выделить и/или количественно определить SVDV, то для его культивирования можно использовать, например, клетки линии SPEV. Специалист в данной области располагает сведениями о том, какие линии клеток пригодны для культивирования конкретных видов вирусов и какие среды для культивирования клеток можно использовать для этой цели. Виды вирусов, которые можно применять согласно настоящему изобретению, и пригодные для этой цели линии клеток можно получать из соответствующих источников, таких, например, как «Американская коллекция типовых культур (American Туре Culture Collection)», Манассас, США (АТСС), «Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур ГмбН (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH), Брауншвейг, Германия (DSMZ), «Институт Фридриха-Леффлера (Friedrich-Loffler-Institut)», Федеральный исследовательский институт ветеринарии (Federal Research Institute for Animal Health), Инзель Риме, Германия (FLI) или «Отделение ветеринарной службы (Veterinary Service Division))) «Департамента сельского хозяйства и сельского развития (Department of Agriculture and Rural Development)», Белфаст, Великобритания (DARD).

На стадии б) способа опытный образец панкреатина, полученный на стадии а) способа, можно либо использовать полностью, либо можно использовать определенную часть опытного образца панкреатина, в частности, определенный объем этого опытного образца панкреатина. Предпочтительно опытный образец панкреатина, полученный на стадии а) способа, используют полностью.

На стадии б) способа при осуществлении низкоскоростного центрифугирования можно создавать условия, в которых вирусы, характеризующиеся константами седиментации ≥120 S, прежде всего от ≥120 S до 5000 S, еще не образуют дебрис. Как правило, вирусы, характеризующиеся константами седиментации ≥120 S, прежде всего вирусы, характеризующиеся константами седиментации от ≥120 S до 5000 S, еще не образуют дебрис, когда низкоскоростное центрифугирование осуществляют при относительно небольших центробежных силах, составляющих в каждом случае менее 15000×g, предпочтительно составляющих в каждом случае 8000-15000×g, наиболее предпочтительно составляющих в каждом случае 102000-13500×g, например, составляющих в каждом случае 10800×g. Продолжительность стадии низкоскоростного центрифугирования обычно составляет по меньшей мере 5 мин, как правило, 5-60 мин, прежде всего 10-45 мин, предпочтительно 10-30 мин, например, 15 мин. В предпочтительном варианте осуществления стадии б) способа стадии низкоскоростного центрифугирования осуществляют при охлаждении до температуры 0-15°С, например, до температуры 4-10°С, предпочтительно в охлаждаемой центрифуге.

Цель осуществления процедур низкоскоростного центрифугирования на стадии б) способа заключается в основном в удалении из суспензии панкреатина таких компонентов панкреатина, как нерастворимые частицы и т.д., которые разрушаются в процессе выделения и/или количественного определения вирусной нагрузки в образце панкреатина, для получения супернатанта опытного образца панкреатина, пригодного для дальнейшего процессинга. Таким образом, твердые отложения, которые необязательно получают на стадиях низкоскоростного центрифугирования, как правило, отбрасывают при осуществлении стадии в), в то время как супернатант используют на следующей стадии г) способа. Стадии низкоскоростного центрифугирования с последующим отбрасыванием необязательно полученных при этом твердых отложений, как правило, повторяют до тех пор, пока твердые отложения не перестают образовываться. Как правило, после осуществления 1-3 повторов, в частности, уже после одного повтора, не требуется дополнительных повторов стадий низкоскоростного центрифугирования с последующим отбрасыванием необязательно полученных при этом твердых отложений. В одном из вариантов осуществления изобретения твердое отложение, полученное при осуществлении стадии б) способа, может представлять собой осадок или дебрис.

В одном из вариантов осуществления изобретения осуществляют отмывку отложения, полученного на стадиях низкоскоростного центрифугирования, перед его отбрасыванием один раз или более, например, 1-3 раза, с помощью пригодной жидкости для отмывки. Пригодной жидкостью для отмывки может служить, например, сам супернатант опытного образца панкреатина, полученный после низкоскоростного центрифугирования, который затем можно применять на стадии г) способа. Если жидкость для отмывки отлична от супернатанта опытного образца панкреатина, то после завершения отмывки отложения ее объединяют с супернатантом опытного образца панкреатина и затем используют на стадии г) способа. Наиболее предпочтительно осуществлять отмывку отложения указанным выше образом перед осуществлением стадии г) способа в том случае, когда вирусная нагрузка образца панкреатина представляет собой EMCV.

Конкретным вариантом осуществления изобретения является также супернатант опытного образца панкреатина, который можно получать согласно указанным выше стадиям а)-в) способа.

В качестве среды со ступенчатым градиентом для стадии г) способа, как правило, используют ступенчатый двухфазный градиент сахарозы. Среда со ступенчатым градиентом предпочтительно представляет собой градиент, полученный с помощью 50% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы и 20% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы. В качестве буфера для растворов сахарозы можно применять, например, нейтральные буферы (т.е. буферы со значением pH примерно 7). Предпочтительно в качестве буфера применяют ЗФР («забуференный фосфатом физиологический раствор», pH 7,2). Как правило, используют стерильные среды с градиентом. Двухфазный ступенчатый градиент сахарозы указанного выше типа обеспечивает наиболее пригодные условия для осаждения и следовательно для выделения вирусов, которые могут быть обнаружены. Кроме того, ступенчатые градиенты сахарозы, прежде всего полученные как указано выше с помощью 50% (мас./об.) необязательно забуференного раствора сахарозы и 20% (мас./об) забуференного раствора сахарозы, создают пригодные осмотические условия, которые не приводят к дезактивации любой присутствующей вирусной нагрузки.

Ультрацентрифугирование, осуществляемое на стадии г) способа, гарантирует, например, что вирусная нагрузка, источником которой является образец панкреатина, практически количественно переносится из супернатанта опытного образца панкреатина в среду со ступенчатым градиентом. Понятие «практически количественно» в данном случае означает, что вирусная нагрузка, первоначально добавленная к в опытному образцу, выделяется настолько полностью, что разница между титром исходной вирусной нагрузки и титром вирусной нагрузки, выделенной в результате ультрацентрифугирования, равна или составляет менее половины единицы десятичного логарифма титра вируса (0,5 log-единицы). Кроме того, первое ультрацентрифугирование согласно стадии г) способа гарантирует, что вирусная нагрузка переносится в первую целевую фракцию, достаточно удаленную от опытного образца панкреатина, чтобы можно было механически отделить ее от опытного образца панкреатина без какого-либо повторного смешения фаз, нарушающего требуемое отделение.

Стадию г) способа обычно осуществляют путем внесения в ультрацентрифужную пробирку взятой в определенном объеме среды для градиентного центрифугирования (градиентной среды) с наибольшей концентрацией, на которую наслаивают взятые в определенном объеме градиентные среды со следующими более низкими концентрациями. Этот процесс повторяют столько раз, сколько необходимо для получения многофазной градиентной среды, где конечный (верхний) слой представляет собой объем жидкого опытного образца панкреатина, из которого требуется выделить вирусную нагрузку. В случае двухфазной градиентной среды на объем градиентной среды со следующей более низкой концентрацией сразу наслаивают объем жидкого опытного образца панкреатина или суспензии опытного образца панкреатина (объем опытного образца панкреатина), предназначенного для центрифугирования. В случае двухфазной градиентной среды это позволяет создавать в ультрацентрифужной пробирке следующую последовательность фаз (сверху вниз): первый слой, представляющий собой объем опытного образца панкреатина (верхний слой), затем объем градиентной среды с наименьшей концентрацией (средний слой, например, представляющий собой 20% (мас./об.) забуференный раствор сахарозы) и, наконец, объем градиентной среды с наибольшей концентрацией (нижний слой, покрывающий дно ультрацентрифужной пробирки; например, 50% (мас./об.) забуференный раствор сахарозы). При наслаивании каждого из объемов необходимо соблюдать осторожность для того, чтобы гарантировать, что на соответствующих границах не возникало турбулентности или перемешивания.

Первая целевая фракция, используемая на стадии г) способа, как правило, представляет собой (I) часть градиентной среды с наименьшей концентрацией, которая достаточно удалена и отделена от объема опытного образца панкреатина, и (II) весь объем градиентной среды со следующей более высокой концентрацией. В случае двухфазной градиентной среды целевая фракция представляет собой, например, часть градиентной среды с наименьшей концентрацией, которая достаточно удалена и отделена от объема опытного образца панкреатина, и весь объем градиентной среды с наибольшей концентрацией, простирающийся до дна ультрацентрифужной пробирки, необязательно включая дебрис, находящийся на дне этой пробирки.

При расчете положения первой или второй целевой фракции, которая достаточно удалена от объема опытного образца панкреатина для того, чтобы можно было осуществлять последующее отделение, следует иметь в виду, что получаемые расчетом значения для положения частиц (т.е. положение вирусных частиц, выделенных из образца панкреатина), как правило, соответствуют вершине гауссовского распределения. В таком случае частицы должны быть распределены как выше, так и ниже их полученного расчетом положения. Таким образом, при определении требуемого расстояния целевой фракции от объема опытного образца панкреатина необходимо брать дополнительный запас для учета гауссовского распределения положений частиц. Вирусную нагрузку обычно переносят в целевую фракцию, которая достаточно удалена от объема опытного образца панкреатина для того, чтобы можно было осуществлять последующее отделение, если частицы, характеризующиеся константой седиментации, составляющей ≥120 S, в частности от ≥120 S до 5000 S, мигрировали вследствие ультрацентрифугирования из объема опытного образца панкреатина по меньшей мере на 10 мм, например, по меньшей мере на 15 мм, по меньшей мере на 20 мм, по меньшей мере на 25 мм или по меньшей мере на 30 мм в градиентную среду с наименьшей концентрацией. В случае описанной выше двухфазной градиентной среды градиентная среда с наименьшей концентрацией представляет собой 20% (мас./об.) забуференный раствор сахарозы. В одном из вариантов осуществления стадии ультрацентрифугирования практически все частицы, характеризующиеся константой седиментации, составляющей ≥120 S, в частности, составляющей от ≥120 S до 5000 S, полностью проходили через градиентную среду с наименьшей концентрацией и концентрировались в пограничном слое, примыкающем к градиентной среде со следующей более высокой концентрацией (т.е. на «сахарозной подушке»). Специалист в данной области должен обладать сведениями о пригодных методах расчета и уметь применять соответствующие условия для ультрацентрифугирования. Пригодные условия для ультрацентрифугирования можно определять на основе характеристик вируса(ов), подлежащего(их) выделению из образца панкреатина (например, плотности и константы седиментации), при этом подразумевается, что можно применять хорошо известные упрощения (см., например, Lebowitz и др., «Modern analytical ultracentrifugation in protein science: A tutorial review»; Protein Science 11, 2002, cc.2067-2079).

При условии, что первое ультрацентрифугирование осуществляют с использованием обычных объемных соотношений и в среде со ступенчатым градиентом, предпочтительно в двухфазном ступенчатом градиенте сахарозы, то вирусную нагрузку, как правило, транспортируют в первую целевую фракцию, пригодную для последующего выделения с помощью второго ультрацентрифугирования, если первое ультрацентрифугирование осуществляют в течение по меньшей мере 1 ч, как правило, по меньшей мере 4 ч, например, в течение по меньшей мере 9 ч, например, в течение 9-20 ч, в частности, в течение 12-18 ч. Пригодная относительная центробежная сила для первого ультрацентрифугирования, указанного в настоящем описании, составляет по меньшей мере 50000×g и/или менее 150000×g. В одном из вариантов осуществления первой стадии ультрацентрифугирования указанную стадию осуществляют в течение 12-18 ч при относительной центробежной силе, составляющей 50000-150000×g, в объемных соотношениях, обычно применяемых для ультрацентрифугирования, и в градиенте, полученном с использованием 50% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы и 20% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы. В другом варианте осуществления первой стадии ультрацентрифугирования указанную стадию осуществляют в течение 15-17 ч при относительной центробежной силе, составляющей 70000-120000×g, в объемных соотношениях, обычно применяемых для ультрацентрифугирования, и в градиенте, полученном с использованием 50% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы и 20% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы. Объемные соотношения, обычно применяемые для ультрацентрифугирования, получают, например, в том случае, когда применяют обычные ультрацентрифужные пробирки. Обычными ультрацентрифужными пробирками в данном случае являются, например, пробирки имеющие объем 10-50 мл, в частности, 25-50 мл. В том случае, когда на стадии г) способа используют обычную ультрацентрифужную пробирку, объем среды для градиентного ультрацентрифугирования с наибольшей концентрацией (например, 50% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы) может составлять, например, до 2 мл, объем градиентной среды со следующей более низкой концентрацией (например, 20% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы) может составлять, например, до 14 мл, и объем опытного образца панкреатина может составлять, например, до 17 мл.

Второе ультрацентрифугирование осуществляют на стадии д) с использованием первой целевой фракции, полученной на стадии г), помещая указанную первую целевую фракцию на подушку градиентной среды. Указанная подушка градиентной среды представляет собой, например, градиентную среду того же типа, которую применяли при осуществлении первого ультрацентрифугирования, при этом градиентная среда представляет собой градиентную среду с более высокой концентрацией по сравнению с концентрацией компонента градиента с наименьшей концентрацией первой фракции. Например, если в случае первого ультрацентрифугирования ступенчатый градиент для центрифугирования при использовании описанной выше системы представляет собой 20% (мас./об.) забуференный раствор сахарозы и 50% (мас./об.) забуференный раствор сахарозы, то полученная первая целевая фракция представляет собой забуференный раствор сахарозы с концентрацией более 20% (мас./об.) и менее 50% (мас./об.). В этом случае сахарозная подушка может представлять собой 50% (мас./об.) забуференный раствор сахарозы. Первая целевая фракция, используемая на стадии г), как правило, содержит также весь, необязательно присутствующий после первого центрифугирования.

Второе ультрацентрифугирование осуществляют в течение по меньшей мере 1 ч, как правило, в течение по меньшей мере 2 ч, например, в течение 2-8 ч, в частности, в течение 3-6 ч. Пригодная относительная центробежная сила для указанного в настоящем описании второго ультрацентрифугирования составляет по меньшей мере 100000×g, например, превышает 150000×g, например, составляет 150000-350000×g. В одном из вариантов осуществления второй стадии ультрацентрифугирования указанную стадию осуществляют в течение 3-6 ч при относительной центробежной силе 200000-350000×g при объемных соотношениях, общепринятых при осуществлении ультрацентрифугирования. В другом варианте осуществления второй стадии ультрацентрифугирования указанную стадию осуществляют в течение 4,5-5,5 ч при относительной центробежной силе 250000-300000×g при объемных соотношениях, общепринятых при осуществлении ультрацентрифугирования. Объемные соотношения, обычно применяемые для ультрацентрифугирования, получают, например, в том случае, когда применяют обычные ультрацентрифужные пробирки. Обычными ультрацентрифужными пробирками в данном случае являются пробирки имеющие объем 10-15 мл, в частности, 12-13 мл; внутренний радиус 6-8 мм, в частности, 7 мм, и высоту 80-100 мм, в частности, 85-95 мм. В том случае, когда на стадии г) способа используют обычную ультрацентрифужную пробирку, объем градиентной подушки (например, 50% (мас./об.) забуференного раствора сахарозы) может составлять, например, до 0,5 мл, а объем первой целевой фракции может составлять, например, до 10 мл.

Настоящее изобретение позволяет проводить обнаружение с пределом обнаружения, составляющим вплоть до одной инфекционной единицы на один грамм образца панкреатина, используемого в качестве исходного продукта.

В предпочтительном варианте осуществления стадий г) и д) способа вне зависимости от прочих выбранных условий ультрацентрифугирование осуществляют при охлаждении до температуры 0-15°С, предпочтительно до температуры 4-10°С.

На этой стадии способа можно применять обычные охлаждаемые центрифуги, известные специалисту в данной области. На стадиях г) и д) способа, как правило, применяют обычную поступающую в продажу ультрацентрифугу, такую как охлаждаемая ультрацентрифуга с ротором с качающимися стаканами, например, ультрацентрифуга Sorvall® с ротором с качающимися стаканами модели «ТН-641».

Специалист в данной области, опираясь, прежде всего на дополнительную техническую информацию, приведенную в описании настоящего изобретения, может повышать или понижать масштаб описанных выше стадий низкоскоростного центрифугирования и стадий ультрацентрифугирования, предлагаемых в изобретении, в любой требуемой степени.

На стадиях г) и е) способа первую или вторую целевую фракцию, содержащую вирусную нагрузку, количественно выделяют из супернатанта опытного образца панкреатина и первой целевой фракции соответственно. Выделение, как правило, осуществляют, устанавливая метку на ультрацентрифужную пробирку на предварительно определенной высоте границы фракции-мишени. Затем весь объем, находящийся выше этой границы, удаляют от оставшегося объема, например, путем аспирации. Аспирацию можно осуществлять, например, с помощью обычного шлангового насоса, трубопровода и капилляров, которые перед этим следует подвергнуть стерилизации. Пригодная скорость откачки составляет, например, 2 мл/мин. В процессе аспирации следует принимать меры для того, чтобы капилляр шлангового насоса всегда находился на верхней границе жидкости. Целевую фракцию, оставшуюся в ультрацентрифужной пробирке, можно затем удалять из ультрацентрифужной пробирки хорошо известным методом с помощью обычной одноканальной пипетки, предпочтительно со стерильным концом. В это же время можно удалять любой осадок, все еще остающийся в ультрацентр