2491345 - Ферментационная среда и способ для получения рекомбинантных белков

Ферментационная среда и способ для получения рекомбинантных белков

Иллюстрации

Показать все

Изобретение относится к биотехнологии. Ферментационная среда для получения рекомбинантных белков с использованием индуцируемых метанолом грибов вида Pichia pastoris характеризуется поддерживаемой концентрацией мочевины или ее производных в интервале от приблизительно 0,3 М до приблизительно 1 М. Среда содержит на литр воды основные соли в следующих количествах: ортофосфорную кислоту (85%) от 2,67 до 133,5 мл, сульфат кальция от 0,093 до 4,65 г, сульфат калия от 1,82 до 91 г, сульфат магния-7H₂O от 1,49 до 74,5 г, гидроксид калия от 0,413 до 20,65 г, глицерин от 4 до 200 г, и на литр воды микроэлементы в следующих количествах: сульфат меди-5H₂O от 0,6 до 30 г, иодид натрия от 0,008 до 0,4 г, сульфат марганца-H₂O от 0,3 до 15 г, молибдат натрия-H₂O от 0,02 до 1 г, борная кислота от 0,002 до 0,1 г, хлорид кобальта от 0,05 до 2,5 г, хлорид цинка от 2 до 100 г, сульфат железа двухвалентного-7H₂O от 6,5 до 325 г, биотин от 0,02 до 1 г, серную кислоту от 0,5 до 25 мл. Способ для получения рекомбинантных белков включает стадию размножения индуцируемых метанолом грибов вида Pichia pastoris и стадию экспрессии рекомбинантного белка при использовании указанной ферментационной среды, в которой осуществляют подпитку метанолом со скоростью от приблизительно 6 г/л/час до приблизительно 20 г/л/час. Изобретение обеспечивает повышенный выход целевых продуктов. 2 н. и 9 з.п. ф-лы, 27 ил., 16 пр.

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к применению амидов карбоновых кислот, таких как мочевина или ее производные, карбаматы, карбодиимиды и тиокарбамиды, в качестве азотных добавок в ферментационные среды для получения рекомбинантных белков с целью достижения повышенных уровней биоконверсии, и пептидов, подобных инсулину и аналогам инсулина, экстендина и ферментов, таких как липаза, с использованием индуцируемых метанолом грибных экспрессирующих систем, таких как Pichia. Существенные аспекты изобретения, в частности, относятся к экспериментальному процессу ферментации с использованием оптимизированных параметров питательных сред, отвечающих за более высокий выход продукта в течение более коротких периодов образования. Принцип настоящего изобретения можно также применить для продукции широкого круга белков и вторичных метаболитов посредством ферментации подходящего экспрессирующего организма.

Уровень техники

Экспрессирующие системы на основе дрожжей, таких как Pichia pastoris, обычно используют для экспрессии рекомбинантных белков, см. статью Cregg, J.М. et al., в Dev. Ind. Microbiol. 29: 33-41; 1988. Экспрессирующая система P. pastoris использует индуцируемый метанолом промотор алкогольоксидазы (АО1), который контролирует ген, который кодирует экспрессию алкогольоксидазы, фермента, который катализирует первую стадию метаболизма метанола (см. статью Cregg J М. et al. в Bio/Technology 11: 905-910; 1993). P. pastoris обладает потенциалом высоких уровней экспрессии, эффективной секреции внеклеточного белка, посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование, и роста до высоких значений густоты клеток на минимальной среде в биореакторных культурах.

Способ периодической ферментации с подпиткой с использованием Pichia pastoris описан в "Pichia fermentation Process Guidelines" (Руководство по процессу ферментации Pichia) фирмы Invitrogen Co. (San Diego, СА), далее его обозначают как контроль. Для получения рекомбинантных белков трансформированную Pichia pastoris выращивают до требуемой биомассы, соответствующей высокой густоте клеток, на глицерине в качестве источника углерода. Фазу образования продукта инициируют подпиткой метанолом, который служит индуктором и единственным источником углерода для культуры. Во время образования биомассы и фазы образования продукта аммиак, который служит источником азота, используют для контроля pH.

Несмотря на различные преимущества, даваемые дрожжевыми экспрессирующими системами, еще имеется необходимость в оптимизации испытывающей влияние питательных компонентов физико-химической среды для эффективной и максимальной продукции белка в биореакторах. Весьма необходимым является достижение высокой специфической продуктивности. Она может быть получена путем оптимизации исходного состава среды, стратегии подпитки метанолом и физико-химических параметров процесса. Имеются публикации, в которых сульфат аммония, фосфат аммония, диаммоний фосфат, нитрат калия, мочевину, кукурузный сироп, соевую муку, хлопковую муку, мелассы сахарного тростника и свеклы, пептоны, мучные гидролизаты и т.п. используют в качестве источника азота для выращивания бактерий, дрожжей и грибов. Использование различных источников углерода и азота для "роста" микроорганизмов представляет собой предшествующий уровень техники.

Однако оптимальная комбинация специально определенных источников углерода и азота для эффективной продукции рекомбинантных белков, пептидов и ферментов не раскрыта в литературе, соответствующей предшествующему уровню техники. Например, заявка WO/2007/005646 раскрывает продукцию этанола по сути путем культивирования рекомбинантных дрожжей на комплексной среде для роста, содержащей сложные углеводы, а также ряд более дешевых источников азота, таких как кукурузный сироп, кукурузный экстракт, дрожжевой автолизат и мочевина. Кроме того, в данном способе не используют индуцируемый метанолом механизм для роста или продукции в отличие от разработанного в настоящем изобретении способа получения рекомбинантных белков. Аналогично патент США 4288554 описывает непрерывный способ ферментации только для роста не-ГМО (негенномодифицированного) вида Candida с использованием мочевины в комбинации с другими источниками азота и основной солевой среды. В данном случае отсутствует какое-либо предположение или описание того, где мочевина может быть использована во время процесса ферментации (периодической, периодической с подпиткой, непрерывной) с использованием индуцируемой метанолом ГМО Pichia pastoris для эффективной продукции рекомбинантных белков и пептидов, например, человеческого инсулина и его аналогов или ферментов, подобных липазе.

Неожиданно обнаружено, что использование описанной ферментационной среды, характеризующейся контролируемым добавлением некоторых богатых и легко растворимых источников азота, таких как мочевина, дополнительно в оптимизированных концентрациях относительно остаточных концентраций мочевины, а также остаточных концентраций аммиака, генерированных при гидролизе мочевины, дает повышенное образование продукта, продуктивность и, таким образом, уменьшенное время продукции.

Продукция рекомбинантных белков с использованием Е. coli давно известна, и экспрессирующая система хорошо изучена и понята. Экспрессирующую систему на основе Е. coli широко используют для получения таких молекул, как Г-КСФ (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), ГРЧ (человеческий гормон роста), стрептокиназа и многих других биологических продуктов. Для получения рекомбинантных белков трансформированную Е. coli выращивают до требуемой биомассы высокой густоты клеток на декстрозе в качестве источника углерода. Фазу образования продукта инициируют путем индукции с использованием требуемого индуктора и затем культуру только поддерживают с помощью минимального добавления питательных веществ до конца ферментации.

Многие годы культуры грибов используют для получения ценных биомолекул, например, ферментов, и других полезных молекул. Грибные культуры, например, Rhizopus, Aspergillus, Penicillium и т.п., используют в классической ферментации, предназначенной для получения широкого круга ферментов, например, липаз, амилаз, декстраназ и т.п., которые используют в пищевой, текстильной, кожевенной и других подобных отраслях промышленности. Актиномицеты, известные как основные компоненты для получения антибиотиков, широко используют для получения ряда вторичных метаболитов, полезных для человека. Одним из ключевых свойств грибов и актиномицетов является свойство "биоконверсии", например, гидроксилирования, эстерификации и т.п. Основное преимущество состоит в том, что биоконверсия специфична в отношении мишени, и можно получить продукты относительно высокой чистоты. Классическим примером является конверсия компактина в правастатин.

Методологические усовершенствования, известные в области техники, включают меры, относящиеся к технологии ферментации, такие как перемешивание или снабжение кислородом, либо модификацию, относящуюся к составу питательных сред, такую как модификация концентраций Сахаров во время ферментации, изменения обработки походу процесса или изменения, относящиеся к природным свойствам самого микроорганизма и т.п.

Неожиданно обнаружено, что использование ферментационной среды, характеризующейся контролируемым добавлением некоторых богатых и легко растворимых источников азота, таких как мочевина, дает повышенную продуктивность и/или повышенный уровень биоконверсии и, таким образом, уменьшенное время продукции.

Раскрытие изобретения

Главной целью настоящего изобретения является получение ферментационной среды для продукции рекомбинантных белков, их производных или аналогов путем ферментации с использованием индуцируемых метанолом видов грибов.

Другой главной целью настоящего изобретения является получение ферментационной среды для продукции рекомбинантных белков, их производных или аналогов путем ферментации с использованием с использованием микроорганизмов.

Кроме того, другой главной целью настоящего изобретения является получение ферментационной среды для продукции вторичных метаболитов путем ферментации с использованием микроорганизмов.

Еще одной главной целью настоящего изобретения является разработка способа получения рекомбинантных или нерекомбинантных продуктов, их производных или аналогов.

Еще одной главной целью настоящего изобретения является разработка способа получения вторичных метаболитов.

Еще одной главной целью настоящего изобретения является разработка способа биоконверсии компактина в правастатин.

Еще одной главной целью настоящего изобретения является получения рекомбинантного белкового продукта.

Соответственно, настоящее изобретение относится кферментационной среде, предназначенной для получения рекомбинантных белков, их производных и аналогов путем ферментации с использованием индуцируемых метанолом видов грибов, причем указанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты; ферментационной среде, предназначенной для получения рекомбинантных белков, их производных и их аналогов путем ферментации с использованием микроорганизмов, причем указанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты; ферментационной среде, предназначенной для получения вторичных метаболитов путем ферментации с использованием микроорганизмов, причем указанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты; способу получения рекомбинантных белков, их производных или их аналогов, который предусматривает размножение индуцируемых метанолом видов грибов, экспрессирующих инсулин, в ферментационной среде, причем указанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты; способу получения рекомбинантных или нерекомбинантных белковых продуктов, их производных или их аналогов, который предусматриваетразмножение индуцируемого или неиндуцируемого микроорганизма, экспрессирующего белок в ферментационной среде, причем указанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты; способу получения вторичных метаболитов, который предусматривает размножение микроорганизма в ферментационной среде, причем указанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты; способу биоконверсии компактина в правастатин, причем указанную конверсию осуществляют в среде, отличающейся тем, что указанная среда содержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты; и рекомбинантный белковый продукт, полученный как заявлено в любом из предшествующих пунктов формулы изобретения.

Настоящее изобретение относится к ферментационной среде для получения рекомбинантных белков, их производных или их аналогов посредством ферментации с использованием индуцируемых метанолом видов грибов, причем указанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения амид угольной кислоты выбран из группы, содержащей мочевину или ее производные, такие как диметилмочевина, диэтилмочевина, N-ацетилфенилмочевина, изопропилпилидинмочевина, фенилмочевина, или их комбинацию.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения амид угольной кислоты представляет собой мочевину.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения амид угольной кислоты добавляют в форме жидкости, спрея, порошка или гранул.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения остаточная концентрация амида угольной кислоты составляет до 1 М.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения концентрации основных солей и микроэлементов варьируют от 0,1X до 5X от контрольной среды, сохраняя остаточную концентрацию амида угольной кислоты до 1 М.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения повышено потребление фосфата.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения индуцируемые метанолом виды грибов, экспрессирующие рекомбинантный продукт инсулина, выбраны из группы, включающей Pichia pastoris, Pichia sp., Saccharomyces sp., Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp. и Hansenula polymorpha.

Настоящее изобретение относится к ферментационной среде для получения рекомбинантных белков, их производных и их аналогов путем ферментации с использованием микроорганизмов, причем указанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты.

Настоящее изобретение относится к ферментационной среде для получения вторичных метаболитов путем ферментации с использованием микроорганизмов, причем указанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения амид угольной кислоты выбран из группы, включающей мочевину или ее производные, такие как диметилмочевина, диэтилмочевина, N-ацетилфенилмочевина, изопропилпилидинмочевина, фенилмочевина, или их комбинацию.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения остаточная концентрация амида угольной кислоты составляет до 10 г/л.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения микроорганизм выбран из группы, содержащей E.coli, Streptomyces sp, Aspergillus sp, Rhizopus sp, Penillium sp и Rhizomucor sp.

Настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантных белков, их производных или их аналогов, который предусматривает размножение индуцируемых метанолом экспрессирующих инсулин видов грибов в ферментационной среде, причем указанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты.

В еще одном варианте осуществления данного изобретения полученный рекомбинантный продукт инсулина представляет собой IN-105.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полученный рекомбинантный продукт инсулина представляет собой предшественник инсулина, инсулин или его аналоги либо его производные.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения рекомбинантный продукт инсулина представляет собой инсулин гларгин.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полученный рекомбинантный белок представляет собой циклический или нециклический пептид.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения рекомбинантный пептид представляет собой эксендин.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полученный рекомбинантный белок представляет собой фермент.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полученный продукт рекомбинантного фермента представляет собой липазу.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полученный рекомбинантный белок выбран из группы, содержащей предшественник инсулина, инсулин или его аналоги либо его производные, гларгин, эксендин, карбоксипептидазу и липазу.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения индуцируемый метанолом вид грибов представляет собой Pichia pastoris.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения уровень подпитки метанолом составляет до 20 г/л бульона в час.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полученный максимальный титр продукта превышает 0,1 г/л.

Настоящее изобретение относится к способу получения рекомбинантных или нерекомбинантных белковых продуктов, их производных или их аналогов, который предусматриваетразмножение индуцируемого или неиндуцируемого экспрессирующего белок микроорганизма в ферментационной среде, причем указанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полученный рекомбинантный белковый продукт представляет собой Г-КСФ.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полученный рекомбинантный продукт представляет собой стрептокиназу.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения белковый продукт представляет собой липазу.

Настоящее изобретение относится к способу получения вторичных метаболитов, который предусматривает размножение микроорганизма в ферментационной среде, причем указанная среда отличается тем, что содержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения полученный вторичный метаболит представляет собой правастатин.

Настоящее изобретение относится к способу биоконверсии компактина в правастатин, причем конверсию осуществляют в среде, отличающейся тем, что указанная среда содержит эффективную концентрацию амида угольной кислоты.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения биоконверсия компактина в правастатин составляет по меньшей мере 35%.

Настоящее изобретение относится к рекомбинантному белковому продукту, полученному, как описано выше.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения полученный рекомбинантный белковый продукт выбран из группы, включающей предшественник инсулина, инсулин или его аналоги либо его производные, гларгин, эксендин, карбоксипептидазу и липазу.

Изобретение предусматривает композицию питательных веществ, предназначенную для применения при разработке ферментационной среды, причем композиция содержит азотные компоненты, такие как амиды угольной кислоты, например, мочевину и вышеупомянутые родственные формы или производные, вместе с одним или более других компонентов ферментационной среды, которые специально оптимизированы для получения повышенного выхода инсулина или родственных аналогов производных продуктов за сокращенные периоды времени образования.

Неожиданно обнаружено, что использование определенной ферментационной среды с добавлением ряда азотсодержащих источников, таких как амиды угольной кислоты, например, мочевину и родственные формы или производные в специфических концентрациях не действует на рост дрожжевых клеток и не способствует повышению продуктивности.

Дополнительный азотный компонент, например, мочевину, можно добавить в форме жидкости, спрея, порошка или гранул.

Основная проблема изобретения состоит в том факте, что на продуктивность способа ферментации инсулина или аналога инсулина с помощью Pichia sp. сильно влияет содержание мочевины в среде для культивирования. Вследствие этого выход продукта значительно повышается, особенно при сокращенных периодах времени ферментации, при добавлении азотного компонента, такого как мочевина, в среду для культивирования.

Согласно наиболее предпочтительному варианту осуществления изобретения добавление мочевины в ферментационную среду повышает уровень потребления ключевого ингредиента "фосфата", который, в свою очередь, повышает продуктивность. Обнаружено, что чем быстрее происходит потребление фосфата, тем короче время цикла ферментации и, следовательно, выше продуктивность. Таким образом впервые показан метаболизм мочевины наряду с фосфатом, который повышает уровень экспрессии белка или пептида, не воздействуя на профиль роста и сокращает время ферментации.

Согласно другому аспекту изобретения добавление мочевины обеспечивает повышенный уровень выделения продукта в конце ферментации при любом pH.

Таким образом настоящее изобретение дает повышенные выходы белкового продукта, сокращенное время цикла продукции, улучшенное использованием питательных веществ, вводимых в процесс, и в целом снижает капитальные затраты и себестоимость производства.

Подходящий микробный штамм для промышленного способа ферментации с использованием химически определенной среды может представлять собой штамм дикого типа, продуцирующий ценное соединение, представляющее интерес, при условии, что указанный штамм дикого типа имеет хорошие характеристики роста.

Предпочтительные дрожжи для применения в качестве организма-продуцента включают, например, Pichia pastoris, Pichia sp., Saccharomyces sp., Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromycessp.или Hansenula polymorpha.

Кроме того, подходящий микробный штамм для промышленного способа ферментации с использованием химически определенной среды может представлять собой штамм, который получают и/или усовершенствуют тем, что родительский штамм, представляющий интерес, подвергают классической мутагенной обработке или трансформации рекомбинантный ДНК, также при условии, что полученный в результате мутант или трансформированный микробный штамм имеет хорошие характеристики роста на химически определенной среде. Таким образом от характеристик роста родительского штамма на химически определенной среде будет зависеть, будут ли полученные в результате мутант или трансформированные штаммы иметь улучшенные или подобные характеристики роста на химически определенной среде по сравнению с характеристиками родительского штамма.

Как должен понимать компетентный специалист в области техники, оптимальная концентрация добавок амида угольной кислоты будет варьировать от клона к клону, хотя во всех случаях конечным результатом является получение более высокого титра за меньшее время.

Термин "ферментационные среды" или "ферментационная среда" относится к окружающей среде, в которой проводят ферментацию, который включает ферментационные субстраты и другое сырье, используемое ферментирующими микроорганизмами для образования специфического лекарственного продукта.

"Азотные компоненты" представляют собой субстраты, сырье или компоненты, которые являются источников ассимилируемого азота в ферментационной среде.

Согласно важному аспекту изобретения предпочтительным азотным компонентом в ферментационной среде являются амиды угольной кислоты, такие как мочевина. Они могут включать соединения, содержащие N-CO-N или родственные группы. Настоящее изобретение предусматривает использование производных мочевины, таких как диметилмочевина, диэтилмочевина, N-ацетил-N-фенил мочевина, изопропилидинмочевина, N-фенилмочевина и т.п., или их комбинаций.

Используемый термин "эффективное количество" представляет собой такое количество мочевины или ее производных, введение которого, согласно изобретению, в ферментационную среду приводит к образованию существенного количества/выхода белка, кроме того, за сокращенные периоды времени без воздействия на рост дрожжевых клеток.

Термин "ферментирующий организм" относится к любому микроорганизму, подходящему для использования в требуемом ферментационном процессе. Примеры ферментирующих организмов включают грибные организмы, такие как дрожжи. Примерами ферментирующих организмов в контексте настоящего изобретения являются Pichia pastoris, Pichia sp., Saccharomyces sp., Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces sp. или Hansenula polymorpha.

Изобретение может подойти для экспрессии любого рекомбинантного пептида с использованием индуцируемых метанолом видов грибов, но не ограничено рекомбинантно экспрессирующимися пептидами, белками, инсулином, предшественниками инсулина, инсулиновыми производными или аналогами инсулина.

Термин "рекомбинантный", как используют в данном контексте для описания белка или полипептида, означает полипептид, продуцируемый путем экспрессии рекомбинантного пол инуклеотида. Термин "рекомбинантный", как используют в данном контексте в отношении клеток, означает клетки, которые могут быть или были использованы в качестве реципиентов для рекомбинантных векторов или другой перенесенной ДНК, и включает потомство исходной клетки, которая была трансфицирована. Следует иметь в виду, что потомство одной родительской клетки может быть не полностью идентичными по морфологии или по комплементу геномной либо общей ДНК исходному родительскому организму вследствие случайной или направленной мутации.

Термин 'полипептид', 'белок', 'пептид' относится к полимеру аминокислот и не относится к специфической длине продукта; таким образом, пептиды, олигопептиды и белки включены в определение полипептида. Данный термин также не относится к постэкспрессионным модификациям полипептида или исключает их, хотя химические или постэкспрессионные модификации данных полипептидов могут быть включены или исключены в качестве специфических вариантов осуществления. В одном варианте осуществления молекула представляет собой полипептид или его родственные аналоги либо их производные. Предпочтительно, когда полипептид представляет собой циклический пептид. Согласно другому предпочтительному варианту осуществления, полипептид представляет собой нециклический пептид. В еще одном предпочтительном варианте осуществления полипептид выбран из группы, содержащей эксендин, эптифибатид, атосибан, ферменты, такие как липаза, карбоксипептидаза и т.п.

Инсулин представляет собой полипептид из 51 аминокислоты, которые распределены между двумя цепями аминокислот: A-цепь из 21 аминокислоты и B-цепь из 30 аминокислот. Цепи соединены друг с другом 2 дисульфидными мостиками. Это определение включает использование не только природных инсулинов, но также инсулиновое производных и аналогов. Соединение инсулина может, например, представлять собой соединение инсулина млекопитающего, такое как человеческий инсулин, или производные либо аналоги соединения инсулина.

Инсулиновые производные представляют собой производные природных инсулинов, а именно человеческого инсулина или инсулинов животных, которые отличаются от соответствующего в других отношениях идентичного природного инсулина заменой по меньшей мере одного природного остатка аминокислоты и/или введением по меньшей мере одного остатка аминокислоты и/или органического остатка. Следует иметь в виду, что термин инсулин определяет полипептид, состоящий из B- и A-цепи. Инсулиновое производное может быть по меньшей мере на 60% гомологичным природному инсулину. Инсулиновое производное может быть даже в большей степени гомологичным, например, по меньшей мере приблизительно на 75%, или по меньшей мере приблизительно на 90% гомологичным природному инсулину. Какправило, инсулиновые производные имеют несколько модифицированное действие по сравнению с человеческим инсулином.

При получении инсулина и инсулиновых производных посредством генетической инженерии предшественник инсулина, часто экспрессируют "проинсулин", содержащий B-, C- и A-цепи. Данный проинсулин можно превратить в инсулин или инсулиновое производное путем ферментного или химического удаления C-цепи после соответствующей и правильной укладки и образования дисульфидных мостиков. Проинсулиновое производное может быть по меньшей мере на 60% гомологичным по B- и A-цепи природному проинсулину. Однако связывающий C-пептид может быть выбран как полностью отличающийся от любого известного С-пептида. Проинсулиновое производное может быть даже в большей степени гомологичным, например, по меньшей мере приблизительно на 75%, или по меньшей мере приблизительно на 90% гомологичным природному проинсулину.

Согласно ряду вариантов осуществления изобретения рекомбинантный продукт инсулина представляет собой IN-105. Полученный в результате лекарственный продукт специфически относится к молекуле IN-105. IN-105 представляет собой молекулу инсулина, конъюгированную по е-аминокислоте лизину в положении B29 B-цепи инсулина с амфифильным олигомером структурной формулы CH₃O-(C₄H₂O)₃-CH₂-CH₂-COOH. Молекула может быть моноконъюгированной по A1, B1 и B29, диконъюгированной по различным комбинациям A1, B1 и B29 или триконъюгированной при различным комбинациям A1, B1 и B29.

Согласно другому аспекту изобретения рекомбинантный белок, полученный путем ферментации с использованием ферментационной среды, соответствующей настоящему изобретению, представляет собой циклический или нециклический пептид.

В одном аспекте изобретения протокол ферментации может включать три фазы: загрузки, подпитки (необязательно) и фазу индукции метанолом.

Согласно наиболее существенному аспекту изобретения ферментационная среда, используемая в контексте данного изобретения, включает следующие компоненты. Кроме того, включен способ приготовления среды.

Состав среды:
Компоненты	Количество (г/л)
CaSO₄·2H₂O	0,93
MgSO₄·7H₂O	29,8
K₂SO₄	36,4
KOH	4,13
Глицерин	40
H₃PO₄ (Плотность-1,7)	22,95
Мочевина	6,0

Отдельные компоненты растворяют в минимальном объеме воды в вышеуказанной последовательности и стерилизуют при 121°C в течение 1 часа. Раствор микроэлементов и D-биотина (предварительно стерилизованного фильтрацией) асептически добавляют в среду, каждый со скоростью 4,35 мл/л среды (плотность раствора микроэлементов составляет 1,05, а D-биотина - 1,0.

Состав раствора микроэлементов:
Компоненты (соли)	Количество (г/л)
Сульфат меди, CuSO₄·5H₂O	6,0
Йодид натрия, NaI	0,08
Сульфат марганца, MnSO₄·H₂O	3,0
Молибдат натрия, Na₂MoO₄·2H₂O	0,20
Борная кислота, H₃BO₃	0,02
Хлорид кобальта, CoCl₂·6H₂O	0,50
Хлорид цинка, ZnCl₂	20,0
Сульфат двухвалентного железа, FeSO₄·7H₂O	65,0
Серная кислота, H₂SO₄	5,0 мл

Все соли растворяют одну за другой в питьевой воде и стерилизуют фильтрацией через устройство для стерилизации фильтрацией.

Приготовление раствора биотина:

D-биотин 0,2 г/л

Биотин растворяют в питьевой воде и стерилизуют фильтрацией через устройство для стерилизации фильтрацией.

Подпитка дрожжевым экстрактом и соевым пептоном:

Кроме того, подпитку дрожжевым экстрактом и соевым пептоном также вводят во время ферментации. Ее следует готовить следующим образом:

Компоненты	Концентрация (г/л)
Соевый пептон	100
Дрожжевой экстракт	50

Компоненты растворяют и с помощью питьевой воды получают необходимый объем. Затем раствор стерилизуют при 121-123°C в течение 90 мин. Плотность подпитки соевым пептоном составляет приблизительно 1,05.

Подпитка метанолом:

12,0 мл раствора микроэлементов, 12 мл растворов D-биотина и 40 г мочевины добавляют на литр метанола перед введением подпитки.

Способ ферментации:

Способ ферментации включает фазу роста клеток в загрузке, необязательную фазу подпитки глицерином загрузки и фазу индукции метанолом.

Фаза роста клеток в загрузке

Мониторирование и контроль загрузки

Параметры продукции ферментера задают исходно и контролируют следующим образом:

Температура:	30°±2°C
pH:	5±0,2
DO:	>10%
Время проведения:	22-24 час.

Фаза индукции метанола (ФИМ)

Подпитку метанолом начинают сразу после окончания фазы загрузки. Метанол стерилизуют (в режиме загрузки) путем фильтрации с использованием коммерчески доступного стерилизующего фильтра.

В начале ФИМ, pH подводят до значения 4,0±0,1 или 6,0±0,1 или 6,3±0,1 в зависимости от экспрессии белка в среду (варьирует от продукта к продукту, а также от клона к клону) и температуру доводят до приблизительно 18-24°C (варьирует от продукта к продукту, а также от клона к клону).

Одновременно другую подпитку, подпитку дрожжевым экстрактом и соевым пептоном также начинают в ферментере со скоростью 0,4 г/л/час. исходного объема.

Мониторирование и контроль ФИМ

Температура:	18-30°C (варьируется от продукта к продукту, а также от клона к клону)
pH:	3,0-7,0
DO:	>1% (используют для контроля концентрации метанола в бульоне)
Время проведения:	5-8 дней (варьируется от клона к клону)
Анализ pH:	1-9,5 (в зависимости от типа белка)

Согласно другому аспекту изобретения посевной материал готовят путем культивирования лиофилизированной глицериновой исходной культуры на минимальной глицериновой среде (МГС). Основные ферментационные среды, полученные из "Control Pichia process guidelines" (Руководство по контролю процессов с использованием Pichia), содержат ортофосфорную кислоту, дегидратированный сульфат кальция, сульфат калия, сульфат магния гептагидрат, гидроксид калия, глицерин, микроэлементы и D-биотин. Питательная среда для культивирования должна содержать также известные соединения в маленьких или следовых количествах, которые обычно вводят в ферментационную среду для культивирования, такие как водорастворимые соединения Ca, Mg, Mn, Fe, K, Co, Cu, Zn, B, Mo, Br и I. Могут также присутствовать другие микроэлементы. Раствор микроэлементов, соответствующий настоящему изобретению, в частности, включает сульфат меди пентагидрат, йодид натрия, сульфат марганца моногидрат, молибдат натрия дигидрат, борную кислоту, хлорид кобальта гексагидрат, хлорид цинка, сульфат двухвалентного железа гептагидрат. Хотя концентрация каждого ингредиента среды специально оптимизирована для каждого продукта, ниже приводят контрольные среды:

Контрольные среды

Ферментационная основная солевая среда:

На 1 литр смешивают следующие ингредиенты:

Фосфорная кислота:	85% (26,7 мл)
Сульфат кальция:	0,93 г
Сульфат калия:	18,2 г
Сульфат магния-7H₂O:	14,9 г
Гидроксид калия:	4,13 г
Глицерин:	40,0 г

Вода до 1 литра.

Добавляют в ферментер с водой до соответствующего объема и стерилизуют.

Микроэлементы PTM1

Смешивают следующие ингредиенты:

Сульфат меди 5H₂O	6,0 г
Йодид натрия	0,08 г
Сульфат марганца-H₂O	3,0 г
Молибдат натрия-2H₂O	0,2 г
Борная кислота	0,02 г
Хлорид кобальта	0,5 г
Хлорид цинка	20,0 г
Сульфат двухвалентного железа-7H₂O	65,0 г
Биотин	0,2 г
Серная кислота	5,0 мл
Вода	до конечного объема 1 л.

Фильтруют, стерилизуют и хранят при комнатой температуре.

При смешивании данных ингредиентов может появиться мутный осадок. Среды можно профильтровать, стерилизовать и использовать.

В дополнение к вышеоп

Ферментационная среда и способ для получения рекомбинантных белков

Патент 2491345