Способ получения метакриловой кислоты или сложных эфиров мeтакриловой кислоты

Способ получения метакриловой кислоты или сложных эфиров мeтакриловой кислоты

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к способу производства метакриловой кислоты или сложных эфиров метакриловой кислоты, а также к способу производства полиметакриловой кислоты или сложных эфиров полиметакриловой кислоты.

Метакриловая кислота - важный промежуточный продукт, находящий, в особенности в форме своих алкиловых эфиров, применение при получении полимеризатов. Известное производное метакриловой кислоты - это, например, метиловый эфир метакриловой кислоты. Объем годового производства метилового эфира метакриловой кислоты составляет в настоящее время около 1,5 миллиона тонн. Эфиры полиметакриловой кислоты - это основные компоненты в области пластмасс, которые можно применять различными способами.

Коммерческое производство метакриловой кислоты обычно ведут способом гетерогенного двухэтапного окисления в газовой фазе 4-атомных соединений углерода, как то: бутилена, изобутилена, бутана, изобутана, трет-бутилового спирта или метакролеина на твердых мультиметаллических оксидных массах в качестве катализатора. Получаемую при этом газовую смесь продукции, которая, кроме метакриловой кислоты, содержит еще и множество побочных продуктов, затем либо подвергают полной конденсации с получением водного раствора метакриловой кислоты, либо абсорбируют в надлежащей смеси растворителей. После этого обычно следует очистка полученных таким образом продуктов жидкой фазы путем дистилляции, кристаллизации, экстракции или путем сочетания этих мер. Помимо каталитического окисления 4-атомных соединений углерода в газовой фазе метакриловую кислоту можно также синтезировать путем каталитической окислительной дегидрогенизации изомасляной кислоты, как это описано, например, в европейской заявке на патент EP-A-0356315. Еще одну возможность производства метакриловой кислоты предлагает так называемый «процесс АЦГ», в котором проводят реакцию ацетонциангидрина и серной кислоты с образованием в качестве промежуточного продукта метакриламида, который затем подвергается дальнейшей реакции с водой с образованием метакриловой кислоты. Очистку полученной таким образом метакриловой кислоты проводят затем методом дистилляции. Этот способ, например, описан в европейской заявке на патент EP-A-1359137.

Недостаток этих обычных способов производства метакриловой кислоты состоит в числе прочего в том, что как при производстве самой метакриловой кислоты, так и на последующих этапах очистки методом дистилляции, по причине выраженной склонности метакриловой кислоты к полимеризации и ввиду температурной нагрузки на этапах процесса, формируются димеры или олигомеры, что связано не только с дополнительными затратами на очистку, но и со снижением выхода.

Задача настоящего изобретения состоит в том, чтобы избавиться от недостатков, имеющихся на нынешнем техническом уровне.

В частности, задача изобретения состояла в том, чтобы предложить способ производства метакриловой кислоты, содержащий по возможности минимальное количество этапов с термической нагрузкой метакриловой кислоты.

Этот способ должен также давать возможность получать метакриловую кислоту из возобновляемых ресурсов, в особенности из углеводов и/или из глицерина.

Вклад в решение указанных в начале задач вносит способ производства метакриловой кислоты или сложных эфиров метакриловой кислоты, включающий в себя этапы:

IA) Синтез 3-гидроксиизомасляной кислоты способом, включающим в себя этап создания контакта клетки, генетически модифицированной по сравнению с ее диким типом таким образом, что она синтезирует больше 3-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты, чем этот дикий тип, с питательной средой, содержащей в качестве источника углерода углеводы, глицерин, двуокись углерода, метан, метанол, L-валин или L-глутамат, в условиях, в которых из источника углерода образуются 3-гидроксиизомасляная кислота или полигидроксиалканоаты на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты, а также, при необходимости, отделения 3-гидроксиизомасляной кислоты от питательной среды, а также, при необходимости, нейтрализации 3-гидроксиизомасляной кислоты, причем предпочтительно, чтобы начальным продуктом синтеза 3-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов на основе гидроксиизомасляной кислоты был метилмалоновый полуальдегид или 3-гидроксиизобутирил-кофермент A;

IB) Дегидратации 3-гидроксиизомасляной кислоты с образованием метакриловой кислоты, а также, при необходимости, этерификации метакриловой кислоты.

Если синтез 3-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты происходит с метилмалоновым полуальдегидом в качестве начального продукта, то также предпочтителен синтез с образованием в качестве промежуточного продукта сукцинил-кофермента A, пропионил-кофермента A или акрилоил-кофермента A, особо предпочтительно - сукцинил-кофермента A. Если синтез 3-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты происходит с 3-гидроксиизобутирил-коферментом A в качестве начального продукта, то также предпочтителен синтез с образованием в качестве промежуточного продукта изобутирил-кофермента A или 3-гидроксибутирил-кофермента A, особо предпочтительно - 3-гидроксибутирил-кофермента A.

В настоящем тексте термин «начальный продукт» применяют для обозначения химического соединения, которое можно ферментативным путем преобразовать в 3-гидроксиизомасляную кислоту за один этап реакции, а термин «промежуточный продукт» применяют для обозначения химического соединения, которое нельзя ферментативным путем преобразовать в 3-гидроксиизомасляную кислоту всего за один этап реакции.

Термин "3-гидроксиизомасляная кислота" в том значении, в котором его применяют в настоящем тексте, всегда означает соответствующую карбоновую кислоту с 4 атомами углерода в той форме, в которой ее получают после синтеза соответствующими микроорганизмами в зависимости от значения pH. Таким образом, термин всегда охватывает чистую кислотную форму (3-гидроксиизомасляную кислоту), чистую основную форму (3-гидроксиизобутират), а также смеси протонированной и депротонированной форм кислоты. Кроме того, термин "3-гидроксиизомасляная кислота" в принципе включает в себя как (R), так и (S)-стереоизомеры, причем (S)-стереоизомер особо предпочтителен.

Формулировка «синтезирует больше 3-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты, чем этот дикий тип» касается также того случая, когда дикий тип генетически модифицированной клетки вообще не способен синтезировать 3-гидроксиизомасляную кислоту или полигидроксиалканоаты на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты, по крайней мере - не способен синтезировать заметные (регистрируемые) количества этих соединений, и возможность синтеза заметных количеств этих компонентов возникает только после генетической модификации.

Под «диким типом» клетки предпочтительно подразумевают клетку, геном которой пребывает в естественном состоянии, сформированном эволюцией. Этот термин применяют как в отношении всей клетки, так и в отношении отдельных генов. Поэтому в понятие «дикий тип», в частности, не включают такие клетки или такие гены, генетические последовательности которых были хотя бы частично изменены человеком с помощью рекомбинантных методов.

Затем из 3-гидроксиизомасляной кислоты можно с помощью щадящей реакции дегидратации получить метакриловую кислоту. В случае полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты возможна изоляция содержащихся в клетках везикул, наполненных этими полигидроксиалканоатами, а затем расщепление полимеров с получением 3-гидроксиизомасляной кислоты, которую затем можно подвергнуть дегидратации с получением метакриловой кислоты.

При этом согласно изобретению предпочтительно, чтобы генетически модифицированная клетка, применяемая при реализации способа согласно изобретению, была модифицирована таким образом, чтобы в течение заданного временного интервала, предпочтительно в течение 2 часов, более предпочтительно - в течение 8 часов, а крайне предпочтительно - в течение 24 часов, она синтезировала по меньшей мере в 2 раза, особенно предпочтительно - по меньшей мере в 10 раз, еще более предпочтительно - по меньшей мере в 100 раз, сверх того еще более предпочтительно - по меньшей мере в 1000 раз, а наиболее предпочтительно - по меньшей мере в 10000 раз больше 3-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты, чем клетки дикого типа. Определять прирост синтеза продукции можно, например, культивируя клетки, применяемые при реализации способа согласно изобретению, и клетки дикого типа отдельно друг от друга в надлежащей питательной среде в одинаковых условиях (идентичная плотность клеток, одинаковая питательная среда, одинаковые условия в культуре) в течение определенного промежутка времени, а затем определяя в питательной среде количество конечного продукта (3-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты).

Клетки, применяемые при реализации способа согласно изобретению, могут быть прокариотическими или эукариотическими. Это могут быть клетки млекопитающих (как, например, клетки человека), растительные клетки или микроорганизмы, как то: дрожжи, грибы или бактерии, причем особо предпочтительны микроорганизмы, а наиболее предпочтительны бактерии и дрожжи.

Из бактерий, дрожжей или грибов особо удобно применять те бактерии, дрожжи или грибы, которые депонированы Германском собрании микроорганизмов и клеточных культур ГмбХ (DSMZ), в Брауншнвейге, Германия в виде штаммов бактерий, дрожжей или грибов. Пригодные к использованию согласно изобретению бактерии относятся к родам, перечисленным по адресу http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm

Пригодные к использованию согласно изобретению дрожжи относятся к родам, перечисленным по адресу http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm

а грибы, пригодные к применению согласно изобретению - это таковые, перечисленные по адресу http://www.dsmz.de/species/fungi.htm

Особо предпочтительные согласно изобретению клетки - это таковые родов Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Acinetobacter, Lactobacillus, Lactococcus, Candida, Pichia, Kluveromyces, Saccharomyces, Escherichia, Zymomonas, Yarrowia, Methylobacterium, Ralstonia, Pseudomonas, Burkholderia и Clostridium, причем особо предпочтительны Brevibacterium flavum, Brevibacterium lactofermentum, Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Kluveromyces lactis, Candida blankii, Candida rugosa, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium efficiens, Zymonomas mobilis, Yarrowia lipolytica, Methylobacterium extorquens, Ralstonia eutropha, insbesondere Ralstonia eutropha H16, Rhodospirillum rubrum, Rhodobacter sphaeroides, Paracoccus versutus, Pseudomonas aeroginosa, Acinetobacter calcoaceticus и Pichia pastoris.

В первом из вариантов выполнения способа согласно изобретению применяют клетки, в которых синтез 3-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты происходит с метилмалоновым полуальдегидом в качестве начального продукта.

В первой особенной форме исполнения этого первого варианта способа согласно изобретению предпочтительно проводить синтез 3-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты с образованием сукцинил-кофермента А в качестве промежуточного продукта, причем целесообразно, чтобы в качестве источника углерода генетически модифицированная клетка, применяемая в этой форме исполнения первого варианта способа согласно изобретению, использовала углеводы, глицерин или глутамат.

При этом в связи с первой особенной формой исполнения первого варианта способа согласно изобретению может быть целесообразно, чтобы генетически модифицированная клетка, применяемая в этой форме исполнения способа согласно изобретению, обладала повышенной по сравнению со своим диким типом активностью фермента E₁, который катализирует преобразование сукцинил-кофермента А в метилмалонил-кофермент А (см. Фиг.1).

Формулировка "повышенная активность фермента" в том смысле, в котором ее используют в связи с ферментом E₁, а в последующем изложении - в связи с ферментами E₂ и т.д., подразумевает предпочтительно повышенную внутриклеточную активность.

Нижеследующее изложение относительно повышения активности ферментов в клетках касаются как повышения активности фермента E₁, так и всех поименованных ниже ферментов, активность которых можно при необходимости повысить.

В принципе, повышения ферментативной активности можно достичь, увеличивая количество копий генетической последовательности или генетических последовательностей, которые кодируют фермент, применяя сильный промотор или используя ген или аллель, кодирующие соответствующий фермент с повышенной активностью, а также при необходимости сочетая эти меры. Клетки, генетически модифицированные согласно изобретению, создают, например, путем трансформации, трансдукции, конъюгации или сочетания этих методов с вектором, который содержит желательный ген, аллель этого гена или их части, и вектор, дающий возможность экспрессии гена. Гетерологической экспрессии добиваются, в частности, путем интеграции гена или аллелей в хромосому клетки или в вектор с внехромосомной репликацией.

Обзор возможностей для повышения ферментативной активности в клетках на примере пируваткарбоксилазы представлен в немецкой заявке на патент DE-A-10031999, которая настоящим введена как ссылка, и содержание публикации которой в отношении возможностей для повышения ферментативной активности в клетках образует составную часть изложения настоящего изобретения.

Экспрессию вышепоименованных и всех приведенных ниже ферментов или генов можно продемонстрировать с помощью одномерного или двухмерного разделения белков в геле с последующим оптическим определением концентрации белка в геле с помощью соответствующего аналитического программного обеспечения. Если повышение ферментативной активности основано исключительно на повышении экспрессии соответствующего гена, то количественное определение повышения ферментативной активности возможно простым образом, путем сравнения результатов одномерного или двухмерного разделения белков в геле у дикого типа и у генетически модифицированной клетки. Известный метод подготовки белковых гелей коринеформных бактерий и идентификации белков - это метод, описанный Hermann et al. (Electrophoresis, 22: 1712.23 (2001). Также можно анализировать концентрацию белков путем гибридизации с использованием вестерн-блоттинга с антителом, специфичным для подлежащего определению белка (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989) и последующей оптической оценки с помощью соответствующего программного обеспечения для измерения концентрации (Lohaus и Меуег (1989) Biospektrum, 5:32-39; Lottspeich (1999), Angewandte Chemie 111: 2630-2647). Активность ДНК-связывающих белков можно измерять методом сдвига полос ДНК (DNA Band Shift Assays, также известен как задержка в геле) (Wilson et al. (2001) Journal of Bacteriology, 183: 2151-2155). Действие ДНК-связывающих белков на экспрессию других генов можно продемонстрировать с помощью подробно описанных методов количественного анализа с генами-репортерами (Sambrook et al., Molecular Cloning: a laboratory manual, 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. USA, 1989). Внутриклеточную ферментативную активность можно определять различными методами, которые также описаны (Donahue et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (19): 5624-5627; Ray et al. (2000) Journal of Bacteriology 182 (8): 2277-2284; Freedberg et al. (1973) Journal of Bacteriology 115(3): 816-823). Если в нижеследующем изложении не указаны конкретные методы определения активности конкретного фермента, то определение повышения ферментативной активности и определение ее снижения предпочтительно проводили методами, описанными в Hermann et al., Electophoresis, 22: 1712-23 (2001), Lohaus et al., Biospektrum 532-39(1998), Lottspeich, Angewandte Chemie 111:2630-2647(1999) и в Wilson et al., Journal of Bacteriology 183: 2151-2155 (2001).

Если повышение ферментативной активности вызвано мутацией эндогенного гена, то такие мутации можно либо вызвать ненаправленным (неспецифическим) путем классическими методами, как, например, облучением ультрафиолетовым светом или использованием мутагенных химикатов, либо целенаправленно - методами генной инженерии, как то, проводя делеции, инсерции и/или замену нуклеотидов. Посредством этих мутаций получают генетически модифицированные клетки. Также особо предпочтительные мутантные формы ферментов - это, в частности, такие ферменты, которые не подвержены ингибированию по принципу обратной связи или по крайней мере подвержены ей в меньшей степени по сравнению с диким типом фермента.

Если повышение ферментативной активности вызывают ростом экспрессии фермента, то для этого, например, увеличивают количество копий соответствующих генов или вызывают мутацию области промотора или регуляции или участка связывания рибосом, находящегося в последовательности перед структурным геном. Так же действуют кассеты экспрессии, которые встраивают перед структурным геном. Кроме того, с помощью индуцируемых промоторов можно повышать экспрессию в произвольный момент времени. Помимо этого, к гену фермента можно в качестве регуляторных последовательностей добавить так называемые «энхансеры», которые также вызывают повышение экспрессии гена благодаря более интенсивному взаимодействию между РНК-полимеразой и ДНК. Экспрессию улучшают также меры по продлению срока жизни маточной РНК. Кроме того, воспрепятствование распаду белка-фермента также повышает ферментативную активность. Гены или генетические конструкции при этом располагают либо в плазмидах с различным количеством копий, либо встраивают их в хромосому и амплифицируют. В качестве альтернативы можно добиться избыточной экспрессии надлежащих генов, изменяя состав среды и условия культивации. Инструкции к этому специалист может найти в числе прочего в Martin et al. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), в Guerrero et al. (Gene 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya и Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), в Eikmanns et al. (Gene 102, 93-98 (1991)), в европейской заявке ЕР-А-0472869, в патенте США US 4,601,893, в Schwarzer и Punier (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), в Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), в LaBarre et al. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), в международной заявке WO-A-96/15246, в Malumbres et al. (Gene 134, 15-24 (1993), в японской заявке JP-А-10-229891, в Jensen и Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998)) и в известных учебных руководствах по генетике и молекулярной биологии. Так же, как и мутации, описанные выше меры ведут к образованию генетически модифицированных клеток.

Для повышения экспрессии определенных генов используют, например, эписомальные плазмиды. Особо удобно использовать плазмиды, репликация которых проходит в коринеформных бактериях. Многие известные плазмидные векторы, как, например, pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology 64: 549-554 (1989)), pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 107: 69-74 (1991)) или pHS2-1 (Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)), имеют в своей основе криптические плазмиды pHM1519, pBL1 или pGA1. Равным образом можно применять другие плазмидные векторы, например, те, которые основаны на pCG4 (US 4,489,160), или pNG2 (Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66:119-124(1990)), или pAG1 (US 5,158,891).

Кроме того, можно использовать такие плазмидные векторы, с помощью которых возможна работа по методу генетической амплификации путем интеграции в хромосому, как это было, например, описано Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60: 126-132 (1994)) для дупликации или амплификации оперона hom-thrB. В этом методе из полного гена клонируют плазмидный вектор, способный реплицироваться в хозяине (обычно Escherichia coli), однако, не в Corynebacterium glutamicum. В качестве векторов можно использовать, например, pSUP301 (Simon et al., Bio/Technology 1:784-791 (1983)), pK18mob или pK19mob (Schäfer et al., Gene 145: 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA), pCR2.1-TOPO (Shuman, Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84(1994)), pCR^®Blunt (Invitrogen, Groningen, Niederlande), pEM1 (Schrumpf et al., Journal of Bacteriology 173: 4510-4516)) или pBGS8 (Spratt et al., Gene 41:337-342 (1986)). Затем плазмидный вектор, содержащий подлежащий амплификации ген, переносят в нужный штамм Corynebacterium glutamicum методом конъюгации или трансформации. Метод конъюгации описан, например, в Schäfer et al., Applied and Environmental Microbiology 60:756-759 (1994). Методы трансформации описаны, например, в Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29: 356-362 (1988), Dunican и Shivnan, Bio/Technology 7: 1067-1070 (1989) и Tauch et al., FEMS Microbiology Letters 123:343-347 (1994). После гомологической рекомбинации с помощью кроссинговера итоговый штамм содержит по меньшей мере две копии надлежащего гена.

Под приведенной выше и используемой в нижеследующем изложении формулировкой «повышенная по сравнению с диким типом активность фермента E_x» всегда подразумевают активность фермента E_x, повышенную по меньшей мере в 2 раза, особенно предпочтительно - по меньшей мере в 10 раз, еще более предпочтительно - по меньшей мере в 100 раз, сверх того еще более предпочтительно - по меньшей мере в 1000 раз, а наиболее предпочтительно - по меньшей мере в 10000 раз. Кроме того, под генетически модифицированная клеткой, применяемой при реализации способа согласно изобретению, у которой имеется «повышенная по сравнению с диким типом активность фермента E_x», в частности, подразумевают клетку, дикий тип которой не обладает активностью этого фермента E_x, или не обладает ею в достаточной для регистрации степени, и которая лишь после повышения активности фермента, например, путем избыточной экспрессии демонстрирует достаточную для регистрации активность этого фермента E_x. В этом контексте под понятием «избыточная экспрессия» или под применяемым в последующем изложении понятием «повышение экспрессии» подразумевают также и случай, когда исходная клетка, например, клетка дикого типа, не обладает активностью этого фермента E_x, или не обладает ею в достаточной для регистрации степени и лишь после применения рекомбинантных технологий демонстрирует достаточную для регистрации активность фермента E_x.

Под используемой ниже формулировкой «пониженная по сравнению с диким типом активность фермента E_x», соответственно, предпочтительно подразумевают активность, составляющей по меньшей мере 0,5, особенно предпочтительно - по меньшей мере 0,1, еще более предпочтительно - по меньшей мере 0,01, сверх того еще более предпочтительно - по меньшей мере 0,001, а наиболее предпочтительно - по меньшей мере 0,0001 от исходной. Снижение активности определенного фермента можно обеспечить, например, целенаправленной мутацией, добавлением конкурентных или неконкурентных ингибиторов или иными известными специалисту мерами по снижению экспрессии определенного фермента.

Фермент E₁, катализирующий преобразование сукцинил-кофермента A в метилмалонил-кофермент А, предпочтительно представляет собой метилмалонил-кофермент A-мутазу (ЕС 5.4.99.2). Этот фермент кодируют гены, предпочтительно выбранные из группы, состоящей из mut, mutA, mutB, sbm, sbmA, sbmB, sbm5, bhbA, mcmA, mcmA1, mcmA2, mcmB, mcm1, mcm2, mcm3, icmA, meaA1 и meaA2. Нуклеотидные последовательности этих генов представлены, например, в "Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes" (базе данных KEGG), в базах данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) Национальной медицинской библиотеки (Bethesda, MD, USA) или в базе данных Европейских молекулярно-биологических лабораторий (EMBL, Гейдельберг, Германия или Кембридж, Великобритания).

Согласно особо предпочтительно форме исполнения первого варианта способа согласно изобретению фермент Е₁ представляет собой метилмалонил-кофермент A-мутазу из Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, кодируемую последовательностью ДНК № последовательности 01 и имеющую последовательность аминокислот № последовательности 02.

Кроме того, согласно первому альтернативному варианту способа согласно изобретению, где применяют генетически модифицированную клетку, в которой синтез 3-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты идет с сукцинил-коферментом А в качестве промежуточного продукта и метилмалоновым полуальдегидом в качестве начального продукта, предпочтительно, чтобы клетка, при необходимости в дополнение к повышенной активности фермента E₁, имела повышенную активность по меньшей мере одного из следующих ферментов Е₂-Е₄ (см. Фиг.2):

- фермента E₂, катализирующего преобразование метилмалонил-кофермента A в метилмалонат;

- фермента Е₃, катализирующего преобразование метилмалоната в метилмалоновый полуальдегид;

- фермента Е₄, катализирующего преобразование метилмалонового полуальдегида в 3-гидроксиизомасляную кислоту;

Наиболее предпочтительные согласно изобретению клетки - это те, у которых повышена активность следующих ферментов или сочетаний ферментов: Е₂, Е₃, Е₄, Е₂Е₃, Е₂Е₄, Е₃Е₄, Е₂Е₃Е₄, причем наиболее предпочтительны Е₂Е₃Е₄. Кроме того, возможно также, что один фермент катализирует по меньшей мере два из описанных выше этапов реакции. Так, например, возможно применение фермента, который обладает активностью как фермента E₂, так и фермента Е₃ (и таким образом катализирует преобразование метилмалонил-кофермента A непосредственно в метилмалоновый полуальдегид), как, например, метилмалонил-кофермент A-редуктазы из Sulfolobus tokodaii, кодируемую последовательностью ДНК Seq.-ID.-Nr. 03 и имеющую последовательность аминокислот Seq.-ID.-Nr. 04, либо же фермента, обладающего активностью всех трех ферментов Е₂, Е₃ и Е₄, как то: малонил-кофермент A-редуктазы из Chloroflexus aurantiacus (Hugler et al., Journal of Bacteriology 184, страницы 2.404-2.410, 2002).

В этом контексте предпочтительны следующие ферменты:

E₂ метилмалонил-кофермент A-гидролаза (ЕС 3.1.2.17),

Е₃ альдегид-дегидрогеназа (ЕС 1.2.1.3) или альдегид-оксидаза (ЕС 1.2.3.1)

и

Е₄ 3-гидроксиизобутират-дегидрогеназа (ЕС 1.1.1.31) или 3-гидроксиацил-кофермент A-дегидрогеназа (ЕС 1.1.1.35).

Предпочтительно, чтобы ген, кодирующий фермент E₂, представлял собой ген аох1. Метилмалонил-кофермент A-гидролаза из печени крысы описана, например, в Kovachy et al., "Recognition, isolation, and characterization of rat liver D-methylmalonyl coenzyme A hydrolase", J.Biol. Chem. 258(1983), стр.11.415-11.421.

Предпочтительно, чтобы ген, кодирующий фермент Е₃, был выбран из группы, состоящей из aldh2, aldh3a1, aldh3a2, aldh1b1, aldh9a1, aldh7a1, aldh1a4, aldh1a1, aldh1a2, mgc80785, mgc83352, mgc89020, dmel-CG31075, cg3752, cg9629, alh-9, alh-1, alh-2, f508.35, t7023.15, f15l1.19, tT17F15.130, ald1, ald2, ald4, ald5, ald6, acl044Wp, adr417wp, msc7, tb06.5F5.780, aIdH, puuC, putA, aldA, badH, alkH, pcD, rsp1591, rs01031, exaC, acoD, dhaL, pchA, aldB, dhaS, betB, ywdH, ycbD, aldX, aldY, aldA1, aldA2, aldC, pcd, cgl0546, cgl2668, cgl2796, scg11A.05, sci30A.27c, sce9.27c, sck13.05c, sc5H4.03, thcA, gabD2, aIkH, aIdH, aldH1, aldY1, aldY2, aldY3, aldY4, aldY5, aldY6, aldY7 и aldhT.

Надлежащие гены для фермента E₄ выбирают из группы, состоящей из hibadh, cg15093, cg15093, cg4747, mwL2.23, t13k14.90, f19b15.150, hibA, ygbJ, mmsB, mmsB, garR, tsar, mmsB-1, mmsB-2, yfjR, ykwC, ywjF, hibD, glxR, SCM1.40c, hibD, ehhahd, hadh2, hadhsc, hsd17B4, loc488110, had, mgC81885, hadh2-prov, cg3415, cg7113, ech-1, ech-8, ech-9, ard-1, yfcX, fadB, faoA, fadB2x, hbd-1, hbd-2, hbd-3, hbd-4, hbd-5, hbd-6, hbd-7, hbd-8, hbd-9, hbd-10, fadJ, rs04421, rs02946, rs05766, bbsD, bbsC, fadB1, fadB2, fadB5, hbdA, pimF, fabJ-1, fabJ, scbac19f3.11, sci35.13, scbac8d1.10c, sc5f2a.15, sc6a5.38, fadC2, fadC4, fadC5, fadC6, had и рааН. Прочие пригодные к применению 3-гидроксиизобутират-дегидрогеназы описаны, например, в Bannerjee et al. (1970), J.Biol. Chem, 245, стр.1.828-1.835, Steele et al. (1992), J. Biol. Chem., 267, стр.13.585-13.592, Harris et al. (1988), J. Biol. Chem., 263, стр.327-331, Harris et al., Biochim. Biophys. Acta, 1645 (1), стр.89-95, Hawes et al. (2000), Methods Enzymol., 324, стр.218-228, Harris et al., J. Biol. Chem., 275 (49), стр.38.780-38.786, Rougraff et al. (1988), J. Biol. Chem., 263(1), стр.327-331, Robinson et al., J. Biol. Chem., 225, стр.511-521, Hawes et al. (1995), Biochemistry, 34, стр.4.231-4.237, Hasegawa J. (1981), Agric. Biol. Chem., 45, стр.2.805-2814, Hawes et al. (1996), FEBS Lett., 389, стр.263-267, Hawes et al. (1996), Enzymology and Molecular Biology of Carbonyl Metabolism, Plenum Press, New York, стр.395-402, Adams et al. (1994), Structure, 2, стр.651-668, Zhang et al. (1999), Biochemistry, 38, стр.11.231-11.238, Mirny et al., (1999), J. Mol. Biol., 291, стр.177-196 и Lokanath et al. (2005), J Mol Biol., Содержание этих публикаций настоящим введено как ссылка и образует составную часть изложения настоящего изобретения.

Нуклеотидные последовательности этих генов, а также прочих генов для ферментов E₂-E₄ содержатся в т.ч. в базе данных KEGG, базе данных NCBI или в базе данных EMBL

Согласно особо предпочтительной форме этого альтернативного варианта способа по изобретению, где применяют генетически модифицированную клетку, применяемая в форме исполнения, в которой синтез 3-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты идет с метилмалоновым полуальдегидом в качестве начального продукта, а в качестве промежуточного продукта - с сукцинил-коферментом A, предпочтительно применять для преобразования метилмалонил-кофермента A в метилмалоновый полуальдегид малонил-кофермент A-редуктазу из Sulfolobus tokodaii, кодируемую последовательностью ДНК №03 и имеющую последовательность аминокислот №04. Согласно другой особо предпочтительной форме этого варианта для преобразования метилмалонил-кофермента A в 3-гидроксиизомасляную кислоту применяют малонил-кофермент A-редуктазу из Chloroflexus aurantiacus (Hugler et al., Journal of Bacteriology 184, Seiten 2.404-2.410, 2002).

Кроме того, в связи с этой первой альтернативой особенной формы исполнения первого варианта способа согласно изобретению предпочтительно, чтобы применяемая согласно этой форме исполнения генетически модифицированная клетка обладала сниженной по сравнению со своим диким типом активностью фермента Е₅, который преобразует метилмалоновый полуальдегид в пропионил-кофермент A, причем этот фермент предпочтительно представляет собой дегидрогеназу метилмалонового полуальдегида (ЕС 1.2.1.27).

Согласно второму альтернативному варианту способа согласно изобретению, где применяют генетически модифицированную клетку, в которой синтез 3-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты идет с метилмалоновым полуальдегидом в качестве начального продукта, а в качестве промежуточного продукта - сукцинил-кофермента A, предпочтительно, чтобы клетка, при необходимости в дополнение к повышенной активности фермента E₁, имела повышенную активность по меньшей мере одного из следующих ферментов Е₄-E₇ (см. Фиг.3):

- фермента Е₆, катализирующего преобразование (R)-метилмалонил-кофермента A в (S)-метилмалонил-кофермент А;

- фермента Е₇, катализирующего преобразование (S)-метилмалонил-кофермента A в пропионил-кофермент А;

- фермента E₅, катализирующего преобразование пропионил-кофермента A в метилмалоновый полуальдегид;

- фермента Е₄, катализирующего преобразование метилмалонового полуальдегида в 3-гидроксиизомасляную кислоту.

Наиболее предпочтительно согласно изобретению применяют клетки, у которых повышена активность следующих ферментов или сочетаний ферментов: E₄, E₅, E₆, E₇, E₄E₅, E₄E₆, E₄E₇, E₅E₆, E₅E₇, E₆E₇, E₄E₅E₆, E₄E₅E₇, E₄E₆E₇, E₅E₆E₇ и E₄E₅E₆E₇, причем наиболее предпочтительно сочетание E₄E₅E₆E₇.

В этом контексте предпочтительны следующие ферменты:

E₆ метилмалонил-кофермент А-эпимераза (ЕС 5.1.99.1),

E₇ метилмалонил-кофермент А-декарбоксилаза (ЕС 4.1.1.41),

E₅ дегидрогеназа метилмалонового полуальдегида (ЕС 1.2.1.27) и

E₄ 3-гидроксиизобутират-дегидрогеназа (ЕС 1.1.1.31) или 3-гидроксиацил-коферментА-дегидрогеназа (ЕС 1.1.1.35).

Предпочтительные ферменты Е₄ при этом те, которые уже были описаны выше в связи с первым вариантом первой предпочтительной формы исполнения способа согласно изобретению.

Предпочтительно, чтобы ген, кодирующий фермент Е₆, представлял собой ген mcee. Пригодная к применению метилмалонил-кофермент A-декарбоксилаза (фермент Е₇) описана, например, Benning et al. в Biochemistry, Vol.39 (2000), Seiten 4.630-4.639.

Надлежащие гены для фермента Es предпочтительно выбирают из группы, состоящей из aldh6a1, cg17896, t22c12.10, ald6, putA1, mmsA, mmsA-1, mmsA-2, mmsA-3, mmsA-4, msdA, ioIA и ioIAB.

Надлежащие гены для фермента Е₇ предпочтительно выбирают из группы, состоящей из mmdA, bcc, oadB, oadB2, oadB3, SC1C2.16, SC1G7.10, pccB1, accA2, mmdB, mmdC и ррсВ.

Нуклеотидные последовательности генов для ферментов Е₅, Е₆ и Е₇ содержатся в т.ч. в базе данных KEGG.

Согласно третьему альтернативному варианту способа согласно изобретению, где применяют генетически модифицированную клетку, в которой синтез 3-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоатов на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты идет с метилмалоновым полуальдегидом в качестве начального продукта, а в качестве промежуточного продукта - сукцинил-кофермента A, предпочтительно, чтобы клетка, при необходимости в дополнение к повышенной активности фермента E₁, имела повышенную активность по меньшей мере одного из следующих ферментов Е₄, E₅ и Е₇ (см. Фиг.4):

- фермента Е₇, катализирующего преобразование метилмалонил-кофермента А в пропионил-коферментА;

- фермента E₅, катализирующего преобразование пропионил-кофермента А в метилмалоновый полуальдегид;

- фермента Е₄, катализирующего преобразование метилмалонового полуальдегида в 3-гидроксиизомасляную кислоту.

В основном этот путь схож со вторым вариантом первой предпочтительной формы исполнения способа согласно изобретению, но в отличие от второго варианта синтез пропионил-СоА осуществляют непосредственно из метилмалонил-кофермента А. Предпочтительные ферменты и гены для ферментов Е₄, E₅ и Е₇ - это те же гены или ферменты, которые уже были поименованы выше в связи со вторым вариантом.

Кроме того, согласно первой особой форме исполнения способа согласно изобретению (и также согласно всем приведенным ниже формам исполнения) может быть предпочтительно применять генетически модифицированную клетку, способную преобразовывать синтезированную 3-гидроксиизомасляную кислоту в полигидроксиалканоат. Такие полигидроксиалканоаты откладываются внутри клеток многих микроорганизмов в форме гранул с сильным светопреломлением. В этом контексте особенно предпочтительно, чтобы применяемая при реализации способа согласно изобретению генетически модифицированная клетка имела повышенную по сравнению со своим диким типом активность по меньшей мере одного из, а предпочтительно обоих, следующих ферментов E₈ и E₉ (см. Фиг.5):

- фермента Е₈, катализирующего преобразование 3-гидроксиизомасляной кислоты в 3-гидроксиизобутирил-кофермент А;

- фермента E₉, катализирующего преобразование 3-гидроксиизобутирил-коферментаА в полигидроксиалканоат на основе3-гидроксиизомасляной кислоты.

В этом контексте предпочтительны следующие ферменты:

Е₈3-гидроксиизобутирил-СоА-гидролаза (ЕС 3.1.2.4) и

Е₉полигидроксиалканоат-синтаза.

Как уже изложено выше, в первой предпочтительной форме исполнения способа согласно изобретению 3-гидроксиизомасляная кислота или полигидроксиалканоаты на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты синтезируют сукцинил-кофермента А в качестве промежуточного продукта и метилмалонового полуальдегида как начального продукта. При этом может быть в принципе целесообразно, помимо воздействия на активность вышепоименованных ферментов E₁-E₉, также оказывать воздействие на активность тех ферментов, которые вызывают повышение формирования сукцинил-кофермента А в клетке.

Если согласно первой особенной форме исполнения первого варианта способа согласно изобретению синтез 3-гидроксиизомасляной кислоты или полигидроксиалканоата на основе 3-гидроксиизомасляной кислоты идет с сукцинил-коферментом А в качестве промежуточного продукта и метилмалоновым полуальдегидом в качестве начального продукта из углеводов и глицерина, то в соответствии с особым вариантом вышеописанного первого, второго или третьего альтернативного варианта согласно изобретению предпочтительно, чтобы применяемая генетически модифицированная клетка имела повышенную по сравнению со своим диким типом активность по меньшей мере одного из, а предпочтительно обоих, следующих ферментов Е₁₀ и Е₁₁ (см. Фиг.6):

- фермента Е₁₀, катализирующего преобразование фосфоенолпирувата в оксалоацетат;

- фермента Е₁₁, катализирующего преобразование пирувата в оксалоацетат.

В этом контексте предпочтительны следующие ферменты:

Е₁₀фосфоенолпируват-карбоксилаза (ЕС 4.1.1.31) и

Е₁₁пируват-карбоксилаза (ЕС 6.4.1.1).

Предпочтительно, чтобы фермент Е₁₀ кодировали гены, выбранные из группы, включающей в себя f12m16.21, f14n22.13, k15m2.8, ppc, clpA, pepC, сарР, сд11585, pepC, pck, ppc и рссА, причем особо предпочтителен ген ppc. Предпочтительные согласно изобретению фосфоенолпируват-карбоксилазы описаны, в частности, в патентах США US 4,757,009, US 4,980,285, US 5,573,945, US 6,872,553 и US 6,599,732. Содержание этих публикаций в отношении фосфоенолпируват-кар