Гидрофобные, модифицированные, полученные из pres вируса гепатита в (hbv) пептиды и их использование в качестве ингибиторов проникновения hbv и hdv

Гидрофобные, модифицированные, полученные из pres вируса гепатита в (hbv) пептиды и их использование в качестве ингибиторов проникновения hbv и hdv

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к гидрофобным, модифицированным, полученным из preS вируса гепатита В пептидам, которые являются производными консенсусной последовательности preS HBV и которые предпочтительно ацилированы по N-концу и необязательно модифицированы по С-концу. Данные гидрофобные, модифицированные, полученные из preS HBV пептиды являются крайне эффективными ингибиторами проникновения HBV, а также ингибиторами проникновения HDV, и, таким образом, предназначены для ингибирования инфекций HBV и/или HDV, профилактики инфекций HBV и/или HDV, а также для лечения (хронических) инфекций гепатита В и/или D. Кроме того, настоящее изобретение относится к фармацевтической и вакцинной композициям, содержащим эти гидрофобные, модифицированные, полученные из preS HBV пептиды.

Уровень техники

В настоящее время у около 2 млрд людей выявляются серологические маркеры HBV. Около 400 миллионов из них хронически инфицированы HBV. По данным центра по борьбе с заболеваниями (CDC) 15-25% хронически инфицированных HBV людей имеют предрасположенность к развитию гепатоцеллюлярной карциномы (НСС) в течение десяти лет, если они не получают надлежащего лечения (1). Вызванная HBV гепатоцеллюлярная карцинома имеет плохой прогноз и в связи с этим HBV был классифицирован Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) в качестве наиболее значимого природного человеческого канцерогена. Несмотря на существование профилактической вакцины, число инфицированных будет расти в ближайшие десятилетия из-за увеличения численности населения мира и из-за ограничения профилактики в бедных странах.

В промышленно развитых странах HBV в первую очередь передается парентеральным путем. 90-95% инфицированных в острой форме, иммунокомпетентных индивидуумов освобождаются от вируса, обретая иммунную защиту на всю жизнь. У около 5-10% из них развивается хронический гепатит В (300000-500000 человек в Германии). Напротив, в высокоэндемичных областях, особенно в Центральной Африке и в Восточной Азии, основным путем передачи вируса является вертикальная передача от матери ребенку. К сожалению, инфекция не полностью иммунокомпетентных детей приводит в 90-98% случаев к хроническому течению заболевания. Вследствие этого вызванная гепатитом В гепатоцеллюлярная карцинома является наиболее частым видом злокачественных новообразований в большинстве этих стран.

Утвержденные в настоящее время схемы для лечения хронических инфекций вируса гепатита В (HBV) либо нацелены на стадии репликации вирусного генома при сформировавшейся инфекции (Lamivudine, Adefovir, Entecavir), либо действуют как модуляторы иммунной системы (интерферон альфа). К сожалению, только 10-25% пациентов сохраняют устойчивый вирусологический ответ на такие терапии, что отражает в, частности, быстрый отбор мутантов, устойчивых к нуклеотидам/нуклеозидам. Несмотря на доступность профилактической вакцины в силу вышесказанного крайне важно разработать новые виды терапии, нацеленные на незатронутые до сих пор стадии репликации, например на стадию проникновения вируса.

Специфическое ингибирование проникновения вируса является привлекательной терапевтической концепцией для контроля и, в конечном счете, ликвидации острых и хронических инфекций. Для ВИЧ (HIV) интерференция с проникновением вируса была достигнута с помощью полученного из gp41 пептида, состоящего из 36 аминокислот (Fuzeon®), предотвращающего слияние вирусной и клеточной мембран (2).

Несмотря на доступность профилактической вакцины и ингибиторов обратной транскриптазы (reverse transcriptase (RT)) во всем мире растет число инфицированных HBV людей и число связанных с HBV смертей (в настоящий момент около 500000 в год). Около двух третей случаев первичного рака печени связано с персистирующей инфекцией HBV (3).

Текущее лечение следует двум стратегиям: (i) лечение интерфероном (IFN alpha) модулирует иммунные реакции против HBV и демонстрирует прямой противовирусный эффект, который приводит к долгосрочным клиническим результатам примерно у 30% пациентов без эрадикации вируса; (ii) введение ингибиторов вирусной обратной транскриптазы подавляет репликацию вируса и сопровождается значительными биохимическими и гистологическими улучшениями после 1 года лечения. Тем не менее, длительное лечение связано с появлением устойчивых штаммов вируса (4).

HBV является прототипом семейства малых, оболочечных ДНК вирусов млекопитающих и птиц (5). Оболочка HBV включает в себя три белка, которые называются L-(большой), М-(средний) и S-(малый) (см. фигуру 1А). У них одинаковый С-концевой S-домен с четырьмя трансмембранными областями. М- и L-белки несут дополнительные N-концевые вставки длиной 55 (preS2), и, в зависимости от генотипа, 107 или 118 аминокислот (preS1) (см. фигуру 1 В). В вирионах стехиометрическое отношение L, М и S составляет около 1:1:4, наряду с тем, что обильно секретируемые неинфекционные субвирусные частицы (SVP) содержат почти исключительно S- и лишь следы L-белка (6). Во время синтеза preS1-домен L белка миристилируется и транслоцируется через ЭР. Эта модификация имеет большое значение для инфекционности HBV (7, 8).

Исследования ранних событий инфекции HBV носили ограниченный характер, поскольку до недавнего времени не были доступны ни системы культур клеток, ни модели на малых животных (9). Разработка восприимчивой к HBV клеточной линии HepaRG способствовала систематическим исследованиям проникновения HBV и привела к открытию ингибиторов проникновения на основе белков оболочки (10).

Кроме того, в настоящее время не существует эффективной терапии инфекции HDV, сателитного вирусоида, использующего белки оболочки HBV для проникновения в гепатоциты (15, 17, 20). В данной области существует необходимость обеспечения эффективных терапий против инфекции HDV.

Таким образом, настоящее изобретение направлено на улучшение способов и средств ингибирования, профилактики и/или лечения инфекции HBV и других связанных с HBV заболеваний, известных на данный момент, и, таким образом, целью настоящего изобретения является обеспечение улучшенных способов и средств, позволяющих целенаправленное и эффективное ингибирование, профилактику и/или лечение инфекции HBV и связанных с HBV заболеваний.

Дополнительная задача настоящего изобретения заключается в обеспечении способов и средств ингибирования, профилактики и/или лечения инфекции HDV и связанных с HDV заболеваний.

Раскрытие изобретения

В соответствии с настоящим изобретением эта задача решается путем обеспечения гидрофобных, модифицированных, полученных из preS HBV пептидов.

Указанные гидрофобные, модифицированные, полученные из preS пептиды имеют общую формулу

,

Р является указанным полученным из preS пептидом и содержит аминокислотную последовательность консенсусной последовательности preS HBV или ее варианты.

Н является указанной гидрофобной модификацией полученного из preS пептида Р, которая является N-концевой и выбирается из ацилирования и добавления гидрофобного функционального компонента; где m равно, по меньшей мере, 1.

R является необязательной С-концевой модификацией (т.е. n равно 0 либо, по меньшей мере, 1) указанного полученного из preS пептида Р.

В соответствии с настоящим изобретением эта задача, помимо прочего, решается путем предоставления фармацевтической композиции, содержащей, по меньшей мере, один определенный здесь гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.

В соответствии с настоящим изобретением эта задача, помимо прочего, решается путем предоставления гидрофобного, модифицированного, полученного из preS HBV пептида (или пептидов) и/или соответствующей фармацевтической композиции (или композиций) по изобретению для диагностирования, профилактики и/или лечения заболеваний.

В соответствии с настоящим изобретением эта задача, помимо прочего, решается путем предоставления гидрофобного, модифицированного, полученного из preS HBV пептида (или пептидов) и/или соответствующей фармацевтической композиции (или композиций) по изобретению для ингибирования инфекций HBV и/или HDV; для профилактики первичных инфекции HBV и/или HDV и/или для лечения гепатита В и/или D.

В соответствии с настоящим изобретением эта задача, помимо прочего, решается с помощью гидрофобного, модифицированного, полученного из preS HBV пептида (или пептидов) и/или соответствующей фармацевтической композиции (или композиций) по изобретению для производства лекарственного средства для ингибирования инфекций HBV и/или HDV; для профилактики первичных инфекции HBV и/или HDV и/или для лечения гепатита В и/или D.

В соответствии с настоящим изобретением эта задача, помимо прочего, решается способами ингибирования инфекций HBV и/или HDV; профилактики первичных инфекции HBV и/или HDV и/или лечения (хронических) гепатита В и/или D с применением гидрофобного, модифицированного, полученного из preS HBV пептида (или пептидов) и/или соответствующей фармацевтической композиции (или композиций) по изобретению.

В соответствии с настоящим изобретением эта задача, помимо прочего, решается путем предоставления вакцинной композиции, содержащей, по меньшей мере, один определенный здесь гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид и необязательно фармацевтически приемлемый носитель и/или наполнитель.

Осуществление изобретения

Перед тем, как настоящее изобретение будет описано более детально, следует принять к сведению, что это изобретение не ограничивается описанными здесь конкретными методологией, протоколами и реактивами, поскольку последние могут меняться. Также следует принять к сведению, что использованная здесь терминология необходима только для целей описания конкретных воплощений и не предназначена для ограничения рамок настоящего изобретения, которые будут ограничены только прилагаемой формулой изобретения. Если иное не определено, все технические и научные термины, использованные здесь, имеют те же смыслы, которые вкладываются в них обычным специалистом в данной области. Для целей настоящего изобретения все процитированные здесь источники включены посредством отсылки во всей полноте.

Гидрофобные, модифицированные, полученные из preS HBV пептиды

Как отмечалось выше, настоящее изобретение обеспечивает гидрофобные, модифицированные, полученные из preS вируса гепатита В (HBV) пептиды.

Оболочка HBV включает в себя три белка, которые называются L (большой), М (средний) и S (малый) (см. фигуру 1А). У них одинаковый С-концевой S-домен с четырьмя трансмембранными областями. М- и L-белки несут дополнительные N-концевые вставки длиной 55, и, в зависимости от генотипа, 107 или 118 аминокислот (preS2- и preS1) (см. фигуру 1В).

Таким образом, экспрессия «полученного из preS» HBV пептида в соответствии с настоящим изобретением относится к пептиду с аминокислотной последовательностью, которая соответствует N-концевым вставкам L-белка HBV, preS1, предпочтительно консенсусной последовательности видов и генотипов от А до Н, а также консенсусным последовательностям HBV шерстистой обезьяны (WMHBV), вирусов гепатита В шимпанзе и гориллы, но также относится и к их вариантам, предпочтительно вариантам, усеченным по N- и С-концам, вариантам с аминокислотными заменами.

Последовательность с SEQ ID NO: 1 демонстрирует консенсусную аминокислотную последовательность preS HBV видов и генотипов от А до Н, а также консенсусную последовательность HBV шерстистой обезьяны (WMHBV).

Смотрите на фигуре 2 выравнивание, демонстрирующее консенсусную последовательность preS HBV (Consensus) и восемь генотипов HBV (А-Н), а также последовательность preS из HBV шерстистой обезьяны (WMHBV), охватывающую аминокислоты со 2 по 48. Обратите внимание на то, что генотипы А, В, С, Е, F, G и Н имеют вплоть до одиннадцати дополнительных аминокислот на N-концах.

Аминокислотная последовательность HBV «генотипа С» в данной заявке относится к искусственной последовательности, которая соответствует или является идентичной HBV генотипа С, например, представленной в «Genbank» под номером ABV02850.1, за исключением того, что в позиции 46 в генотипе С настоящего изобретения (в соответствии с нумерацией описанной ниже) вместо Gln (Q) последовательности из «Genbank» находится Lys (К); последовательность HBV генотипа С данной заявки можно также назвать «HBV генотип С Q46K». Смотрите также последовательности SEQ ID NOs. 4, 12, 21-27.

На фигуре 2 также представлена нумерация аминокислотных остатков консенсусной последовательности preS HBV, о которой пойдет речь в тексте данной спецификации:

Аминокислотный остаток под номером 1 является метионином (Metl) генотипа D (ранее описанного как подтип ayw, см. также последовательность с SEQ ID NO: 5), в то время как аминокислотный остаток под номером - 11 является метионином (Met-11) генотипа С (SEQ ID NO: 4). In vivo Metl или Met(-11), соответственно, отрезаются клеточной метиониламинопептидазой и модифицируются последовательным переносом N-миристоилтрансферазой миристоильного остатка с Миристоил-СоА на аминокислотный остаток под номером 2, глицин (Gly2), или на аминокислотный остаток под номером (-10), глицин (Gly(-10)), соответственно. N-концевой аминокислотный остаток генотипа D является естественной аминокислотой глицином (Gly2) и числиться под номером 2 в соответствии с соответствующей нумерацией кодонов исходной открытой рамки считывания L (или, например Gly(-10) для генотипа С). Консенсусная последовательность preS HBV также содержит дополнительные N-концевые аминокислоты генотипов А, В, С, Е, F, G и Н (обозначенные как позиции «-»). Таким образом, в общем консенсусная последовательность preS HBV охватывает позиции от (-11) до 48.

Таким образом, существует разница между описанной выше нумерацией и действительным порядком аминокислот в последовательности с SEQ ID NO: 1, например Met (-11), номер остатка (-11), числится как остаток 1 последовательности с SEQ ID NO: 1; Gly (-10), номер остатка (-10), числится как остаток 2 последовательности с SEQ ID NO: 1; Met 1, номер остатка 1, числится как остаток 12 последовательности с SEQ ID NO: 1; Gly 2, номер остатка 2, числится как остаток 13 последовательности с SEQ ID NO: 1; Gly 48, номер остатка 48, числится как остаток 58 последовательности с SEQ ID NO: 1; SEQ ID NO: 1 консенсусная последовательность preS HBV (позиции от (-11) до 48)

Для последовательностей SEQ ID NOs. 2-10 смотрите также номера доступа в «Genbank»:

HBV Генотипа A Genbank AAT28684.1

HBV Генотипа В Genbank AAUO 1950.1

HBV Генотипа С Genbank ABV02850.1 (где в позиции 46 находится Lys (К) (как в последовательности с SEQ ID NO: 4) вместо Gin (Q) (of ABV02850.1)

HBV Генотипа D Genbank AAR1 9337.1

HBV Генотипа E Genbank ABS31101.1

HBV Генотипа F Genbank ABK1 9774.1

HBV Генотипа G Genbank AAF34735.1/AF160501_3

HBV Генотипа Н Genbank AAM09052.1

WMHBV Genbank AAC 16905.1

Гидрофобный, модифицированный, полученный из preS HBV пептид в соответствии с настоящим изобретением имеет формулу

,

где

Р является указанным полученным из preS пептидом

Н является указанной гидрофобной модификацией Р;

R является С-концевой модификацией Р;

m равно, по меньшей мере, 1;

n равно 0 или, по меньшей мере, 1.

Полученный из preS HBV пептид, Р, в соответствии с настоящим изобретением содержит:

- аминокислотную последовательность консенсусной последовательности preS HBV, как показано в последовательности с SEQ ID NO: 1, или

- ее варианты.

«Вариантами» предпочтительно являются укороченные с N- и С-конца варианты, варианты с аминокислотными заменами и делециями или удлиненные варианты. Варианты содержат помимо прочего аминокислотную последовательность, содержащую модифицированную аминокислоту (или аминокислоты), неприродную аминокислоту (или аминокислоты) или пептидомиметик(и) или дополнительные соединения, которые могут имитировать пептидный остов/структуру.

Предпочтительно, если варианты выбираются из укороченных с N- или С-конца вариантов последовательности с SEQ ID NO: 1; вариантов с аминокислотными заменами или делециями; вариантов, содержащих модифицированную аминокислоту (или аминокислоты), неестественную аминокислоту (или аминокислоты) или пептидомиметик(и), или из дополнительных соединений, которые могут имитировать пептидный остов/структуру.

В соответствии с изобретением вариант гидрофобного, модифицированного, полученного из preS пептида содержит, по меньшей мере, 10 или 20 последовательных аминокислот последовательности с SEQ ID NO: 1 и может состоять из 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или большего количества аминокислот последовательности с SEQ ID NO:1 или ее вариантов.

Укороченные с N- и/или С-конца варианты содержат предпочтительно, по меньшей мере, 48 последовательных аминокислот последовательности с SEQ ID NO: 1 (предпочтительно остатки со 2 по 48), более предпочтительно, по меньшей мере, 17 последовательных аминокислот последовательности с SEQ ID NO: 1 (предпочтительно остатки с 5 по 21) или, по меньшей мере, 20 последовательных аминокислот последовательности SEQ ID NO: 1 (предпочтительно остатки со 2 по 21).

Термин «вариант» также относится к гомологичным последовательностям, обнаруженным в различных вирусных видах, штаммах или подтипах рода гепаднавирусов, таких как штамм alfa 1 HBV, штамм LSH HBV (изолят из шимпанзе), HBV шерстистой обезьяны (WMHBV), или штаммы, выбранные из группы, состоящей из генотипов HBV от А до Н, а также и определенного здесь HBV генотипа С Q46K (также как в последовательности SEQ ID NO: 4).

Термин «вариант» также относится к гомологичным последовательностям, которые демонстрируют, по меньшей мере, 50% идентичность последовательности с SEQ ID NO: 1 или любой другой раскрытой здесь аминокислотной последовательности, предпочтительно 70%, более предпочтительно 80%, еще более предпочтительно 90% или 95%.

Таким образом, в предпочтительном гидрофобном, модифицированном, полученном из preS пептиде Р по изобретению содержится вариант последовательности с SEQ ID NO: 1 с аминокислотной последовательностью различных вирусных видов, штаммов или подтипов, предпочтительно генотипов HBV или HBV шерстистой обезьяны (woolly monkey HBV (WMHBV) или их вариантов.

Предпочтительно, если Р содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей с SEQ ID NO: со 2 по 10 или их вариантов (см. также фигуру 2).

В предпочтительном воплощении в гидрофобном, модифицированном, полученном из preS пептиде Р по изобретению содержится вариант последовательности с SEQ ID NO: 1 с аминокислотной последовательностью, выбранной

из аминокислотных остатков со 2 по 21,

из аминокислотных остатков с 5 по 21,

из аминокислотных остатков с 5 по 15 или

из аминокислотных остатков с 9 по 15 (см. также последовательность [SEQ ID NO: 15])

представленной в последовательности с SEQ ID NO: 1 консенсусной последовательности preS HBV.

Более предпочтительно, если Р не содержит аминокислотных замен и/или делеций остатков с 9 по 22 последовательности с SEQ ID NO: 1, как, например, делеция остатков с 17 по 21.

Более предпочтительно, если Р не содержит аминокислотных замен и/или делеций остатков с 9 по 15 последовательности с SEQ ID NO: 1.

Более предпочтительно, если мотив последовательности NPLGFFP [SEQ ID NO:15] (соответствующий остаткам с 9 по 15 последовательности с SEQ ID NO: 1) не прерывается или не модифицируется, например, путем замены остатков 11-15 D-аминокислотами.

Более предпочтительно, если в гидрофобных, модифицированных, полученных из preS пептидах Р по изобретению содержится вариант последовательности с SEQ ID NO: 1 с аминокислотной последовательностью, выбранной из:

аминокислотных остатков со 2 по 48 консенсусной последовательности [SEQ ID NO: 11];

[SEQ ID NO: 12]; аминокислотных остатков со 2 по 21 генотипа С [SEQ ID NO: 13];

аминокислотных остатков с 5 по 21 генотипа С [SEQ ID NO: 14];

аминокислотных остатков с 9 по 15 генотипа С [SEQ ID NO: 15];

аминокислотных остатков со 2 по 48 генотипа D [SEQ ID NO: 16];

аминокислотных остатков с 5 по 48 генотипа D [SEQ ID NO: 17];

аминокислотных остатков со 2 по 33 генотипа D [SEQ ID NO: 18];

аминокислотных остатков с 5 по 33 генотипа D [SEQ ID NO: 19];

аминокислотных остатков со 2 по 21 генотипа D [SEQ ID NO: 20];

аминокислотных остатков с 9 по 15 генотипа D [SEQ ID NO: 15].

Таким образом, предпочтительно, если Р содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей с SEQ ID NO: с 11 по 20 или из их вариантов.

Также смотрите предпочтительные аминокислотные последовательности Р ниже в таблицах 1-7, фигурах и примерах.

«Варианты» последовательности с SEQ ID NO: 1 также содержат варианты или «аналоги», содержащие аминокислотные делеции, аминокислотные замены, такие как консервативная или неконсервативная замена другими аминокислотами или изостерами (модифицированными аминокислотами, которые несут близкую структурную и пространственную схожесть с белковыми аминокислотами), аминокислотные дополнения или изостерные дополнения, при условии если последовательности дают 70% ингибирование инфекции HBV при концентрации пептида ниже 10 мкМ, и предпочтительно ниже 1 мкМ.

Консервативные аминокислотные замены, как правило, относятся к заменам аминокислотами того же класса. Эти классы включают, например,

- аминокислоты, обладающие незаряженными полярными боковыми цепями, такие как аспарагин, глутамин, серин, треонин и тирозин;

- аминокислоты, обладающие основными боковыми цепями, такие как лизин, аргинин и гистидин;

- аминокислоты, обладающие кислыми боковыми цепями, такие как аспарагиновая кислота и глутаминовая кислота; и

- аминокислоты, обладающие неполярными боковыми цепями, такие как глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан и цистеин.

Гидрофобные, модифицированные, полученные из preS пептиды по изобретению предпочтительно могут быть модифицированы для того, чтобы обладать повышенными иммуногенными свойствами. К таким повышенным иммуногенным свойствам относятся, например, увеличение диапазона антител, выявляемых после иммунизации, или запуск продуцирования антител, способных нейтрализовать инфекцию различных вирусных штаммов.

В другом воплощении гидрофобные, модифицированные, полученные из preS пептиды по изобретению предпочтительно могут быть модифицированы для ослабления их иммуногенных свойств. Такие гидрофобные, модифицированные, полученные из preS пептиды могут быть особенно полезны в терапевтическом применении для ингибирования инфекции HBV in vivo, при отсутствии или ограничении побочных эффектов.

Таким образом, предпочтительными мотивами модифицированных заменой и/или делецией последовательностей являются последовательности, ответственные за иммуногенность, такие как эпитопы для В- и/или Т-клеток, и, помимо этого, такие как мотивы распознавания антителами.

Предпочтительными эпитопами HBV для В-клеток являются аминокислотные остатки с 20 по 23, мотив DPAF последовательности с SEQ ID NO: 1 и аминокислотные остатки с 26 по 32, мотив NSNNPDW, консенсусной последовательности (SEQ ID NO: 1) и генотипа С (SEQ ID NO: 4) или мотив NTANPDW генотипа D (SEQ ID NO: 5).

В предпочтительном воплощении модифицируются аминокислотные остатки с 20 по 23 последовательности с SEQ ID NO: 1, предпочтительно путем аминокислотной замены; и/или аминокислотные остатки с 26 по 32, предпочтительно путем аминокислотной замены и/или делеции.

Предпочтительно, если аминокислотные остатки с 20 по 23 последовательности с SEQ ID NO: 1 (мотив DPAF) модифицируются заменой на аминокислоту аланин, предпочтительно в мотив APAF.

Предпочтительно, если аминокислотные остатки с 26 по 32 последовательности с SEQ ID NO: 1 модифицируются заменой на аминокислоту аланин, предпочтительно в мотив NANAPDW или NAAAPDW.

В предпочтительном воплощении Р содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей с SEQ ID NO: с 21 по 28 или из их вариантов.

Смотрите также ниже таблицы 2, 7 и соответствующие фигуры и примеры.

В более предпочтительном воплощении Р содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей:

SEQ ID NO: 11 (остатки со 2 по 48 консенсусной последовательности),

SEQ ID NO: 12 (остатки со 2 по 48 генотипа С),

SEQ ID NO: 13 (остатки со 2 по 21 генотипа С),

SEQ ID NO: 4 (остатки с (-11) по 48 генотипа С), и

SEQ ID NO: 20 (остатки со 2 по 21 генотипа D).

Гидрофобная модификация (Н) полученного из preS пептида Р является N-концевой.

К «N-концевым» относится гидрофобная модификация на N-конце, т.е. соответствующая первому аминокислотному остатку (например, Gly 2), но также к ним могут относиться гидрофобные модификации в непосредственной близости от N-конца, например, соответствующие аминокислотным остаткам (-4), (-3), (-2), (-1), 1, 2 или 3 или 4. Таким образом, гидрофобная модификация помимо прочего может быть получена путем прикрепления гидрофобного функционального компонента на участке, близком к N-концу Р.

Гидрофобная модификация указанного полученного из preS HBV пептида по настоящему изобретению добавляет гидрофобный функциональный компонент к пептиду.

Более того m равно, по меньшей мере, 1, т.е. модификация, по меньшей мере, одним гидрофобным функциональным компонентом или группой.

В предпочтительных воплощениях по этому изобретению m равно 1, 2, 3, 4 или больше. Т.е. Р может быть модифицирован более чем одним гидрофобным функциональным компонентом или группой, например, 2-мя. Гидрофобные функциональные компоненты или группы могут быть одинаковыми или отличаться друг от друга.

Гидрофобная модификация указанного полученного из preS HBV пептида по настоящему изобретению выбирается из:

- ацилирования;

- добавления гидрофобного функционального компонента.

Ацилирование предпочтительно выбирается из ацилирования карбоновыми кислотами, жирными кислотами, аминокислотами с липофильной боковой цепью.

Предпочтительными являются насыщенные или ненасыщенные жирные кислоты, разветвленные или неразветвленные жирные кислоты, предпочтительно с 8-22 атомами углерода (от С8 до С22).

Более предпочтительно, если гидрофобная модификация ацилированием выбирается из ацилирования миристоилом (С14), пальмитоилом (С16) и стеароилом (С18).

Добавление гидрофобных функциональных компонентов предпочтительно выбирается из добавления холестерина, производных холестерина, фосфолипидов, гликолипидов, эфиров глицерина, стероидов, церамидов, производных изопрена, адамантана, фарнезола, алифатических групп, полиароматических соединений.

Прикрепление гидрофобного компонента предпочтительно осуществляется ковалентным связыванием, которое может быть достигнуто посредством карбаматной, амидной, эфирной, дисульфидной или любой другой связи, доступной специалисту в данной области.

Таким образом, гидрофобные, модифицированные, предпочтительно ацилированные, полученные из preS пептиды по этому изобретению предпочтительно являются липопептидами из-за их N-концевой липофильной или гидрофобной группы/функционального компонента.

Предпочтительные гидрофобные, модифицированные, полученные из preS пептиды смотрите также в таблицах 1 и 2.

Более предпочтительными гидрофобными, модифицированными, полученными из preS пептидами по изобретению являются те, в которых:

- Р содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательностей SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 20; и

- H является гидрофобной модификацией ацилированием с помощью миристоила (С14), или стеароила (С18), предпочтительно стеароила (С18).

Таким образом, более предпочтительными гидрофобными, модифицированными, полученными из preS пептидами по изобретению являются:

Обозначение пептида	Аминокислотная последовательность	Гидрофобная модификация
HBVpreS/2-48stearoyl (consensus)	SEQ ID NO: 11	Стеароил (С18)
HBVpreS/2-48myr (consensus)	SEQ ID NO: 11	Миристоил (С14)
HBVpreS/2-48stearoyl (С)	SEQ ID NO: 12	Стеароил (С18)
HBVpreS/2-48myr (С)	SEQ ID NO: 12	Миристоил (С14)
HBVpreS/2-21stearoyl (C)	SEQ ID NO: 12	Стеароил (С18)
HBVpreS/(-11)-48stearoyl (C)	SEQ ID NO: 4	Стеароил (С18)
HBVpreS/(-11)-48myr (C)	SEQ ID NO: 4	Миристоил (С14)
HBVpreS/2-21stearoyl (C)	SEQ ID NO: 20	Стеароил (С18)

где (С) относится к HBV генотипа С Q46K.

Предпочтительное воплощение последовательностей генотипа С

В весьма предпочтительном воплощении этого изобретения гидрофобные, модифицированные, полученные из preS пептиды Р по изобретению содержат аминокислотную последовательность, полученную из генотипа С.

Гидрофобный, модифицированный, полученный из preS генотипа С пептид (или пептиды) настоящего изобретения ингибирует инфекцию HBV более сильно чем те, что получены из генотипа D. Смотрите также фигуру 3 и таблицу 3.

Как обсуждалось выше, аминокислотная последовательность HBV «генотипа С» в данной заявке относится к искусственной последовательности, которая соответствует или является идентичной последовательности HBV генотипа С, например, представленной в «Genbank» под номером ABV02850.1, за исключением того, что в позиции 46 генотипа С настоящего изобретения (в соответствии с нумерацией описанной ниже) находится Lys (К), вместо Gin (Q), представленного в последовательности из «Genbank»; последовательность HBV генотипа С этой заявки можно также назвать «HBV генотипа С Q46K». Смотрите также последовательности с SEQ ID NO: 4, 12, 21-27.

Нумерация, подобная описанной выше для консенсусной последовательности preS HBV используется для нумерации аминокислотных остатков последовательности генотипа С (смотрите также фигуру 2), например,

Met (-11), номер остатка (-11), числится как остаток 1 последовательности с SEQ ID NO: 1;

Gly (-10), номер остатка (-10), числится как остаток 2 последовательности с SEQ ID NO: 1;

Met 1, номер остатка 1, числится как остаток 12 последовательности с SEQ ID NO: 1;

Gly 2, номер остатка 2, числится как остаток 13 последовательности с SEQ ID NO: 4; и числится как остаток 1 последовательности с SEQ ID NO: 12;

Gly 48, номер остатка 48, числится как остаток 58 последовательности с SEQ ID NO: 4; и числится как остаток 47 последовательности с SEQ ID NO: 12;

SEQ ID NO: 12 аминокислотная последовательность, которая соответствует позициям от 2 по 48 HBV Генотипа С за исключением того, что в позиции 46 находится Lys (К) вместо Gln (Q); Q46K

2-GTNL SVPNP LGFFP DHQLD PAFGA NSNNP DWDFN PNKDH WPEAN KVG-48

Предпочтительно Р может быть выбран из

SEQ ID NO: 12 (остатки со 2 по 48 генотипа С),

SEQ ID NO: 4 (остатки с (-11) по 48 генотипа С),

SEQ ID NO: 13 (остатки со 2 по 21 генотипа С),

SEQ ID NO: 14 (остатки с 5 по 21 генотипа С), и

SEQ ID NO: 15 (остатки с 9 по 15 генотипа С),

В предпочтительном воплощении последовательностей генотипа С гидрофобный, модифицированный, полученный из preS вируса гепатита В (HBV) пептид формулы

,

в которой предпочтительно:

Р является полученным из preS пептидом, содержащим аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 12 или укороченный с N- и/или С-конца вариант этой последовательности длиной, по меньшей мере, 10 последовательных аминокислот, или ее производное, содержащее модифицированную аминокислоту (или аминокислоты), неестественную аминокислоту (или аминокислоты) или пептидомиметик(и);

Н является гидрофобной модификацией полученного из preS пептида Р, которая является N-концевой и выбирается из ацилирования и добавления гидрофобного функционального компонента;

R является С-концевой модификацией указанного полученного из preS пептида Р;

m равно, по меньшей мере, 1;

n равно 0 или, по меньшей мере, 1.

Предпочтительный пептид по изобретению особенно эффективен для ингибирования инфекций HBV и/или HDV, для профилактики острых инфекции HBV и/или HDV и/или для лечения гепатита В и/или D.

Предпочтительно, если Р содержит или состоит из аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 12 (остатки со 2 по 48 генотипа С).

Также предпочтительно, если Р содержит вариант аминокислотной последовательности с SEQ ID NO: 12, где вариант содержит, по меньшей мере, 10 последовательных аминокислотных остатков последовательности с SEQ ID NO: 12 (предпочтительно остатки с 9 по 18), более предпочтительно 15 или 20, и может состоять из 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 или большего количества аминокислотных остатков последовательности с SEQ ID NO: 12.

Предпочтительно, если последовательные аминокислотные остатки последовательности с SEQ ID NO: 12, которые содержаться в Р, выбираются из

аминокислотных остатков с 9 по 15 генотипа С [=SEQ ID NO: 15],

аминокислотных остатков со 2 по 15 генотипа С,

аминокислотных остатков с 9 по 18 генотипа С,

аминокислотных остатков со 2 по 18 генотипа С,

аминокислотных остатков со 2 по 20 генотипа С,

аминокислотных остатков со 2 по 21 генотипа С [=SEQ ID NO: 13],

аминокислотных остатков с 5 по 21 генотипа С [=SEQ ID NO: 14],

аминокислотных остатков со 2 по 25 генотипа С,

аминокислотных остатков со 2 по 30 генотипа С,

аминокислотных остатков со 2 по 35 генотипа С,

аминокислотных остатков со 2 по 40 генотипа С,

аминокислотных остатков со 2 по 45 генотипа С,

аминокислотных остатков со 2 по 46 генотипа С, или

аминокислотных остатков со 2 по 48 генотипа С [=SEQ ID NO: 12].

В воплощениях, Р содержит соответствующие остаточные аминокислотные остатки последовательности с SEQ ID NO: 12, а именно

аминокислотные остатки с 16 по 48 генотипа С,

аминокислотные остатки с 19 по 48 генотипа С,

аминокислотные остатки с 21 по 48 генотипа С,

аминокислотные остатки с 22 по 48 генотипа С,

аминокислотные остатки с 26 по 48 генотипа С,

аминокислотные остатки с 31 по 48 генотипа С,

аминокислотные остатки с 36 по 48 генотипа С,

аминокислотные остатки с 41 по 48 генотипа С,

аминокислотные остатки с 46 по 48 генотипа С, или

аминокислотные остатки с 47 по 48 генотипа С,

которые либо являются идентичными соответствующим аминокислотным остаткам последовательности с SEQ ID NO: 12 либо являются их производными, где производное содержит, по меньшей мере, одну модификацию, выбранную из замены аминокислоты, делеции аминокислоты, модифицированной аминокислоты, неестественной аминокислоты или пептидомиметика,

где, по меньшей мере, одна модификация представлена 1, 2, 3, 4, 5 или большее количество раз.

Здесь описаны предпочтительные аминокислотные замены.

Предпочтительно, если Р содержит аминокислотную последовательность, выбранную из

- аминокислотной последовательности, содержащей аминокислотные остатки 2-15 последовательности с SEQ ID NO: 12 и прилегающей к ней производной аминокислотных остатков 16-48 последовательности с SEQ ID NO: 12;

- аминокислотной последовательности, содержащей аминокислотные остатки 2-20 последовательности с SEQ ID NO: 12 и прилегающей к ней производной аминокислотных остатков 21-48 последовательности с SEQ ID NO: 12;

- аминокислотной последовательности, содержащей аминокислотные остатки 2-25 последовательности с SEQ ID NO: 12 и прилегающей к ней производной аминокислотных остатков 26-48 последовательности с SEQ ID NO: 12;

- аминокислотной последовательности, содержащей аминокислотные остатки 2-30 последовательности с SEQ ID NO: 12 и прилегающей к ней производной аминокислотных остатков 31-48 последовательности с SEQ ID NO: 12;

- аминокислотной последовательности, содержащей аминокислотные остатки 2-35 последовательности с SEQ ID NO: 12 и прилегающей к ней производной аминокислотных остатков 36-48 последовательности с SEQ ID NO: 12;

- аминокислотной последовательности, содержащей аминокислотные остатки 2-40 последовательности с SEQ ID NO: 12 и прилегающей к ней производной аминокислотных остатков 41-48 последовательности с SEQ ID NO: 12;

- аминокислотной последовательности, содержащей аминокислотную последовательность с SEQ ID NO: 12;

в которой производное содержит, по меньшей мере, одну модификацию, выбранную из аминокислотной замены, аминокислотной делеции, модифицированной аминокислоты, неестественной аминокислоты или пептидомиметика,

где, по меньшей мере, одна модификация представлена 1, 2, 3, 4, 5 или большее количество раз.

В предпочтительном воплощении последовательностей генотипа С:

Р содержит аминокислотную последовательность, выбранную из последовательности с SEQ ID NO: 12 или, соответственно, описанных вариантов/производных/модификаций,

- Н является гидрофобной модификацией ацилированием с помощью миристоила (С14), или стеароила (С18), предпочтительно стеароила (С18).

Модификация миристоилированием является предпочтительной при применении in vivo и в медицинских целях из-за ее более высокой безопасности, например, из-за отсутствия побочных эффектов