Микровезикулы, полученные из рекомбинантных дрожжей, обладающие гемостатическими активностями, и их применение

Микровезикулы, полученные из рекомбинантных дрожжей, обладающие гемостатическими активностями, и их применение

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область изобретения

В основном, настоящее изобретение относится к лечению геморрагий у субъекта с помощью прокоагулянта. Более конкретно, изобретение относится к полученным из дрожжей микровезикулам, несущим тканевой фактор, содержащим мембрану дрожжей и тканевой белковый фактор или его фрагмент, или тканевой белковый фактор или его фрагмент, слитый с другим пептидом, в качестве слитого белка, обладающего прокоагулянтной активностью, и к их применению в качестве прокоагулянта, пригодного для лечения геморрагий у субъекта, а также для стимуляции ангиогенеза и клеточной миграции. Изобретение дополнительно относится к способу производства указанной полученной из дрожжей микровезикулы, несущей тканевой фактор.

Предпосылки изобретения

Гемостаз является механизмом, посредством которого живые существа отвечают на геморрагию и вовлекают в участие два процесса, которые включаются сразу после повреждения и остаются активными в течение длительного периода времени. Первый из них известен как первичный гемостаз и отличается возникновением вазоконстрикции в месте повреждения сосудов и образованием агрегатов тромбоцитов. Второй известен как вторичный гемостаз, представляющий собой фазу, в которой под действием различных протеолитических ферментов каскада коагуляции образуется фибриновый сгусток.

Некоторые кофакторы и протеолитические ферменты участвуют во второй фазе процесса свертывания крови, все обозначаются как факторы свертывания, и она состоит из нескольких фаз, заканчивающихся образованием фибрина посредством гидролиза фибриногена под действием тромбина. Тромбин предварительно образуется посредством протеолитического гидролиза апофермента, протромбина. Такой протеолиз осуществляется активированным фактором свертывания X (FXa), который связывается с поверхностью активированных тромбоцитов и только в присутствии этого фактора активированный фактор свертывания V (FVa) и ионы кальция способны гидролизовать протромбин. Активация фактора свертывания X (FX) может произойти двумя различными путями, внутренним путем и внешним путем.

Внутренний путь состоит из серии реакций, в которых каждый профермент гидролизован, переводя его в активную форму протеазы. На каждой стадии недавно образованный протеолитический фермент будет катализировать активацию следующего профермента для последовательного превращения в активную форму.

Во внешнем пути свертывания крови тканевой фактор (ТФ), расположенный на клетках адвентиции в участке повреждения, связывается с циркулирующим фактором свертывания VII/активированным фактором свертывания VII (FVII/FVIIa) с образованием комплекса ТФ::FVIIa и в присутствии кальция, чтобы служить в качестве субстрата, так что происходит активация FX. В настоящее время полагают, что внешний путь является наиболее значимым путем свертывания крови, и общепринятым является то, что в случае геморрагии, вызванной повреждением сосуда, свертывание переключается на внешний путь активации, включающий взаимодействие ТФ со своим лигандом, FVII/FVIIa.

ТФ состоит из белкового компонента (ранее обозначавшийся как апопротеин-III тканевого фактора) и фосфолипида. ТФ специфически связывается с FVII/FVIIa и выполняет важную роль во внешнем пути свертывания крови. Физиологические роли, выполняемые ТФ, хорошо известны; с одной стороны, он представляет собой рецептор, специфичный к FVIIa и, когда образуется комплекс ТФ::FVIIa, он действует в качестве субстрата, так чтобы произошла активация ТФ. Фактически, после повреждения сосуда, ТФ, который в норме изолирован на поверхности клеток адвентиции, снаружи окружающих кровеносные сосуды, вступает в контакт со своим лигандом и взаимодействует с ним, FVII присутствует в крови для образования комплекса ТФ::FVII. Когда такой комплекс образован, происходит самоактивация FVII, превращая его в активную форму (FVIIa).

Гликозилирование представляет собой регулируемый ферментом, сайтспецифичный процесс, посредством которого сахариды добавляются к липидам и белкам. Полагают, что этот процесс вовлечен в стабильность, фолдинг и транспорт; хотя для ТФ не были описаны доказательства его настоящей функции.

Широко принято, что ТФ представляет собой основной элемент, ответственный за быстроту, с которой инициируется коагуляция. Для начала коагуляции абсолютно необходимы активация FX и запуск гидролиза протромбина. Источником FXa, в основном, считается взаимодействие FVIIa с его рецептором, ТФ.

Сообщалось о получении очищенного ТФ из различных тканей, таких как: мозг человека, мозг коровы; плацента человека; мозг овцы; и легкие. Широко принято, что, несмотря на межвидовые различия в структуре белка ТФ, отсутствуют функциональные различия, что было измерено с помощью коагуляционных тестов in vitro.

Широко принято, что для того, чтобы проявить биологическую активность, ТФ должен быть связан с фосфолипидами in vitro. Было показано, что удаление фосфолипидного компонента из ТФ, например, с помощью фосфолипазы, приводит к снижению его биологической активности in vitro. Релипидирование может восстановить активность ТФ in vitro.

Хотя некоторое количество выделенного из различных тканей «очищенного» белка ТФ было доступно, низкая концентрация белка ТФ в крови и тканях и высокая стоимость, как экономическая, так и трудозатратная, очистки белка из тканей делает его дефицитным материалом. Поэтому существует необходимость поиска альтернативного источника белка ТФ, предпочтительно липидированного белка ТФ.

Белок ТФ экспрессировали в различных системах с использованием клонированной кДНК человека. Таким образом, сообщалось о сверхэкспрессии белка ТФ в E. coli (Paborsky et al, Biochemistry 28, 8072 (1989)). Более того, в патенте США № 6261803 раскрыт способ получения функционального рекомбинантного ТФ в прокариотическом организме-хозяине. В E. coli был достигнут высокий выход экспрессируемого полного белка ТФ.

Хотя экспрессия гетерологичного белка в E. coli представляет некоторые преимущества, экспрессия эукариотических белков в указанных бактериях связана с большим количеством проблем, в основном, когда белок должен экспрессироваться в виде гликозилированного эукариотического белка, из-за отсутствия у бактерий их собственных систем гликозилирования.

Поэтому альтернативная стратегия состоит в экспрессии мутантного белка ТФ, у которого отсутствует трансмембранный домен. Этот так называемый «растворимый» ТФ (или «усеченный» ТФ) накапливается в цитоплазме бактериальных клеток и может быть экспрессирован в относительно больших количествах. Однако в этой системе экспрессированный таким образом белок ТФ обычно присутствует в E. coli в квазикристаллическом состоянии в форме так называемых телец включения. В этом случае, тельца включения должны быть растворены с использованием очень больших количеств разобщающих агентов, и белки, которые должны быть мономеризованы, таким образом, затем снова должны пройти фолдинг, с большим трудом и обычно только с низким выходом, в активную, ренатурированную конформацию. Более того, в принципе, растворимый ТФ не пригоден для использования в реагентах для протромбинового времени, так как у него отсутствует домен для взаимодействия с фосфолипидами.

Другой подход к сверхэкспрессии белка ТФ состоит в использовании большого количества известных успешно используемых систем экспрессии, которые кодируют продукты слитых генов (например, с β-галактозидазой, MalE, глутатионтрансферазой, гистидиновой меткой и т.д.). Однако такие системы не пригодны для экспрессии биологически активного ТФ. Хотя могут быть обнаружены продукты экспрессии, и уровень экспрессии также может быть увеличен при использовании указанных систем, полученные таким образом продукты экспрессии иногда связаны с полной потерей функции, которая не может быть восстановлена, даже при использовании скрупулезных методов ренатурирования.

Проблемы сверхэкспрессии белка ТФ в E. coli можно обойти, осуществляя экспрессию указанного белка в эукариотической системе. Таким образом, экспрессия в дрожжевых клетках, в культурах клеток насекомых с использованием вектора на основе бакуловируса или в культивируемых клетках млекопитающих, например, в клетках яичника хомяка, или в человеческих клеточных линиях, в принципе, является пригодной. Однако среди прочих, такие системы страдают от ключевых недостатков; выход рекомбинантного белка значительно ниже, по сравнению с синтезом в рекомбинантной E. coli. Штаммы дрожжей объединяют преимущества приведенных выше отдельных систем хозяев. С одной стороны, они более близко повторяют естественную физиологию эукариотического белка, чем E. coli, и, с другой стороны, они проще в обращении, их легче культивировать, они намного быстрее растут и экономически значительно выгоднее. Тем не менее, также некоторые факторы влияют на экспрессию белков в дрожжах. Указанные факторы включают, но не ограничиваются ими:

выбор генорегуляторной последовательности, такой как промоторы, которая контролирует экспрессию гетерологичного белка; промоторные последовательности, используемые для контроля гетерологичной экспрессии, обычно должны быть «строгими», т.е. они должны осуществлять очень высокую экспрессию белка и быть пригодными для контроля, посредством которого сначала экспрессия может эффективно подавляться, пока не будет достигнута оптимальная биомасса культуры, и затем быстро переключаться на осуществление экспрессии белка; и

эффективная секреция экспрессируемого гетерологичного белка; секреция экспрессируемого белка (внеклеточная экспрессия) обычно является предпочтительной по отношению к внутриклеточной экспрессии, так как последняя сначала влечет за собой разрушение клеток, таким образом, выпуская внутренне содержимое клеток, и затем выделение желаемого белка из неочищенной смеси клеточных материалов и обломков. В свою очередь, еще более эффективная экспрессия белка зависит от некоторых факторов, включая: (i) выбор сигнальных последовательностей-белковых последовательностей, которые обычно представляют собой N-концевые участки природно-секретируемых белков, и которые направляют белок по клеточному секреторному пути, и, (ii) особые компоненты секреторного пути, которые взаимодействуют с сигнальными последовательностями и вызывают секрецию прикрепленного белка.

Stone M.J. et al (Biochem. J. (1995) 310, 605-614) описывают экспрессию поверхностного домена ТФ (усеченный ТФ) в Saccharomyces cerevisiae. Для очистки ТФ, культуры помещают в иммуноаффинную колонку, конъюгированную с антителами и ТФ элюированный белок диализируют. Приведенный способ сделал возможным доступ к миллиграммовым количествам усеченного ТФ.

Brucato CL. et al. (Protein Экспрессия and Purification 26 (2002), 386-393) описывают экспрессию полноразмерного рекомбинантного белка ТФ кролика в Pichia pastoris. Очистка белка ТФ выполняется с помощью иммобилизированной металл-аффинной хроматографии.

До сих пор не известен способ получения больших количеств биологически активного, рекомбинантного ТФ из дрожжей с высоким выходом. Преимущественно, должен быть получен указанный рекомбинантный ТФ с высоким уровнем активности, предпочтительно, с уровнем активности, пригодным для терапевтического применения. Таким образом, целью настоящего изобретения является производство подходящих количеств липидированного белка ТФ с применением рекомбинантных способов. Преимущественно, рекомбинантный белок ТФ должен быть пригоден для терапевтического применения.

Сущность изобретения

В первом аспекте изобретение относится к полученным из дрожжей микровезикулам, несущим тканевой фактор (ТФ), содержащим (i) мембрану дрожжей и (ii) белок тканевого фактора (ТФ) или его вариант, обладающий прокоагулянтной активностью, где часть указанного белка тканевого фактора (ТФ) или его фрагмент, обладающий прокоагулянтной активностью, интегрирован в указанную мембрану.

В дополнительных аспектах изобретение относится к композиции, содержащей полученную из дрожжей микровезикулу, несущую ТФ, к полученной из дрожжей микровезикуле, несущей ТФ, в качестве лекарственного средства, к фармацевтической композиции, содержащей полученную из дрожжей микровезикулу, несущую ТФ, к полученной из дрожжей микровезикуле, несущей ТФ, для лечения геморрагий у субъекта и к полученной из дрожжей микровезикуле, несущей ТФ, для лечения у субъекта заболевания, которое требует стимуляции клеточной миграции и/или ангиогенеза.

В дополнительном аспекте изобретение относится к способу производства полученной из дрожжей микровезикулы, несущей ТФ, обладающий прокоагулянтной активностью, настоящего изобретения, который включает стадии:

a) ферментации культуры рекомбинантных дрожжевых клеток, которые экспрессируют белок ТФ или его вариант, обладающий прокоагулянтной активностью, в условиях, которые позволяют экспрессировать указанный белок ТФ или его фрагмент, обладающий прокоагулянтной активностью;

b) осаждения центрифугированием продукта, образующегося при ферментации со стадии a), для формирования продукта ферментации;

c) гомогенизации указанного продукта ферментации со стадии b) для формирования ферментационного гомогената;

d) разделения указанного ферментационного гомогената со стадии c) для формирования осадка и очищенного дрожжевого экстракта (ОДЭ), содержащего указанную полученную из дрожжей микровезикулу, несущую ТФ, обладающий прокоагулянтной активностью;

e) сбора указанного очищенного дрожжевого экстракта (ОДЭ), содержащего указанную полученную из дрожжей микровезикулу, несущую ТФ, обладающий прокоагулянтной активностью; и, необязательно,

f) при желании, выделения и очистки указанной полученной из дрожжей микровезикулы, несущей ТФ, обладающий прокоагулянтной активностью.

В дополнительном аспекте изобретение относится к способу получения микровезикулы, содержащей представляющий интерес мембранный белок из эукариотической клетки-хозяина, который включает стадии:

a) выращивания культуры указанной эукариотической клетки-хозяина в условиях, которые делают возможной экспрессию указанного представляющего интерес мембранного белка;

b) гомогенизации клеточной фракции из культуры со стадии a);

c) разделения гомогената, полученного на стадии b), для формирования осадка и очищенного клеточного экстракта, содержащего указанные полученные из клетки микровезикулы, содержащие представляющий интерес мембранный белок, и

d) очистки указанных полученных из клеток микровезикул с помощью фракционирования по размеру.

В другом аспекте изобретение относится к модифицированному липидированному белку тканевого фактора (ТФ), выбранному из группы:

(i) усеченного тканевого фактора (ТФ) с частично или полностью отсутствующим доменом, ответственным за связывание с FVIIa, обладающего прокоагулянтной активностью,

(ii) мутантного белка ТФ, обладающего прокоагулянтной активностью, в котором домен, ответственный за связывание с FVIIa, не функционирует, и

(iii) мутантного белка ТФ, обладающего прокоагулянтной активностью, который несет по меньшей мере нефункциональный сайт N-гликозилирования.

В дополнительных аспектах изобретение относится к модифицированному липидированному белку ТФ настоящего изобретения для применения в качестве лекарственного средства, к фармацевтической композиции, содержащей модифицированный липидированный белок ТФ и фармацевтически приемлемый носитель, к модифицированному липидированному белку ТФ для лечения геморрагий у субъекта и для лечения заболевания, которое требует стимуляции клеточной миграции и/или ангиогенеза у субъекта.

В дополнительном аспекте изобретение относится к полинуклеотидной последовательности, которая кодирует усеченный тканевой фактор (ТФ), с частично или полностью отсутствующим доменом, отвечающим за связывание с FVIIa, обладающий прокоагулянтной активностью, мутантный белок ТФ, обладающий прокоагулянтной активностью, в котором домен, отвечающий за связывание с FVIIa, не функционален, и мутантный белок ТФ, обладающий прокоагулянтной активностью, который несет по меньшей мере нефункциональный сайт N-гликозилирования.

Изобретение также относится к вектору, который содержит полинуклеотидную последовательность настоящего изобретения, к клетке-хозяину, которая содержит полинуклеотид настоящего изобретения или вектор настоящего изобретения, и к антителу, которое специфически связывается с модифицированным белком ТФ настоящего изобретения.

Краткое описание фигур

На фиг.1 показана стратегия клонирования для образования pTT10301. Фиг.1A показывает карту плазмиды pTT10301. Фрагмент ДНК в 1050 п.о., содержащий GPD промоторы (pGPD), уникальный сайт BamHI и терминатор PGK (PGKt), вырезали из плазмиды pG1 после обработки ДНК-рестриктазами HindIII и XbaI. Фрагмент ДНК выделяли с помощью электрофореза в агарозном геле, очищали с помощью набора для выделения ДНК (Qiagen) и клонировали в плазмиду Yep352, предварительно обработанную HindIII и XbaI. Полученную плазмиду pTT10301 выращивали в E. coli и очищали с помощью коммерческого набора для очистки ДНК JETstar (Genomed Gmbh). Фиг.1B показывает рестрикционный анализ полученной плазмиды pTT10301.

На фиг.2 показан график гидрофобности/гидрофильности белка ТФ человека. Представлены четыре домена белка (лидерная последовательность, внеклеточный, трансмембранный и цитоплазматический домены).

На фиг.3 показана последовательность кДНК белка ТФ человека (GenBank №BC011029). Внутри прямоугольника находится открытая рамка считывания (ОРС), а также инициирующий (ATG) и терминирующий (TAA) кодоны. Последовательность кДНК включает четыре домена (сигнальный пептид, внеклеточный домен, трансмембранную область и цитоплазматический хвост) белка ТФ человека (чТФ). Стрелки показывают место отжига праймеров A (SEQ ID NO:2) [прямой праймер, кодирующий первые четыре аминокислоты зрелого чТФ с отсутствующим сигнальным пептидом и содержащим инициирующий кодон ATG в рамке с ТФ ОРС] и B (SEQ ID NO:2) [обратный праймер, с концевым кодоном, выделенным полужирным], оба содержат сайт рестрикции BamHI (подчеркнут). На фиг.4 показано схематическое изображение стратегии клонирования для создания плазмиды pTT10302 (фиг.4A). Фрагмент ДНК, полученный реакцией ПЦР, расщепляли с помощью BamHI и клонировали в плазмиду pTT10301, предварительно расщепленную с помощью BamHI, и дефосфорилировали. Полученную плазмиду (pTT10302) выращивали в E. coli и очищали с помощью коммерческого набора для очистки ДНК JETstar (Genomed Gmbh). Фиг.4B показывает рестрикционный анализ полученной плазмиды pTT10302.

На фиг.5 показана экспрессия рТФ в различных рекомбинантных клонах дрожжей. Вестерн-блоттинг анализ экстрактов из дрожжей, трансформированных пустой плазмидой pTT10301 (C-) и с экспрессирующим вектором, содержащим зрелый рекомбинантный белок чТФ, pTT10302 (дорожки 1-8), осуществляли с использованием очищенного мышиного моноклонального антитела против CD142 человека (BID Biosciences Pharmingen). Маркеры молекулярной массы в кДа показаны в левой части фигуры.

На фиг.6 показаны результаты Вестерн-блоттинга после обработки экстрактов yTT10301 эндогликозилазой. Таким образом, экстракты дрожжей, экспрессирующих рТФ (yTT10301), обрабатывали 500-ми единицами эндогликозилазы H (Endo H)(дорожка 2) или N-гликозидазы F (PNGase F) (дорожка 3) в течение одного часа при 37°C, следуя инструкциям производителя. Эти образцы и необработанный экстракт (дорожка 1) анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с моноклональными антителами против ТФ человека. Маркеры молекулярной массы в кДа показаны в левой части фигуры.

Фиг.7 представляет собой фотографии лазерного конфокального микроскопа, показывающие экспрессию рТФ в рекомбинантных дрожжах yTT10301. Сферопласты из рекомбинантных дрожжей, экспрессирующих рТФ, фиксировали с помощью 4% параформальдегида и инкубировали с mAb против АТФазы дрожжей (фиг.7A) или с mAb против человеческого ТФ (фиг.7B). После инкубации со флуоресцин-конъюгированными вторичными козьими антителами против мыши, клетки изучали с помощью конфокального микроскопа (1, 3, 5 и 7) или с помощью фазового контраста (2, 4, 6 и 8). Изображения получены в конфокальном лазерном микроскопе BIO-RAD Radiance 2000.

Фиг.8 представляет собой фотографии конфокального лазерного микроскопа, показывающие экспрессию рТФ рекомбинантными дрожжами в зависимости от присутствия плазмиды pTT10302. Сферопласты из рекомбинантных дрожжей (yTT10300), содержащих пустую экспрессионную плазмиду pTT10301, фиксировали 4% параформальдегидом и инкубировали с mAb против АТФазы дрожжей (фиг.8A) или с mAb против ТФ человека (фиг.8B). После инкубации с флуоресцин-конъюгированными вторичными козьими антителами против мыши, клетки изучали с помощью конфокального микроскопа (1 и 3) или с помощью фазового контраста (2 и 4). Изображения были получены в конфокальном лазерном микроскопе BIO-RAD Radiance 2000.

На фиг.9 показано, что рТФ связан с мембранами дрожжей. Экстракт из yTT10301 обрабатывали Triton X114 и после центрифугирования водную фазу и осадок детергента отбирали по отдельности. Водную фазу снова обрабатывали Triton X114 (конечная концентрация 1%) и две фазы разделяли, как указано выше. Второй осадок детергента смешивали с первым. Цельный экстракт (дорожка 1), первую (дорожка 2), вторую (дорожка 3) водные фазы и фазу детергента (дорожка 4) анализировали с помощью SDS электрофореза в полиакриламидном геле и окраски по Кумаси (фиг.9A) или с помощью Вестерн-блоттинга реакцией с mAb против ТФ человека (фиг.9B).

Фиг.10 представляет собой график, показывающий развитие основных параметров на всем протяжении процесса ферментации. Изменение давления кислорода (PO₂), которое является единственным неконтролируемым параметром, отражает изменения в потребности в кислороде, испытываемой клетками в ходе процесса. Ферментацию останавливали, когда PO₂ достигало стационарного состояния (18 часов).

Фиг.11 представляет собой диаграмму, представляющую общую схему процесса ферментации для продуцирования ОДЭ-ТФ.

На фиг.12 показаны результаты Вестерн-блоттинга для определения присутствия ТФ в препаратах, полученных из первого ферментационного теста. Каждая дорожка соответствует 5 мкл или супернатанта (сн), или осадка (ос), полученных с помощью методики, описанной на фиг.11. Образцы белка анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с использованием специфических mAb против ТФ человека. Положительный контроль (рТФ) представляет собой коммерческий ТФ (10 нг), синтезированный в E. coli (American Diagnostica, Inc.). Маркеры молекулярной массы в кДа показаны в левой части фигуры.

На фиг.13 показаны фотографии электронной микроскопии образцов ОДЭ-ТФ. Продукт ОДЭ-ТФ адсорбировали на покрытые углеродом медные сетки, предварительно обработанные тлеющим зарядом. Сетку инкубировали с PBS, содержащим 3% бычий сывороточный альбумин (БСА) в течение 1 часа перед инкубацией со специфическими mAb против чТФ или с неродственным антителом. Сетки тщательно промывали PBS и инкубировали с конъюгированными с золотом антителами кролика против IgG мыши. Сетки промывали и образцы негативно окрашивали, обрабатывая 1% уранилацетатом. Изображения получены в электронном микроскопе JEOL 1200 EXII. Стрелки указывают на положение частиц коллоидного серебра.

На фиг.14 показана схема метода очистки ОДЭ-ТФ с помощью тангенциального поточного фильтрования. A) ОДЭ-ТФ подвергали тангенциальному поточному фильтрованию (ТПФ) в системе тангенциальной фильтрации (Sartorius sartoflow Slice 200 Benchtop). ОДЭ-ТФ последовательно фильтровали через 0,45 мкм, 0,2 мкм и 0,1 мкм мембраны (Sartorius, полисульфон). Предварительно мембраны уравновешивали фосфатным буфером (20 мМ фосфат натрия pH 7,4, 500 мМ NaCl). Материал, оставшийся после фильтрования через 0,2 мкм и перед 0,10 мкм мембранами, собирали и использовали в качестве исходного материала для стадий последующей очистки. B) Для определения распределения размеров микровезикул использовали динамическое светорассеяние.

На фиг.15 показан профиль эксклюзионной хроматографии продукта ОДЭ-ТФ, выполненной на колонке Sephacryl S-500. Элюирование выполняли при 4°C с Фосфатным буфером и собирали фракции по 4 мл при скорости потока 1 мл/мин. Элюирование белка контролировали посредством измерения оптической плотности при 280 нм.

На фиг.16 показан Вестерн-блоттинг для определения рТФ. 15 мкл каждой фракции подвергали электрофорезу в 12,5% SDS-полиакриаламидном геле с трис-глицином. После электрофореза белки переносили на мембраны из нитроцеллюлозы. Затем мембраны инкубировали с коммерческими мышиными моноклональными антителами против ТФ (American Diagnostica) в течение 1 часа. Затем мембраны инкубировали с антителами кролика против IgG мыши, с последующей инкубацией с конъюгированными с пероксидазой хрена козьими антителами против IgG кролика. Иммунореактивные белки определяли с помощью хемилюминесценции с использованием ECL Advanced Western blotting kits (GE Healthcare).

На фиг.17 показан белковый профиль различных партий микровезикул, содержащих рТФ, очищенный с помощью эксклюзионной хроматографии. A) Белки из четырех различных партий очищенных микровезикул, содержащих рТФ (как указано в верхней части фигуры), фракционировали с помощью SDS электрофореза в полиакриламидном геле и гель окрашивали кумаси синим. Molecunlra маркеры массы показаны в левой части фигуры. B) Денситометрический анализ различных белковых полос в каждой партии выполняли после сканирования окрашенного геля.

На фиг.18 показан анализ тонкослойной хроматографии (ТСХ). PA: фосфатидная кислота (Sigma), PS: фосфатидилсерин (Fluka), PG: Фосфатидилглицерин (Sigma), CAR: кардиолипин (Sigma), ERG: эргостерол (Fluka), PE: фосфатидилэтаноламин (Sigma), PI: фосфатидилинозитол (Sigma), PC: фосфатидилхолин (Sigma), TAG: триацилглицериды (Sigma).

На фиг.19 показана последовательность кДНК белка ТФ человека (GenBank №BC011029). Обозначена открытая рамка считывания (ОРС), а также стартовый (ATG) и концевой (TAA) кодоны. Последовательность кДНК включает четыре домена (сигнальный пептид, внеклеточный домен, трансмембранную область и цитоплазматический хвост) белка ТФ человека (чТФ). Стрелки указывают место отжига праймеров A (SEQ ID NO:1) [прямой праймер, кодирующий первые четыре аминокислоты зрелого чТФ с отсутствующим сигнальным пептидом и содержащий инициирующий кодон ATG в рамке с ТФ ОРС] и E (SEQ ID NO:3) [обратный праймер; нуклеотиды, кодирующие гистидин, обозначены полужирным], оба содержат сайты рестрикции BamHI (подчеркнуты).

На фиг.20 показана стратегия клонирования для получения pTT10303. фиг.20A показывает, что фрагмент ДНК, полученный реакцией ПЦР, расщепляли с помощью BamHI и клонировали в плазмиду pTT10301, предварительно расщепленную с помощью BamHI, и дефосфорилировали. Полученную плазмиду pTT10303 выращивали в E. coli и очищали с помощью коммерческого набора для очистки ДНК JETstar (Genomed Gmbh). Фиг.20B показывает рестрикционный анализ полученной pTT10303.

На фиг.21 показаны результаты Вестерн-блоттинга экспрессии рТФ-гистидиновая метка. Вестерн-блоттинг экстрактов из культур рекомбинантных дрожжей yTT10302 (дорожки 1-4, соответствующие клонам 2-5) и рТФ, синтезированного в E. coli (C+). Блот подвергали взаимодействию с очищенными моноклональными антителами мыши против CD142 человека (BD Biosciences Pharmingen). Маркеры молекулярной массы в кДа показаны в левой части фигуры.

На фиг.22 также показаны результаты экспрессии рТФ-His-метка. Фиг.22A показывает SDS электрофорез в полиакриламидном геле и окрашивание кумаси синим экстрактов из дрожжей yTT10300 (дорожка 1), yTT10301, экспрессирующих рТФ (дорожка 2) или yTT10302 (клон №5), экспрессирующих рТФ-His-метка (дорожка 3). Положительный контроль, соответствующий 5 нг рТФ, синтезированного в E. coli (дорожка 4). Фиг.22B представляет собой Вестерн-блоттинг образцов, аналогично показанным на фиг.17A, с использованием моноклональных антител мыши против CD142 человека (BD Biosciences Pharmingen). Маркеры молекулярной массы в кДа показаны в левой части фигуры.

Фиг.23 схематически изображает способ очистки 6HT-ТФ.

На фиг.24 показаны результаты очисти 6HT-ТФ с помощью аффинной хроматографии. ОДЭ-6HT-ТФ использовали в качестве стартового материала. Экстракт фильтровали через фильтр с размером пор 0,2 мкм с помощью тангенциального фильтрования и использовали в 5 мл коммерческой колонке для металл-хелатирующей аффинной хроматографии (HiTrap®, Pharmacia Biotech). Колонку подвергали трем последующим промываниям стартовым буфером (20 мМ фосфатный буфер, 500 мМ NaCl, pH 7,4) без имидазола, с 10 мМ имидазолом и с 100 мМ имидазола, соответственно. 6HT-ТФ элюировали аналогичным буфером, содержащим 1M имидазол. Элюированные фракции по 2,5 мл (дорожки 4-7, соответствующие фракциям №1, №2, №3 и №4, соответственно) собирали и диализовали с 20 мМ фосфатным буфером, 50 мМ NaCl, pH 7,4. Стартовый отфильтрованный дрожжевой экстракт (дорожка 1), несвязанный материал (дорожка 2), последнее промывание стартовым буфером, содержащим 100 мМ, и первые четыре элюированные фракции анализировали с помощью SDS электрофореза в полиакриламидном геле и Вестерн-блоттинга (фиг.24A) или окрашивания серебром (фиг.24B). Маркеры молекулярной массы в кДа указаны в левой части фигуры.

На фиг.25 показаны результаты Вестерн-блоттинга очищенного 6HT-ТФ после обработки эндогликозилазой. Очищенную фракцию 6HT-ТФ обрабатывали 500-ми единицами PNGase F (дорожка 2) или Endo H (дорожка 3), следуя инструкциям производителя. Эти образцы и необработанный элюат (дорожка 1) анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с mAb против ТФ человека. Маркеры молекулярной массы в кДа показаны в левой части фигуры.

На фиг.26 показаны результаты иммунной электронной микроскопии 6HT-ТФ, очищенного с помощью аффинной хроматографии. Первую элюированную фракцию адсорбировали на медных сетках, покрытых коллоидом. Для иммунного мечения коллоидным золотом сетку обрабатывали моноклональными антителами против ТФ.

Фиг.27 является схематическим изображением полученной из дрожжей микровезикулы, несущей ТФ настоящего изобретения. Фиг.22A показывает схематическое изображение полученной из дрожжей микровезикулы, несущей ТФ, настоящего изобретения, содержащей полученную из дрожжей мембрану (1) и белок ТФ (2) (или его фрагмент, обладающий прокоагулянтной активностью), интегрированный в указанную полученную из дрожжей мембрану (1). Изображены внутреннее пространство микровезикулы (3) и внешнее пространство микровезикулы (4). Фиг.22B и 22C показывают основное устройство полученной из дрожжей микровезикулы, несущей ТФ, настоящего изобретения. Липиды полученного из дрожжей мембранного липидного бислоя являются амфипатическими; они имеют полярные гидрофильные головки (5), направленные во внешнее пространство везикулы (4), и два гидрофобных углеводородных хвоста (6), направленных во внутреннее пространство везикулы (3). В варианте осуществления, показанном на фиг.22B, N-концевой домен белка ТФ (2) или его фрагмент, обладающий прокоагулянтной активностью, обращен во внешнее пространство везикулы (4). В варианте осуществления, показанном на фиг.22C, N-концевой домен белка ТФ (2) или его фрагмент, обладающий прокоагулянтной активностью, обращен во внутренне пространство везикулы (3).

На фиг.28 показана последовательность кДНК белка ТФ человека (GenBank №BC011029). Прямоугольником обозначена открытая рамка считывания (ОРС), а также стартовый (ATG) и концевой (TAA) кодоны. Последовательность кДНК включает четыре домена (сигнальный пептид, внеклеточный домен, трансмембранную область и цитоплазматический хвост) белка ТФ человека (чТФ). Стрелки указывают место отжига праймеров F (SEQ ID NO:4) [прямой праймер, кодирующий первые четыре аминокислоты зрелого чТФ с отсутствующим сигнальным пептидом и содержащий инициирующий кодон ATG в рамке с ТФ ОРС] и E (SEQ ID NO:3) [обратный праймер; нуклеотиды, кодирующие гистидин, выделены полужирным], оба содержат сайт рестрикции BamHI (подчеркнут).

Фиг.29. Стратегия клонирования для получения pTT10304. A) Фрагмент ДНК, полученный реакцией ПЦР, расщепляли с помощью BamHI и клонировали в плазмиду pTT10301, предварительно расщепленную с помощью BamHI, и дефосфорилировали. Полученную плазмиду pTT10304 выращивали в in E. coli и очищали с помощью коммерческого набора для очистки ДНК JETstar (Genomed Gmbh). B) Рестрикционный анализ полученного вектора pTT10304.

На фиг.30 показано схематическое изображение положения точечных мутаций в сайтах гликозилирования в ТФ человека.

На фиг.31 показан Вестерн-блоттинг с зондами из антител против ТФ1. ТМ1 относится к замене Ala-Asn в положении 11, ТМ2 относится к замене Ala-Asn в положении 124 и ТМ3 относится к замене Ala-Asn в положении 137. ТМ1,2; 1,3 и 1,2,3 относится к их комбинациям. TT103MH представляет собой ТФ дикого типа.

Фиг.32. Кривые доза-ответ прокоагулянтной активности TT-103 релипидированного рТФ. Прокоагулянтную активность измеряли в коагулометре с использованием объединенной нормальной плазмы человека и различных концентраций или TT-103 из различных пулов или релипидированного рТФ.

На фиг.33 показаны прокоагулянтные активности in vitro необработанного TT-103 (1), TT-103, подвергнутого обработке Triton X-100 (2), TT-103, подвергнутого обработке Triton X-100 после диализа, делающего возможным релипидирование рТФ (3), пустые липосомы (4) и микровезикулы из рекомбинантных дрожжей, не экспрессирующих рТФ (5). Количество рТФ, которое определяли с помощью ELISA, было одинаковым (120 нг/мл) в образцах 1, 2 и 3.

На фиг.34 показана прокоагулянтная активность TT-103 в гепаринизированной плазме (TT-103) по сравнению с релипидированным рТФ, тромбином и тромборелом С.

Подробное описание изобретения

Полученные из дрожжей несущие ТФ микровезикулы настоящего изобретения

В аспекте изобретение относится к полученным из дрожжей микровезикулам, несущим тканевой фактор, в дальнейшем обозначаемый как «полученная из дрожжей микровезикула, несущая ТФ, настоящего изобретения», содержащим (i) мембрану дрожжей и (ii) белок тканевого фактора (ТФ) или его вариант, обладающий прокоагулянтной активностью, где часть указанного белка тканевого фактора (ТФ) или его варианта, обладающего прокоагулянтной активностью, интегрирована в указанный липидный бислой. Полученная из дрожжей микровезикула, несущая ТФ, настоящего изобретения обладает прокоагулянтной активностью и, таким образом, ее можно применять в качестве лекарственного средства для лечения геморрагий у субъекта.

Как использовано в данном описании, термин «полученная из дрожжей микровезикула» относится к малому и замкнутому компартменту, который, главным образом, состоит из мембран или их фрагментов, дрожжевых клеток. В основном, мембрана относится к организованному слою из нескольких молекул, образующих плотную границу клетки (т.е. клеточную или плазматическую мембрану) или границы внутриклеточных органелл.

Компонент (i) полученной из дрожжей микровезикулы, несущей ТФ, настоящего изобретения представляет собой мембрану дрожжей, которая происходит из дрожжевых клеток, использованных в производстве полученной из дрожжей микровезикулы, несущей ТФ, настоящего изобретения. Обычно, мембрана состоит из двух ориентированных слоев липидов (т.е. липидного бислоя), в который могут встраиваться белки. Липидный бислой, который является основной структурой клеточных мембран, обычно образован амфипатическими молекулами (например, фосфолипидами, жирными кислотами и т.д.) в водной среде, каждая молекула ориентирована гидрофильной группой вовне слоя и гидрофобной группой внутрь слоя. Обычно, белки встраиваются в липидный бислой; таким образом, полученная из дрожжей микровезикула, несущая ТФ, настоящего изобретения содержит белки из мембран клеток дрожжей, которые обычно встроены в указанные мембраны дрожжевых клеток.

В конкретном варианте осуществления указанная полученная из дрожжей микровезикула является производной мембран дрожжевых клеток или их фрагментов, таких как, например, плазматические мембраны дрожжевых клеток или их фрагменты. В другом конкретном варианте осуществления указанная полученная из дрожжей микровезикула происходит из внутриклеточных мембран органелл дрожжевых клеток или их фрагментов, таких как ядро, аппарат Гольджи, эндоплазматический ретикулум и т.д.

Указанные полученные из дрожжей микровезикулы, в основном, будут продуцированы из дрожжевых клеток, использованных в их производстве (например, после обработки дрожжевого продукта ферментации гомогенизацией, как показано в способе, раскрытом в примере 1). Практически, можно использовать любые дрожжевые клетки для продуцирования указанных микровезикул, полученных из дрожжей, преимущественно из нефлоккулентных дрожжевых клеток, и, предпочтительно, дрожжевых клеток, классифициро