Выделенное анти-cd30 антитело (варианты), хозяйская клетка, способ получения химерного или гуманизированного варианта анти-cd30 антител (варианты), способ ингибирования роста клеток cd30+ и способ ингибирования роста опухолевых клеток, экспрессирующих cd30

Выделенное анти-cd30 антитело (варианты), хозяйская клетка, способ получения химерного или гуманизированного варианта анти-cd30 антител (варианты), способ ингибирования роста клеток cd30+ и способ ингибирования роста опухолевых клеток, экспрессирующих cd30

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине, в частности к получению дефукозилированных антител к фактору CD30 человека, демонстрирующих повышенную зависящую от антител клеточную цитотоксичность по отношению к клеткам, экспрессирующим фактор CD30, которые не лизируются фукозилированными формами. Изобретение направлено также на хозяйские клетки, экспрессирующие анти-CD30 антитела без фукозильных остатков. Предлагаются также способы ингибирования роста клеток, экспрессирующих CD30, включая опухолевые клетки.

Уровень техники

Молекула клеточной поверхности CD30 входит в состав подсемейства рецепторов фактора некроза опухолей (TNF-R). Члены этого семейства характеризуются вариабельной гомологией, в него входят рецептор фактора роста нервов (NGFR), CD120(a), CD120(b), CD27, CD40 и CD95. Эти молекулы, обычно, характеризуются наличием множественных обогащенных цистеином повторов в экстрацитоплазматической области (de Bruin, Р.С., et al. Leukemia 9:1620-1627 (1995)). Считается, что члены этого семейства играют решающую роль в регуляции пролиферации и дифференциации лимфоцитов. CD30 представляет собой трансмембранный гликопротеин типа I с шестью (для людей) или тремя (для мышей и крыс) обогащенными цистеином повторами в последовательности центральной петли. CD30 существует в виде молекулы весом 120 кДа, образующейся из внеклеточного протеина-предшественника весом 90 кДа. Он уходит ("слущивается") с клеточной поверхности в виде растворимого протеина (sCD30) весом, приблизительно, 90 кДа. Слущивание sCD30 представляет собой активный процесс живой клетки, а не просто вызывается высвобождением белка из умирающей или мертвой клетки. Кодирующие протеин CD30 кДНК (cDNA) удалось клонировать из библиотек экспрессии линии HLTV-1 человеческих Т-клеток HUT-102 методом иммуноскрининга с моноклональными антителами Ki-1 и Ber-H2 (Schwab, U., et al. Nature 299:65 (1982)). Обнаружено, что мышиные и крысиные кДНК CD30 кодируют последовательности аминокислот длиной 498 и 493 остатка, соответственно. Человеческая кДНК CD30 кодируют дополнительно еще 90 аминокислотных остатков, частично дублирующихся из одного из обогащенных цистеином доменов. Ген CD30 был картирован на 1р36 у людей и 5q36.2 у крыс.

Преимущественно, CD30 экспрессируется в активированных лимфоидных клетках. В частности, показано, что стимуляция CD30 в лимфоидных клетках индуцирует плейотропные биологические эффекты, включая пролиферацию, активацию, дифференциацию и смерть клеток, в зависимости от типа клеток, стадии дифференциации и наличия других стимулов (Gruss, H.J. et al., Blood 83:2045-2056 (1994)). Первоначально CD30 идентифицировали с помощью моноклонального антитела Ki-1, которое реагирует с антигенами, экспрессирующимися в клетках Ходжки на (Hodgkin) и Рид-Стернберга (Reed-Stern berg) болезниХоджкина. Соответственно, CD30 широко используются как клинический маркер лимфомы Ходжкина и родственных гематологических злокачественных заболеваний (Froese et al., J. Immunol. 139:2081 (1987); Carde et al., Eur. J. Cancer 26:474 (1990)).

Показано, что CD30 экспрессируется в подмножестве лимфом, не являющихся лимфомами Ходжкина (NHL), включая лимфому Буркитта, анапластические крупноклеточные лимфомы (ALCL), кожные лимфомы Т-клеток, узелковые лимфомы мелкорасщепленных клеток, лимфомы лимфоцитов, лимфомы периферических Т-клеток, лимфомы Леннерта, лимфомы иммунобластов, лейкемии/лимфомы Т-клеток (ATLL), лейкемия взрослых Т-клеток (T-ALL) и фолликулярные лимфомы энтеробластов/центроцитов(cb/сс) (Stein et al., Blood 66:848 (1985); Miettinen, Arch. Pathol. Lab. Med. 116:1197 (1992); Piris et al., Histopathology 17:211 (1990); Burns et al., Am. J. Clin. Pathol. 93:327(1990); и Eckert et al., Am. J. Dermatopathol. 11:345 (1989)), а также в нескольких клеточных линиях, трансформированных вирусами, таких как Т-клетки, трансформированные Т-клеточным лимфотропным вирусом I или II и в В-клетках, трансформированных вирусом Эпштейна-Барра (Stein et al., Blood 66:848 (1985); Andreesen et al., Blood 63:1299 (1984)). Кроме того, экспрессия CD-30 документирована в эмбриональных и неэмбриональных карциномах, злокачественных меланомах, мезенхимных опухолях, а также в миелоидных клеточных линиях и макрофагах на поздней стадии дифференциации (Schwarting et al., Blood 74:1678 (1989); Pallesen et al., Am J. Pathol. 133:446 (1988); Mechtersheimer et al., Cancer 66:1732 (1990); Andreesen et al., Am. J. Pathol. 134:187 (1989)).

Поскольку процентное содержание CD30-пoлoжитeльныx клеток у нормальных индивидуумов весьма мало, экспрессия CD30 в раковых клетках делает их важной мишенью опосредуемой антителами терапии, осуществляемой специфическими целевыми терапевтическими агентами против CDSO-положительных неопластических клеток (Chaiarle, R., et al. Clin. Immunol. 90(2): 157-164 (1999)). Показано, что опосредуемая антителами терапия усиливает цитотоксичность CD30-положительных клеток путем как комплементарной активации, так и зависящей от антител клеточной цитотоксичностью (ADCC) (Pohl С., et al. Int J Cancer 54:418 (1993)). Однако, хотя полученные на сегодняшний день результаты ясно показывают, что CD30 является полезной мишенью для иммунотерапии, они также демонстрируют, что доступные на настоящее время мышиные антитела не являются идеальными терапевтическими агентами. В случае пациентов с рефракторной болезнью Ходжкина пассивная терапия антителами не показала эффективности in vitro или in vivo. Клинические испытания анти-CD30 антител Ber-Н2 позволили определить локализацию антител, но не продемонстрировали ответов (Falini В. et al. (1992) Brit J Haematol. 82:38-45; Koon, H.B. et al. (2000) Curr Opin in Oncol. 12:588-593). В ходе лечения человеческой болезни Ходжкина на мышиной модели SCID совместное использование анти-CD30 антител и дегликозилированного цепного токсина Ricin toxin-A привело к развитию цитотоксичности, токсичность третьей степени наблюдалась также и у людей (Schell, R. et al. (2002) Annals of Oncology 13:57-66).

Таким образом, в настоящее время существует потребность в улучшенных терапевтических антителах против CD30, более эффективных (по сравнению с имеющимися аналогами) при лечении и/или профилактике болезней, опосредуемых CD30.

Раскрытие изобретения

Настоящее изобретение направлено на изолированные дефукозилированные антитела (то есть, на антитела без остатков фукозы), которые связываются с CD30 человека и демонстрируют улучшенную опосредованную (направляемую) антителами клеточную цитотоксичность (ADCC) по отношению к клеткам, экспрессирующим CD30, по сравнению с недефукозилированной формой антител (то есть, сантителами, содержащими остатки фукозы). Изобретение направлено также на методы лечения разнообразных заболеваний, при которых наблюдается экспрессия CD30, с использованием антител и композиций настоящего изобретения.

В соответствии с одним своим аспектом, изобретение направлено на выделенные дефукозилированные моноклональные антитела, или их антиген-связывающие фрагменты, где эти антитела связываются с человеческим белком CD30 с K_D 10×10^-8 М или меньше, более предпочтительно 1×10^-8 М, еще более предпочтительно 5×10^-9 М или меньше, наиболее предпочтительно 1×10^-9 или меньше.

Дефукозилированные антитела настоящего изобретения связываются с CD30 и ингибируют рост клеток, экспрессирующих CD30, усиливая зависящую от антител клеточную цитотоксичность (ADCC) в присутствии человеческих клеток-эффекторов (например, моноцитов или моноядерных клеток), по сравнению с фукозилированной формой антител. В соответствии с одним аспектом изобретения, дефукозилированные антитела опосредуют повышение ADCC экспрессирующих CD30 клеток в присутствии человеческих эффекторных клеток, но не мышиных эффекторных клеток.

В соответствии с предпочтительным аспектом изобретения, дефукозилированные антитела настоящего изобретения индуцируют ADCC клеток L1236 in vitro, а фукозилированная форма антител не индуцирует ADCC, при условии концентрации антитела 0,1 мкг/мл и отношения целевых клеток к клеткам-эффекторам, составляющего 1:50. В соответствии с другим предпочтительным аспектом, дефукозилированные антитела настоящего изобретения усиливают ADCC клеточных лини и L540, L428 и Karpas in vitro, no сравнению с фукозилированной формой антител, при условии концентрации антител 0,1 мкг/мл и отношения целевых клеток к клеткам-эффекторам, составляющего 1:50. Соответственно, антитела настоящего изобретения представляют собой усовершенствованные средства лечения заболеваний, характеризующихся экспрессией CD30.

Предпочтительно, если дефукозилированные антитела настоящего изобретения представляют собой моноклональные антитела. В соответствии с одним своим аспектом, изобретение направлено на гуманизированные или химерные моноклональные антитела. Предпочтительно, если человеческие или химерные антитела готовятся из мышиных анти-CDSO антител, выбранных из группы, содержащей АС 10, HeFi-1, Ber-H2, Ki-1, Ki-4, HRS-3, Irac, HRS-4, M44, M67, Ber-H8. В соответствии с другим своим аспектом, изобретение направлено на человеческие моноклональные антитела.

В соответствии с одним воплощением изобретения, человеческие моноклональные антитела содержат:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, содержащей SEQ ID NO:1, 2 и 3; и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, содержащей SEQ ID NO:4, 5 и 6.

Где антитела связывают CD30 и не содержат остатков фукозы.

Предпочтительная комбинация содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:1; и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.

Еще одна предпочтительная комбинация содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:2; и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:5.

Еще одна предпочтительная комбинация содержит:

(a) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:3; и

(b) вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6.

В соответствии с другим аспектом, изобретение направлено на дефукозилированные анти-CD30 антитела, содержащие:

вариабельную область тяжелой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2, и CDR3; и вариабельную область легкой цепи, содержащую последовательности CDR1, CDR2, и CDR3, где:

(a) последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR1 содержит аминокислотную последовательность выбранную из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:7, 8 и 9;

(b) последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR2 содержит аминокислотную последовательность выбранную из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:10, 11 и 12;

(c) последовательность вариабельной области тяжелой цепи CDR3 содержит аминокислотную последовательность выбранную из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:13, 14 и 15;

(a) последовательность вариабельной области легкой цепи CDR1 содержит аминокислотную последовательность выбранную из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:16, 17 и 18;

(b) последовательность вариабельной области легкой цепи CDR2 содержит аминокислотную последовательность выбранную из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:19, 20 и 21; и

(c) последовательность вариабельной области легкой цепи CDR3 содержит аминокислотную последовательность выбранную из группы, включающей аминокислотные последовательности SEQ ID NO:22, 23 и 24;

Где антитела связываются с CD30 и не содержат остатков фукозы.

Предпочтительная комбинация включает:

(a) вариабельную область тяжелой цепи человека CDR1, содержащую SEQ ID NO:7;

(b) вариабельную область тяжелой цепи человека CDR2, содержащую SEQ ID NO:10;

(c) вариабельную область тяжелой цепи человека CDR3, содержащую SEQ ID NO:13;

(d) вариабельную область легкой цепи человека CDR1, содержащую SEQ ID NO:16;

(e) вариабельную область легкой цепи человека CDR2, содержащую SEQ ID NO:19; и

(f) вариабельную область легкой цепи человека CDR3, содержащую SEQ ID NO:22.

Еще одна предпочтительная комбинация включает:

(a) вариабельную область тяжелой цепи человека CDR1, содержащий SEQ ID NO:8;

(b) вариабельную область тяжелой цепи человека CDR2, содержащую SEQ ID NO:11;

(c) вариабельную область тяжелой цепи человека CDR3, содержащую SEQ ID NO:14;

(d) вариабельную область легкой цепи человека CDR1, содержащую SEQ ID NO:17;

(e) вариабельную область легкой цепи человека CDR2, содержащую SEQ ID NO:20; и

(f) вариабельную область легкой цепи человека CDR3, содержащую SEQ ID NO:23.

Еще одна предпочтительная комбинация включает:

(a) вариабельную область тяжелой цепи человека CDR1, содержащую SEQ ID NO:9;

(b) вариабельную область тяжелой цепи человека CDR2, содержащую SEQ ID NO:12;

(c) вариабельную область тяжелой цепи человека CDR3, содержащую SEQ ID NO:15;

(d) вариабельную область легкой цепи человека CDR1, содержащую SEQ ID NO:18;

(e) вариабельную область легкой цепи человека CDR2, содержащую SEQ ID NO:21; и

(f) вариабельную область легкой цепи человека CDR3, содержащую SEQ ID NO:24.

В соответствии с еще одним аспектом, изобретение направлено на дефукозилированные анти-CD30 антитела человека, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, которая представляет собой продукт или производное гена VH 4-34 или VH 3-07 человека. Изобретение также направлено на дефукозилированные анти-CD30 антитела человека, содержащие вариабельную область легкой цепи, которая представляет собой продукт или производное гена Vk L15, А27 или L6 человека. Кроме того, изобретение направлено на дефукозилированные анти-CD30 антитела человека, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, которая представляет собой продукт или производное гена VH 4-34 или VH 3-07 человека, и вариабельную область легкой цепи, которая представляет собой продукт или производное гена Vk L15, А27 или L6 человека.

В соответствии с еще одним аспектом, изобретение направлено на хозяйскую клетку, содержащую гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулина, кодирующие анти-CD30 антитела, где указанная клетка не содержит фукозил трансферазу, так что экспрессируемые указанной клеткой анти-CD30 антитела не содержат остатков фукозы. Предпочтительно, чтобы гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулина представляли собой гены тяжелых и легких цепей иммуноглобулина человека. Предпочтительно, если фукозил трансфераза - это FUT8. Предпочтительно, чтобы клетка относилась к линии СНО.

В соответствии с еще одним аспектом, изобретение направлено на метод ингибирования роста клеток CD30+. Метод включает приведение клеток в контакт с дефукозилированными анти-CD30 антителами в условиях, достаточных для индукции опосредуемой антителами клеточной цитотоксичности (ADCC) указанных клеток. Клетки могут быть, например, опухолевыми клетками. Предпочтительно, чтобы анти-CD30 антитела представляли собой антитела человека.

Изобретение направлено также на метод ингибирования роста экспрессирующих CD30 опухолевых клеток субъекта. Указанный метод включает назначение субъекту дефукозилированных анти-CD30 антител в количестве, эффективном для ингибирования роста опухолевых клеток субъекта, экспрессирующих CD30. Предпочтительно, чтобы анти-CD30 антитела представляли собой антитела человека. В соответствии с предпочтительными аспектами, опухолевые клетки представляют собой опухолевые клетки болезни Ходжкина (Hodgkin's Disease (HD)) или анапластической крупноклеточной лимфомы (anaplastic large-cell lymphoma (ALCL)).

Другие аспекты и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из следующего далее подробного описания и примеров, которые не ограничивают область изобретения. Содержание всех ссылок, записей генетического банка (Genbank), патентов и опубликованных патентных заявок, процитированных в настоящей заявке, явным образом включены в нее по ссылке.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:30) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:1) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 5F11. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO:7), CDR2 (SEQ ID NO:10) и CDR3 (SEQ ID NO:13), указаны зародышевые производные V, D и J.

На Фиг.2 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:33) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:4) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 5F11. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO:16), CDR2 (SEQ ID NO:19) и CDR3 (SEQ ID NO:22), указаны зародышевые производные V и J.

На Фиг.3 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:31) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 17G1. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO:8), CDR2 (SEQ ID NO:11) и CDR3 (SEQ ID NO:14), указаны зародышевые производные V и J.

На Фиг.4 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:34) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:5) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 17G1. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO:17), CDR2 (SEQ ID NO:20) и CDR3 (SEQ ID NO:23), указаны зародышевые производные V и J.

На Фиг.5 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:32) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:3) вариабельной области тяжелой цепи человеческого моноклонального антитела 2Н9. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO:9), CDR2 (SEQ ID NO:12) и CDR3 (SEQ ID NO:15), указаны зародышевые производные V, D и J.

На Фиг.6 показана нуклеотидная последовательность (SEQ ID NO:35) и аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:6) вариабельной области легкой цепи человеческого моноклонального антитела 2Н9. Отмечены области CDR1 (SEQ ID NO:18), CDR2 (SEQ ID NO:21) и CDR3 (SEQ ID NO:24), указаны зародышевые отклонения V и J.

Фиг.4 представляет собой график, на котором показано цитотоксическое убивающее клетки действие фукозилированной и дефукозилированной форм 5F11 на клеточную линию L540 лимфомы Ходжкина человека, по сравнению с изотипно соответствующим контрольным антителом (1D4).

Фиг.5 представляет собой график, на котором показано цитотоксическое убивающее клетки действие фукозилированной и дефукозилированной форм 5F11 на клеточную линию L428 лимфомы Ходжкина человека, по сравнению с изотипно соответствующим контрольным антителом (1D4).

Фиг.6 представляет собой график, на котором показано цитотоксическое убивающее клетки действие фукозилированной и дефукозилированной форм 5F11 на клеточную линию L1236 лимфомы Ходжкина человека, по сравнению с изотипно соответствующим контрольным антителом (1D4).

Фиг.7 представляет собой график, на котором показано цитотоксическое убивающее клетки действие фукозилированной и дефукозилированной форм 5F11 на клеточную линию лимфомы Karpas Т-клеток человека, по сравнению с изотипно соответствующим контрольным антителом (1D4).

На Фиг.11-12 показаны аминокислотные последовательности человеческих зародышевых линий VH 3-11, VK L15, VK A27, и VK L6 (SEQ ID NOs:25-29, соответственно), отмечены области CDR.

Фиг.9 представляет собой график, на котором показана блокада активности ADCC анти-CD16 антителами.

Фиг.10 представляет собой график, на котором показано цитотоксическое убивающее клетки действие фукозилированной и дефукозилированной форм 5F11 в присутствии мышиных (левая панель) или человеческих (правая панель) эффекторных клеток.

Фиг.11 представляет собой график, демонстрирующий эссэй (анализ) ADCC с использованием крови мартышек cynomolgus.

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение направлено на усовершенствованные композиции антител, ассоциированные с CD30 и/или клетками, экспрессирующими CD30. Антитела настоящего изобретения не содержат фукозильных остатков на своих углеводородных цепях. Более того, антитела демонстрируют улучшенную направляемую антителами клеточную цитотоксичность (ADCC), связанную с уничтожением клеток CD30+. В соответствии с конкретным аспектом изобретения, антитела настоящего изобретения способны убивать клетки CD30+ в таких условиях, в которых фукозилированная форма антител эффективно убивать клетки CD30+ не может. В соответствии с другим аспектом, антитела настоящего изобретения усиливают уничтожение клеток CD30+, по сравнению с фукозилированной формой этих антител. В соответствии с одним аспектом, антитела настоящего изобретения представляют собой полностью гуманизированные антитела и особенно полезны для терапевтического лечения заболеваний людей, связанных с CD30-экспрессирующими клетками. Методы применения анти-CD30 антител без фукозильных остатков для терапевтического лечения (то есть, для лечения и/или профилактики заболеваний, связанных с экспрессией CD30) также охватываются настоящим изобретением.

Чтобы лучше понять настоящее изобретение, необходимо определить некоторые термины. Это сделано далее. В подробном описании будут введены также дополнительные определения.

Термины "CD30" и "антиген CD30" используются здесь взаимозаменяемо и включают любые варианты, изоформы и межвидовые гомологи человеческого CD30, естественно экспрессирующиеся клетками. Выданный Генбанком номер полной аминокислотной последовательности человеческого белка CD30 - это NPJ301234. Полная последовательность кДНК, кодирующая человеческий белок CD30, получила номер Генбанка NM_001243.

В настоящем изобретении термины "антитела без остатков фукозы" и "дефукозилированные антитела" используются взаимозаменяемо и означают антитела, углеводные фрагменты которых не содержат фукозильных остатков, или у которых фукозильные остатки были удалены. Антитела без фукозильных остатков можно получить, например, экспрессией антитела в клетке или системе экспрессии, которая не прикрепляет фукозильные остатки к углеводной цепи антитела или минимизирует прикрепление, или путем химической модификации антитела, удаляющей фукозильные остатки с углеводной цепи (например, обработкой антитела фукозидазой). Термины "без остатков фукозы" и "дефукозилированные" не ограничены механизмами получения антител с измененной углеводной структурой.

В настоящем изобретении термины "антитела, экспрессирующие остатки фукозы" и "фукозилированные антитела" используются взаимозаменяемо и означают антитела, углеводные фрагменты которых содержат фукозу.

Термин "иммунный ответ" означает действие, например, лимфоцитов, антиген представляющих клеток, фагоцитирующих клеток, гранулоцитов и растворимых макромолекул, образующихся в упомянутых выше клетках или в печени (включая антитела, цитокины и комплементы), которое приводит к селективному повреждению, разрушению или выведению из человеческого организма внешних патогенов, клеток или тканей, инфицированных патогенами, раковых клеток или, в случае аутоиммунного заболевания или патологического воспаления, нормальных человеческих клеток или тканей.

В настоящем изобретении термин "эффекторные клетки" означает иммунные клетки, вовлеченный в эффекторную фазу иммунного ответа, а не в когнитивную фазу или фазу активации иммунного ответа. Примеры иммунных клеток включают клетки миелоидного или лимфоидного происхождения, например, лимфоциты (например, В- и Т-клетки, в том числе цитолитические Т-клетки (CTL)), клетки-киллеры, клетки-природные киллеры, макрофаги, моноциты, эозинофилы, нейтрофилы, полиморфоядерные клетки, гранулоциты, тучные клетки и базофилы. Некоторые эффекторные клетки экспрессируют специфические рецепторы Fc и выполняют специфические иммунные функции. В соответствии с предпочтительными аспектами, эффекторная клетка способна индуцировать зависящую от антител опосредованную клетками цитотоксичность (ADCC), например, такой способностью обладают нейтрофилы. Например, экспрессирующие FcR моноциты и макрофаги принимают участие в специфическом уничтожении клеток-мишеней и представлении антигенов другим компонентам иммунной системы или в связывании с клетками, которые представляют антигены. В соответствии с другими аспектами, эффекторная клетка может фагоцитировать антиген-мишень или клетку-мишень. Экспрессия конкретного FcR эффекторной клеткой может регулироваться гуморальными факторами, такими какцитокины. Например, показано, что экспрессия FcαRI усиливается под действием G-CSF или GM-CSF. Такая усиленная экспрессия усиливает эффекторную функцию клеток-носителей FcαRI по отношению к мишеням. Эффекторная клетка может фагоцитировать или лизировать антиген-мишень или клетку-мишень.

"Клетка-мишень" или "целевая клетка" означает любую клетку или патоген, чье уничтожение было бы благоприятно для субъекта (например, человека или животного), и на которое может быть направлена композиция (например, антитела) настоящего изобретения. Например, клеткой-мишенью может быть клетка, экспрессирующая или сверх-экспрессирующая CD30.

Термин "зависящая от антител клеточная цитотоксичность" или "ADCC" означает опосредуемую клетками цитотоксическую реакцию, когда клетка-мишень CD30+ со связанным анти-CD30 антителом распознается эффекторной клеткой с Fc рецепторами и затем лизируется без обязательного участия комплемента.

В контексте настоящего изобретения термин "усиливает ADCC" (например, применительно к клеткам) означает любое заметное усиление лизиса клеток при их взаимодействии с анти-CD30 антителами без фукозильных остатков, по сравнению с уничтожением этих клеток при взаимодействии с фукозилированными анти-CD30 антителами в присутствии эффекторных клеток (например, при отношении клетки-мишени: эффекторные клетки=1:50), например усиление лизиса клеток по меньшей мере, приблизительно, на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 150%, 200%, 250%, 300% или 325%.

Термин "антитело" в контексте настоящего изобретения включает целые антитела и их любые антиген-связывающие фрагменты (антиген-связывающие участки) или отдельные цепи. "Антитело" означает гликопротеин, содержащий по меньшей мере две тяжелые (Н) цепи и две легкие (L) цепи, связанные между собой дисульфидными мостиками, или его антиген-связывающий участок. Каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область тяжелой цепи (обозначается V_H) и постоянную (константную) область тяжелой цепи. Постоянная область тяжелой цепи состоит из трех доменов, C_H1, С_H2 и С_H3. Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (обозначается V_L) и постоянной области легкой цепи. Постоянная область легкой цепи состоит только из одного домена, С_L. Регионы V_H и V_L можно также разделить на области гипервариабельности, называемые областями, определяющими комплементарность (CDR), и перемежающимися с более консервативными областями, так называемыми каркасными областями (FR). Каждый V_H и V_L состоит из трех CDR и четырех FR, расположенными в следующем порядке, начиная от амино-конца и до карбоксильного конца: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат домен связывания, взаимодействующий с антигеном. Три постоянных области антитела могут опосредовать связывание иммуноглобулина с тканями или факторами носителя, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент (Clq) классической системы комплемента.

Термин "антиген-связывающий участок антитела" (или просто "участок антитела") здесь означает один или несколько фрагментов антитела, обладающих способностью специфически связываться с антигеном (например, с CD30). Показано, что антиген-связывающая функция антитела может осуществляться фрагментами антитела полной длины. Примеры связывающих фрагментов антитела, подходящих под определение "антиген-связывающихучастков", включают: (i) фрагмент Fab, одновалентный фрагмент, состоящий из доменов V_L, V_H, С_L и С_H1; (ii) фрагмент F(ab')₂, двухвалентный фрагмент, содержащий два домена Fab, связанных дисульфидными мостиками в области петли, (iii) фрагмент Fd, содержащий домены V_H и С_H1; (iv) фрагмент Fv, состоящий из доменов V_L и V_H одного "плеча" антитела; (v) фрагмент dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), содержащий домен V_H; и (vi) изолированную область (CDR). Более того, хотя два домена фрагмента Fv, V_L и V_H, кодируются двумя различными генами, их можно объединить с использованием рекомбинантных методов и синтетического линкера, в результате чего они будут образовываться как одна белковая цепочка, в которой пара областей V_L и V_H формирует одновалентные молекулы (называемых одноцепочечными Fv (scFv); см, например., Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также попадают под определение "антиген-связывающего участка антитела". Фрагменты этих антител получают традиционными методами, известными специалистам в соответствующей области; их проверка на применимость осуществляется так же, как и в случае интактных антител.

Термин "рекомбинантное человеческое антитело" здесь означает все человеческие антитела, которые готовят, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными методами, в том числе (a) выделенные из животных (например, из мышей) антитела, трансгенные или трансхромосомальные с включением генов иммуноглобулина человека или приготовленные с помощью гибридом (далее этот метод описан подробно), (b) антитела, выделенные из хозяйских клеток, которые были трансформированы так, чтобы экспрессировать антитела человека, например, из трансфертом, (c) антитела, взятые из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека, и (d) антитела, приготовленные, экспрессированные, созданные или выделенные другими способами, предполагающими сплайсинг последовательностей гена иммуноглобулина человека на другие последовательности ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела содержат вариабельные области, в которых области каркаса и CDR являются производными от иммуноглобулина зародышевых линий человека. В соответствии с некоторыми аспектами, однако, рекомбинантные человеческие антитела могут быть подвержены мутагенезу in vitro (или, в случае использования последовательностей животных, трансгенных по отношению к lg человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности областей V_H и V_L рекомбинантных антител представляют собой последовательности, которые, хотя и производны от человеческих зародышевых последовательностей V_H и V_L и родственны им, могут и не существовать в репертуаре зародышевых человеческих антител в природе.

Термин "моноклональное антитело" или "композиция моноклональных антител" здесь означает препарат молекул антитела одного молекулярного состава. Композиция моноклональных антител демонстрирует простую (одиночную) специфичность связывания и сродство к конкретному эпитопу.

Термин "антитело человека" здесь означает антитела с вариабельными областями, у которых как область каркаса, так и CDR, производны от последовательностей зародышевых линий иммуноглобулина человека. Более того, если антитело содержит постоянную область, то этот область также будет производным от последовательностей зародышевых линий иммуноглобулина человека. Антитела человека настоящего изобретения могут содержать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями зародышевых линий иммуноглобулина человека (например, они могут быть результатом мутаций вследствие случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или соматических мутаций in vivo).

Термин "человеческое моноклональное антитело" означает антитела, демонстрирующие простую специфичность связывания, каркасные и CDR вариабельные области которых производны от последовательностей зародышевых линий иммуноглобулина человека. В соответствии с одним аспектом изобретения, человеческие моноклональные антитела получают из гибридомы, которая содержит В-клетки трансгенного животного, например, трансгенной мыши, геном которых содержит трансген тяжелой цепи и легкой цепи человека, включенные в иммортализованную клетку. Термин "человеческое моноклональное антитело" здесь означает также все антитела человека, которые готовят, экспрессируют, создают или выделяют рекомбинантными методами, в том числе (a) выделенные из животных (например, из мышей) антитела, трансгенные или трансхромосомальные с включением генов иммуноглобулина человека или приготовленные с помощью гибридом (далее этот метод описан подробно), (b) антитела, выделенные из клеток-носителей, которые были трансформированы так, чтобы экспрессировать антитела человека, например, из трансфертом, (c) антитела, взятые из рекомбинантной комбинаторной библиотеки антител человека, и (d) антитела, приготовленные, экспрессированные, созданные или выделенные другими способами, предполагающими сплайсинг последовательностей гена иммуноглобулина человека на другие последовательности ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела содержат вариабельные области, в которых области каркаса и CDR являются производными от иммуноглобулина зародышевых линий человека. В соответствии с некоторыми аспектами, однако, рекомбинантные человеческие антитела могут быть подвержены мутагенезу in vitro (или, в случае использования последовательностей животных, трансгенных по отношению к lg человека, соматическому мутагенезу in vivo), и, таким образом, аминокислотные последовательности областей V_H и V_L рекомбинантных антител представляютсобой последовательности, которые, хотя и производны от человеческих зародышевых последовательностей V_H и V_L и родственны им, могут и не существовать в репертуаре зародышевых человеческих антител в природе.

Термин "выделенное (изолированное) антитело" здесь означает антитела, в значительной степени свободные от примесей других антител с другой антигенной специфичностью (например, выделенные антитела, специфически связывающиеся с CD30, в значительной степени не содержат примесей антител, связывающихся с другими антигенами). Выделенные антитела, специфически связывающиеся с эпитопами, изоформами или вариантами человеческого CD30, могут, однако, обладать кросс-реактивностью по отношению к другим родственным антигенам, например, из других видов (например, видовые гомологи CD30). Более того выделенное антитело может быть в значительной степени свободно от примесей других клеточных компонентов и/или химических веществ. В соответствии с одним аспектом настоящего изобретения, комбинацию "выделенных" моноклональных антител с различной специфичностью объединяют в хорошо описанную композицию.

Термин "гуманизированное антитело" здесь означает антитела, у которых последовательности CDR, выделенные у зародышевых линий других млекопитающих, например, мыши, были трансплантированы в каркасные последовательности человека. В каркасные области этих последовательностей человека могут быть внесены дополнительные модификации.

Термин "химерное антитело" здесь означает антитела, вариабельные области последовательностей которых получены у одних видов, а постоянные области - у других видов. Например, у такого антитела вариабельные области могут быть производными от антитела мыши, а постоянные области - от антитела человека.

Термин "эпитоп" означает протеиновый детерминант, способный к специфическому связыванию к или с антителом. Обычно, эпитопы состоят из химически активных групп молекул на своей поверхности, такие как аминокислоты или боковые цепи Сахаров, и, обычно, характеризуются специфической трехмерной структурой и специфическими зарядами. Конформационные эпитопы отличаются от неконформационных тем, что связывание с первыми прекращается в присутствии денатурирующих агентов, а со вторыми - нет.

В настоящей заявке термин "специфическое связывание" означает связывание антитела с предопределенным антигеном. Как правило, при константа диссоциации (K_D) комплекса антиген-антитело составляет 10^-7 М или меньше, причем K_D при связывании антитела с предопределенным антигеном по меньшей мере в два раза меньше K_D связывания с неспецифическим антигеном (например, с BSA, казеином), то есть, не с предопределенным или близкородственным ему антигеном. Фразы "антитело, распознающее антиген" и "антитело, специфическое для антигена" используются взаимозаменяемо с термином "антитело, которое специфически связывается с антигеном".

Термин "изотип" означает здесь класс антитела (например, IgM или IgGI), кодирующийся генами постоянной области тяжелой цепи.

Термин "вектор" означает здесь молекулу нуклеиновой кислоты, способную транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Одним из типов вектора является "плазмида", представляющая собой петлю двухцепочечной ДНК, в которую могут быть встроены дополнительные сегменты ДНК. Другим типом вектора является вирусный вектор, дополнительные сегменты ДНК могут быть встроены в вирусный геном. Некоторые векторы способны автономно реплицир