Способ получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов с синдромом дауна

Способ получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов с синдромом дауна

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к биотехнологии, в частности, к получению стволовых клеток взрослого человека, и более конкретно, к получению индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из соматических клеток пациентов с синдромом Дауна, которые могут быть использованы при создании тест-систем для скрининга новых лекарственных средств против прогрессирующей нейродегенерации при синдроме Дауна и болезни Альцгеймера, в качестве in-vitro модели для фундаментальных исследований нейродегенеративных процессов, а также для заместительной клеточной терапии нейродегенеративных заболеваний.

Синдром Дауна (СД) является одной из форм геномной патологии, при которой чаще всего кариотип содержит 47 хромосом, вместо нормальных 46, за счет наличия лишней 21-й хромосомы. Одной из многочисленных форм патологических проявлений данного синдрома является умственная отсталость пациентов в детстве по сравнению с нормой, а также чрезвычайно высокая вероятность развития с возрастом симптомов прогрессирующего умственного слабоумия, схожего с болезнью Альцгеймера. В обоих случаях исследователи наблюдают массовую гибель нервных клеток, отвечающих за обучение, память, сознание. Ряд исследователей связывают данный факт с тем, что именно в 21-й хромосоме находится ген предшественника амилоида (АРР), чья повышенная экспрессия в итоге может привести к нарушению метаболитических путей амилоида и появлению патологий головного мозга схожих в болезнью Альцгеймера (Lemere CA et al., 1996; Lalowski M et al.1996; Webb RL et аl. 2012). Полная расшифровка всех механизмов нейродегенеративных процессов при СД (с возможной взаимосвязью с болезнью Альцгеймера) до сих пор не проведена.

Одной из проблем на пути изучения данных патологий, является отсутствие корректных моделей данного заболеваний in vitro, на уровне клеточных культур. Получение нейральных стволовых клеток (НСК) для получения нейронов пациентов с СД весьма трудоемкий и этически неоднозначный метод, поскольку зоны нейрогенеза во взрослом организме млекопитающих находятся в субвентрикулярной и субгранулярной зоне гиппокампа, весьма труднодоступной зоне головного мозга, взятие биопсии из которой не представляется возможным.

Альтернативой может стать выделение НСК из фетальных тканей абортусов, однако, в связи с грузом этических проблем и связанных с этим мораторием на использование эмбриональных тканей в большинстве развитых стран мира, это также проблематичная стратегия. Выходом из сложившейся ситуации могут стать методы получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, с последующей дифференцировкой в нейрональном направлении.

Плюрипотентные стволовые клетки являются клетками, обладающими способностью к самообновлению и потенциалом воспроизводить все клеточные типы трех зародышевых листков. До недавнего времени, для исследователей, основным источником плюрипотентных стволовых клеток являлись культуры, полученные из внутриклеточной массы бластоцисты: эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) (Thomson JA et al. 1998).

Однако использование ЭСК сталкивался со многими проблемами, которые исключали их возможное клиническое применение. Основной проблемой являлся этический вопрос, связанный с выделением клеток из эмбрионов человека, поскольку из-за давления общественности во многих развитых странах существует мораторий на использование человеческих эмбрионов в качестве донорского материала. Другой проблемой является сложность получения пациент-специфических плюрипотентных стволовых клеток, поскольку в этом методе для выделения ЭСК используются оплодотворенные бластоцисты с генетическим материалом отличным от генома потенциального пациента.

Определенные успехи были достигнуты в 1997 г., когда удалось репрограммировать соматические клетки посредством переноса содержимого их ядер в ооциты второго деления мейоза (somatic cell nuclear transfer, SCNT) (Wilmut et al., 1997), и в 2001 г. когда удалось достичь подобного результата в результате слияния соматических клеток с ЭСК (Tada et al. 2001). Однако, несмотря на определенную эффективность, которую показали данные методы, их неустранимыми недостатками по-прежнему оставались высокая сложность и низкая воспроизводимость методик и результатов, на что может указывать тот факт, что при помощи данных методик не было получено ни одного приемлемого результата на клетках приматов.

Основываясь на накопленных к тому времени данных, исследователи Takahashi и Yamanaka в 2006 г. предположили, что неоплодотворенная яйцеклетка и ЭСК содержат факторы, которые способствуют тотипотентности или плюрипотентности в соматических клетках. В своих работах на мышиных фибробластах, а затем и на человеческих клетках ученые при помощи лентивирусных трансфекций, вводили в соматические клетки гены различных транскрипицонных факторов, которые, по их мнению, могли бы вызвать репрограммирование (Takahashi et al. 2006, Takahashi et al. 2007). В итоге авторам удалось показать, что эктопическая экспрессия всего четырех определенных транскрипционных факторов Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc (позже названый «каноническим» набором генов KMOS) необходима для дедифференцировки фибробластов в плюрипотентное состояние. Полученные клетки были названы индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (indused pluripotent stem cells, ИПС клетки), а явление дедифференцировки в плюрипотентное состояние - индуцированной плюрипотентностью. Индуцированные плюрипотентные стволовые (ИПС) клетки походили на ЭСК по многим характеристикам, включая профили генной экспрессии, морфологию, экспрессию теломеразы и характер метилирования ДНК и модификации гистонов. Кроме того, ИПС клетки были способны дать начало всем трем зародышевым листкам in vitro и формировали зрелые тератомы после инъекций иммуннодефицитным мышам. Также на основе ИПС клетки удалось получить химерных животных, среди потомства которых были особи, полученные из репрограммированных клеток.

Известен способ получения ИПС клеток, заключающийся в конструировании ретровирусных векторов, содержащих гены различных транскрипицонных факторов Oct4, Sox2, Klf4 и c-Myc (набор репрограммирования KMOS), которые далее были введены в фибробласты кожи человека. Экспрессия данных факторов вызвала репрограммирование фибробластов и появление колоний клеток, морфологически схожих в ЭСК (WO 2007069666, C07K 14/47, опубл. 21.06.2007).

Существенным ограничением известного аналога является использование онкогена c-Myc в составе набора репрограммирования KMOS. Экзогенная сверхэкспрессия этого гена может вызывать активацию генов онкосупрессоров, например Cdkn1a, Cdkn2a, p53, которые вовлечены в различные пути дифференцировки и подавления пролиферации. Использование этого онкогена негативно влияет на возможность применения метода в клинике, поскольку не исключена вероятность реактивации встроенного гена с последующей злокачественной трансформацией репрограммированных клеток (Okita et al. 2008). Показательно, что у химерных мышей, полученных из ИПС клеток с экзогеном c-Myc в приблизительно 15% случаях животные страдали онкологическими заболеваниями (Nakagawa M. et al. 2008).

Известен способ получения ИПС клеток из соматических клеток без использования трансфекции репрограммирующих генов при помощи лентивирусных векторов. Для этого были сконструированы и выделены в чистом виде модифицированные белки репрограммирующих факторов Oct4, Sox2, Nanog. Lin28, c-Myc, способные проникать через клеточную мембрану. Суспензия данных белков была введена в клетки, после чего были получены клоны индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Авторы показали принципиальную возможность такого подхода, который позволяет не использовать вирусные конструкты и избежать риска случайного мутагенеза, приводящего к злокачественной трансформации. (WO 2010115052, С07К 14/47, опубл. 07.10.2010)

К недостаткам данного метода следует отнести очень низкую эффективность метода, по сравнению с методами использования вирусной трансфекции. Так, в лучшем случае, эффективность получения ИПС клеток составляла порядка 0,006% что на 2 порядка ниже, чем в методах с ленти- и ретровирусами. Данный факт, накладывает ограничение на использование метода в клинике, поскольку для получения приемлемого количества клонов ИПС клеток придется наращивать больше клеток для исходной трансфекции, что в конечном итоге приведет к удорожанию процедуры.

Известен способ получения ИПС клеток из фибробластов пациентов с наследственным нейродегенеративным заболеванием Хантингтона, включающий получение и размножение фибробластов, посев указанных фибробластов на лунки плотностью 30% монослоя в среде DMEM+P/S+L-Glu+10% FBS+bFGF 2 нг/мкл, инфицирование клеток при достижении плотности 60% монослоя четырьмя вирусами LeGO-hOct4-MOI 5, LeGO-hSox2-MOI 5, LeGO-hc-Myc-MOI 2.5, LeGO-hKlf4-MOI 5. Через 4 дня клетки пересевают на пластик 1 к 22.5 в среде DMEM+P/S+L-Glu+10% FBS, через день среду меняют на ESmed и культивируют в течение 8-10 дней, при этом среду меняют раз в 2 дня, осуществляют механический пересев 1 к 1 на матригель в среде mTeSRI, осуществляют культивирование до роста колоний, морфологически похожих на ЭСК, через неделю производят отбор клонов (RU. N2458983, C12N 5/02, опубл. 20.08.2012).

Недостатком данного аналога является использование онкогена c-Myc в составе набора репрограммирования KMOS, что негативно влияет на возможность применения метода в клинике, при клеточно-замещающих технологиях.

Наиболее близким аналогом является описанный в международной заявке WO2009061442 способ получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из фибробластов кожи пациентов с синдромом Дауна, заключающийся в выделении фибробластов из кожи пациентов с указанным заболеванием, их культивировании, перепрограммировании при помощи ретровирусной трансфекции в геном фибробластов композиции генов, кодирующих факторы плюрипотентности Oct4, Sox2, Klf4, c-Myc и последующей селекцией индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, соответствующих по ряду основных критериев ЭСК (WO 2009061442, C12N 15/00, опубл. 14.05.2009).

Недостатком ближайшего аналога является использование онкогена c-Myc в составе набора репрограммирования KMOS, что негативно влияет на возможность применения метода в клинике, при клеточно-замещающих технологиях. Также к недостаткам следует отнести низкую эффективность получения клонов репрограммированных клеток.

Таким образом, к сегодняшнему дню проведено большое количество исследований, в которых сообщается о получении человеческих ИПС клеток с помощью различных методов, однако известные методы перепрограммирования имеют крайне низкую эффективность, т.к. как правило, лишь около 1% зрелых клеток поддавалось успешному перепрограммированию в индуцированные плюрипотентные клетки.

Кроме того, полученные ИПС клетки обычно довольно гетерогенны по общему профилю экспрессии генов плюрипотентности, эпигенетическому профилю и морфологии, что не отвечают требованиям биобезопасности и делает их малопригодными для терапевтических целей.

Задачей настоящего изобретения является разработка нового высокоэффективного способа репрограммирования клеток пациентов с синдромом Дауна до плюрипотентного состояния, без использования онкогенов семейства c-Myc, при котором снижается вероятность возникновения онкогенеза и других негативных последствий репрограммирования, а также обеспечивается возможность получения ИПС клеток в достаточном количестве.

Технический результат изобретения заключается в повышении эффективности репрограммирования фибробластов пациентов с синдромом Дауна за счет увеличения выхода гомогенных колоний ИПС клеток, повышения скорости репрограммирования и устранения явлений злокачественной трансформации репрограммированных клеток.

Все указанное позволяет получать пациент-специфические ИПС клетки больных синдромом Дауна для дальнейшего использования в тест-системах скрининга новых лекарств либо для клеточно-замещающих технологий.

Сущность изобретения заключается в следующем: способ получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов с синдромом Дауна, включающий выделение фибробластов из кожи, их культивирование с последующей индукцией перепрограммирования путем ретровирусной трансфекции клеток композицией генов, кодирующих факторы плюрипотентности, и селекцией колоний целевых клеток с морфологией эмбриональных стволовых клеток, отличается тем, что индукцию перепрограммирования осуществляют двумя последовательными циклами: сначала проводят трансфекцию клеток геном каталитического компонента теломеразы hTERT, а затем композицией генов, кодирующих факторы плюрипотнтности Oct4, Sox2, Nanog, при этом после каждого цикла перепрограммирования полученные (трансфицированные) клетки культивируют в течение 14-16 дней в среде, содержащей вальпроевую кислоту в концентрации 0,5-2 мМ, и в условиях гипоксии с содержанием кислорода не более 5%.

Проведение согласно изобретению двух последовательных циклов трансфекции фибробластов, выделенных из кожи пациентов с синдромом Дауна, и культивирование после каждого цикла трансфекции клеток в условиях гипоксии и в присутствии вальпроевой кислоты, содержащейся в милимолярном диапазоне концентраций, в течение 14-16 дней, приводит к более эффективному и ускоренному перепрограммированию клеток. При этом обеспечиваются условия для более эффективного встраивания генов плюрипотентности Oct4, Sox2 и Nanog в фибробласты, что позволило исключить онкоген c-Myc из набора генов репрограммирования, снизить риск онкотрансформации, уменьшить гетерогенность полученной культуры ИСП клеток и увеличить популяцию клеток, нейрональная дифференциация которых идет в требуемом направлении.

При этом, как было впервые установлено заявителем на моделях in vitro, ген каталитического компонента теломеразы hTERT участвует в регуляции экспрессии Oct4, Sox2 и Nanog в условиях гипоксии и в присутствии вальпровой кислоты, и, соответственно, предварительная индукция теломеразной активности при трансфекции гена hTERT может быть использована в качестве инструмента воздействия на увеличение вероятности реактивации экспрессии эндогенных генов поддержания плюрипотентности, при помощи эпигенетических механизмов регуляции экспрессии генов.

Изобретение позволяет за относительно короткий период времени (28-32 суток) получить множество клонов индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов с синдромом Дауна из относительно небольшого количества клеток (порядка 300-450 клонов из 100 тыс. первоначальных клеток пациентов с СД). В дальнейшем полученные плюрипотентные стволовые клетки можно дифференцировать в направлениях трех зародышевых листков (например в нейральном направлении с получением нейронов и глии) и использовать их в качестве in vitro тест-системы для поиска новых лекарственных средств.

Разработанная технология, включающая получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов с синдромом Дауна, является стабильно воспроизводимой и высокоэффективной, позволяющей обеспечить получение целевых клеток. Предложенный авторами способ отличается от известного уровня техники использованием нового набора генов. За счет использования нового набора генов повышается эффективность способа, упрощается процедура получения клонов ИПС клеток, не возникает необходимости использования онкогена с-Мус в составе набора репрограммирующих факторов.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Получение индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов с синдромом Дауна.

Клетки пациента с синдромом Дауна выделяют из биопсии кожи и культивируют в условиях in vitro в среде DMEM+10%FBS. Затем клетки трансфицируют лентивирусной конструкцией с геном каталитического компонента теломеразы hTERT, вызывая тем самым индукцию теломеразной активности. После проверки наличия теломеразной активности, клетки переводят на среду DMEM+10%FBS, содержащую вальпроевую кислоту (VPA) в концентрации 1 мМ, фактор роста фибробластов (bFGF) в концентрации 100 нг/мл, и культивируют в условиях низкого содержания кислорода (5% O₂). Через 14-16 суток клетки одновременно трансфицируют лентивирусными конструкциями с генами Oct4, Sox2, Nanog. Через сутки среду с оставшимися вирусными частицами сливают и наливают свежую среду. Через 9-10 дней культивирования клетки снимают с подложки и пересевают в соотношении 1/4-1/10 на подложку покрытую матригелем. На следующие сутки ростовую среду меняют на полную ростовую среду для эмбриональных стволовых клеток с содержанием вальпроевой кислоты (VPA) в концентрации 1 мМ, и культивируют в течении 14 дней, меняя среду каждые 1-2 суток. Через 7 суток наблюдается рост репрограммированных клеток с морфологией ЭСК. В этот момент вальпроевую кислоту исключают из среды и далее культивируют без нее. После достижения клонами размеров пригодных для выделения (14-16 сутки культивирования) колонии ИПС клеток механическим способом выкалывают с подложки и переносят в индивидуальные лунки 24- или 48- или 96-луночного планшета для дальнейшего наращивания и исследования.

Полученные клоны ИПС клеток имеют следующие характеристики: размер клеток имеют размер порядка 15-25 мкм, большое ядерно-цитоплазматическое отношение, рост в виде компактных колоний с плотными контактами, с хорошо различимой внешней границей колонии. Был проведен анализ кариотипа, было показана трисомия по 21 хромосоме, характерная для синдрома Дауна. Также полученные линии клеток были проанализированы методами иммуноцитохимии на наличие маркеров, характерных для плюрипотентных стволовых клеток - Tra-1-60, Tra-1-81, SSEA3, SSEA4, щелочную фосфотазу.

Пример 2. Получение нейральных стволвоых клеток и их производных из ИПС клеток пациентов с синдромом Дауна для создания тест-систем скрининга лекарственных средств против болезни Альцгеймера.

Полученные по примеру 1 ИПС клетки пациентов с СД рассеяли в новые культуральные чашки Петри ⌀6 см, покрытые матригелем в плотности 10% от монослоя, в среде mTesR1. Затем среду меняют на индукционную нейральную среду следующего состава: DMEM/F12, 2%FBS, пируват Натрия, 15 нг/мл bFGF, 15 нг/мл EGF, добавка N2, добавка В27, ретиноевая кислота 0,1 мкМ, 50 нг/мл Noggin, и инкубировали в ней клетки в течении 7 суток, со сменой среды раз в 2 суток. В течение этого времени колонии ИПС клеток теряли морфологию характерную ЭСК, и приобретали вид розеток, откуда начинался рост клеток с морфологией характерной для нейральных стволовых клеток. Через 7 суток клетки рассевали в соотношении 1/3-1/4 на той же самой среде на чашки Петри без покрытия каким либо белком. Таким образом, клетки пересевали еще 1-2 пассажа, после чего приступали к этапу нейрональной дифференцировки.

Клетки рассевали в лунки 24-лун.планшета, покрытые белком ламинином, в соотношении 10-30 тыс. на одну лунку. На следующий день среду меняли на среду для нейрональной дифференцировки следующего состава: DMEM/F12, пируват Натрия, добавка N2, добавка В27, ретиноевая кислота 0,1 мкМ, 10 нг/мл BDNF, и инкубировали в ней в течении 21 суток, со сменой среды раз в 3-4 суток. В течении этого времени в культуре клеток наблюдалось появление клеток различной морфологии: мелкие вытянутые в виде нейробластов и крупные распластанные в виде астроцитов. По истечении этого времени, через 21 сутки клетки фиксировали, и анализировали степень дифференцировки клеток при помощи иммуноцитохимического окрашивания на Nestin, b-III-tubulin, GFAP, МАРТ - маркеры нейральной дифференцировки. Также клетки окрашивали на наличие внутриклеточных гранул бета-амилоида - белка-маркера нейропаталогических процессов при болезни Альцгеймера. Нами была отмечена значительная разница в окрашивании на бета-амилоид, между клетками, полученными от пациентов с синдромом Дауна и клетками, полученными от здоровых людей. В первом случае специфический сигнал окрашивания был в виде ярких, хорошо различимых гранул в большой доле клеток (порядка 30-50%), то в случае со здоровым контролем окрашивание было тусклым и суспензионным. Гранулы наблюдались лишь в небольшом проценте клеток (порядка 1-3%). Таким образом мы показали, что полученная культура ИПС клеток пациента с синдромом Дауна, может служить в качестве основы для тест-систем скрининга новых лекарственных средств, направленных на ингибирование образования бета-амилоидных бляшек, для лечения болезни Альцгеймера.

Способ получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток пациентов с синдромом Дауна, включающий выделение фибробластов из кожи, их культивирование с последующей индукцией перепрограммирования путем ретровирусной трансфекции клеток композицией генов, кодирующих факторы плюрипотентности, и селекцией колоний целевых клеток с морфологией эмбриональных стволовых клеток, отличающийся тем, что индукцию перепрограммирования осуществляют двумя последовательными циклами: сначала проводят трансфекцию клеток геном каталитического компонента теломеразы hTERT, а затем композицией генов, кодирующих факторы плюрипотентности Oct4, Sox2, Nanog, при этом после каждого цикла перепрограммирования полученные (трансфицированные) клетки культивируют в течение 14-16 дней в среде, содержащей вальпроевую кислоту в концентрации 0,5-2 мМ, и в условиях гипоксии с содержанием кислорода не более 5%.