Понижающая регуляция экспрессии гена с помощью искусственных микрорнк

Понижающая регуляция экспрессии гена с помощью искусственных микрорнк

Иллюстрации

Показать все

Реферат

По данной заявке испрашивается приоритет предварительной заявки на патент США № 61/014510, поданной 18 декабря 2007 г., раскрытие которой полностью включено посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Область по данному изобретению касается, в целом, молекулярной биологии растений. В частности, она касается конструкций и способов для понижающей регуляции экспрессии последовательностей-мишеней.

ПРЕДПОСЫЛКИ

МикроРНК (миРНК) были впервые идентифицированы лишь несколько лет назад, но уже стало ясно, что они играют важную роль в регулировании генной активности. Эти некодирующие РНК из 20-22 нуклеотидов обладают способностью гибридизоваться посредством спаривания оснований со специфическими мРНК-мишенями и подавлять экспрессию этих транскриптов, опосредуя или РНК-расщепление или трансляционную репрессию.

Последние исследования показали, что миРНК обладают важными функциями при развитии. В растениях, как показали, они контролируют ряд процессов развития, включающих период цветения, морфологию листа, полярность органов, морфологию цветка и развитие корня (рассмотрено Mallory и Vaucheret (2006) Nat Genet 38: S31-36). С учетом установленной регуляторной роли миРНК вполне вероятно, что они также вовлечены в контроль некоторых из основных признаков культур, таких как засухоустойчивость и устойчивость к болезням.

МиРНК транскрибируются РНК полимеразой II как полиаденилированные и кэппированные сигналы, известные как прай-миРНК (первичная миРНК pri-miRNA). Такие прай-миРНК процессируются до более мелких транскриптов, известных как пре-миРНК (pre-miRNA), и такие предшественники обладают способностью формировать стабильные шпилечные структуры (рассмотрено Bartel (2004) Cell 116: 281-297; Jones-Rhoades MW, Bartel DP, Bartel B. MicroRNAS and their regulatory roles in plants. Annu Rev Plant Biol. 2006;57:19-53). Несмотря на то, что прай-миРНК процессируются до пре-миРНК с помощью Drosha в ядре, и Dicer расщепляет пре-миРНК в цитоплазме многоклеточных, созревание миРНК в растениях отличается от пути метаболизма у животных, поскольку растения лишены гомолога Drosha. Вместо этого фермент РНКаза III DICER-LIKE 1 (DCL1), который гомологичен животному Dicer, может обладать функцией Drosha в дополнение к его известной функции в шпилечном процессинге (Kurihara и Watanabe (2004) Proc Natl Acad Sci 101: 12753-12758).

В Arabidopsis недавно были описаны искусственные миРНК (имиРНК, amiRNA), нацеленные на вирусные мРНК последовательности (Niu et al. (2006) Nature Biotechnology 24:1420-1428) или на эндогенные гены (Schwab et al. (2006) Plant Cell 18:1121-1133). Конструкция имиРНК может быть экспрессирована под контролем различных промоторов для изменения пространственного характера сайленсинга (Schwab et al. (2006) Plant Cell 18:1121-1133). Искусственные миРНК заменяют микроРНК и комплементарную ей последовательность, отмеченную штрихом, в предшественнике миРНК и замещают последовательности, которые нацелены на мРНК, подлежащую сайленсингу. Сайленсинг эндогенными миРНК можно обнаружить в ряде пространственных, временных и связанных с развитием паттернов экспрессии (Parizotto et al. (2007) Genes Dev 18:2237-2242; Alvarez et al. (2006) Plant Cell 18:1134-51). Искусственные миРНК можно сконструировать как для захвата, так и для расширения разнообразия и специфичности в паттернах сайленсинга. До сих пор не сообщалось о применении имиРНК в культурных растениях.

WO 2004/009779, опубликованная 29 января 2004 г., раскрывает композиции и способы модулирования экспрессии генов в растениях.

Заявка на патент США 2005/0138689 правопреемника заявителя, опубликованная 23 июня 2005 г., описывает миРНК и их применение в сайленсинге последовательности-мишени.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СПИСКА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Данное изобретение можно более полно понять из следующего подробного описания и сопровождающего Списка последовательностей, который составляет часть данной заявки.

Описания последовательностей резюмируют Список последовательностей, приложенный к настоящему документу. Список последовательностей включает однобуквенные коды символов нуклеотидных последовательностей и одно- и трехбуквенные коды для аминокислот, как определено в стандартах IUPAC-IUB, раскрытых в Nucleic Acids Research 13:3021-3030 (1985) и в Biochemical Journal 219(2):345-373 (1984).

SEQ ID NO:1-10 соответствуют праймерам, используемым для амплификации предшественников геномной микроРНК (миРНК) маиса.

SEQ ID NO:11-15 соответствуют последовательностям предшественника миРНК маиса для 159c, 164h, 168a, 169r и 396h, соответственно.

SEQ ID NO:16 соответствуют последовательности искусственной миРНК (имиРНК), используемой для сайленсинга транскрипта фитоен-десатуразы маиса (PDS).

SEQ ID NO:17-21 соответствуют ”последовательностям, отмеченным штрихом”, содержащимся в предшественниках имиРНК для 159c-PDS, 164h-PDS, 168a-PDS, 169r-PDS и 396h-PDS, соответственно. Последовательности, отмеченные штрихом, являются в основном комплементарными последовательностями в предшественнике миРНК, который формирует дуплекс с миРНК.

SEQ ID NO:22-26 соответствуют предшественникам имиРНК для 159c-PDS, 164h-PDS, 168a-PDS, 169r-PDS и 396h-PDS, соответственно. Эти предшественники, в случае если экспрессируются в маисе, управляют сайленсингом эндогенного транскрипта PDS.

SEQ ID NO:27-30 соответствуют усеченным предшественникам имиРНК 169r-PDS-sht, 169r-PDS-med, 396h-PDS-sht и 396-PDS-med, соответственно. 169r-PDS предшественник (SEQ ID NO:25) был укорочен до 11% его длины (169r-PDS-sht, SEQ ID NO:27) и 35% его длины (169r-PDS-med, SEQ ID NO:28) по сравнению с 169r-PDS. 396h-PDS предшественник (SEQ ID NO:26) был укорочен до 18% его длины (396h-PDS-sht, SEQ ID NO:29) и 46% его длины (396h-PDS-med, SEQ ID NO:30) по сравнению с 396h-PDS. Все из усеченных предшественников содержали миРНК и последовательности, отмеченные штрихом.

SEQ ID NO:31-34 соответствуют предшественникам имиРНК для 159c-FAD, 168a-FAD, 169r-FAD и 396h-FAD, соответственно. Эти предшественники, в случае если экспрессируются в маисе, управляют сайленсингом эндогенного fad2-1 (десатураза жирной кислоты, отвечающая за превращение олеиновой кислоты в линолевую кислоту) транскрипта.

SEQ ID NO:35-38 соответствуют миРНК-мишени и последовательностям, отмеченным штрихом, для летальной пятнистости листьев.

SEQ ID NO:39-41 соответствуют миРНК-мишени и последовательностям, отмеченным штрихом, для белка устойчивости к нескольким лекарственным средствам, который является транспортным белком.

SEQ ID NO:42-43 соответствуют последовательностям предшественников имиРНК для 168a-MRP и 396h-MRP, соответственно. Эти предшественники, в случае если экспрессируются в маисе, управляют сайленсингом MRP, что приводит к пониженным уровням фитиновой кислоты.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Данное изобретение относится к выделенному фрагменту нуклеиновой кислоты, включающему предшественник миРНК, причем указанный предшественник миРНК по существу соответствует дезоксирибонуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:11, (i) где нуклеотиды 430-450 в SEQ ID NO:11 замещены первой вариабельной нуклеотидной субпоследовательностью, размер которой варьирует от примерно 19 до примерно 30 нуклеотидов в зависимости от последовательности-мишени, экспрессия которой подлежит понижению, и (ii) кроме того, где нуклеотиды 244-264 в SEQ ID NO:11 замещены второй вариабельной нуклеотидной субпоследовательностью, размер которой варьирует от примерно 19 до примерно 30 нуклеотидов, причем указанная вторая вариабельная нуклеотидная субпоследовательность способна гибридизоваться с первой вариабельной субпоследовательностью предшественника миРНК.

Другие выделенные фрагменты нуклеиновых кислот, которые также представляют интерес, включают следующее:

a) выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты, включающий предшественник миРНК, причем указанный предшественник миРНК по существу соответствует дезоксирибонуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:12, (i) где нуклеотиды 94-114 в SEQ ID NO:12 замещены первой вариабельной нуклеотидной субпоследовательностью, размер которой варьирует от примерно 19 до примерно 30 нуклеотидов в зависимости от последовательности-мишени, экспрессия которой подлежит понижению, и (ii) кроме того, где нуклеотиды 163-183 в SEQ ID NO:12 замещены второй вариабельной нуклеотидной субпоследовательностью, размер которой варьирует от примерно 19 до примерно 30 нуклеотидов, причем указанная вторая вариабельная нуклеотидная субпоследовательность способна гибридизоваться с первой вариабельной субпоследовательностью предшественника миРНК;

b) выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты, включающий предшественник миРНК, причем указанный предшественник миРНК по существу соответствует дезоксирибонуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:13, (i) где нуклеотиды 53-73 в SEQ ID NO:13 замещены первой вариабельной нуклеотидной субпоследовательностью, размер которой варьирует от примерно 19 до примерно 30 нуклеотидов в зависимости от последовательности-мишени, экспрессия которой подлежит понижению, и (ii) кроме того, где нуклеотиды 97-117 в SEQ ID NO:13 замещены второй вариабельной нуклеотидной субпоследовательностью, размер которой варьирует от примерно 19 до примерно 30 нуклеотидов, причем указанная вторая вариабельная нуклеотидная субпоследовательность способна гибридизоваться с первой вариабельной субпоследовательностью предшественника миРНК;

c) выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты, включающий предшественник миРНК, причем указанный предшественник миРНК по существу соответствует дезоксирибонуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:14, (i) где нуклеотиды 110-130 в SEQ ID NO:14 замещены первой вариабельной нуклеотидной субпоследовательностью, размер которой варьирует от примерно 19 до примерно 30 нуклеотидов в зависимости от последовательности-мишени, экспрессия которой подлежит понижению, и (ii) кроме того, где нуклеотиды 184-203 в SEQ ID NO:14 замещены второй вариабельной нуклеотидной субпоследовательностью, размер которой варьирует от примерно 19 до примерно 30 нуклеотидов, причем указанная вторая вариабельная нуклеотидная субпоследовательность способна гибридизоваться с первой вариабельной субпоследовательностью предшественника миРНК; и

d) выделенный фрагмент нуклеиновой кислоты, включающий предшественник миРНК, причем указанный предшественник миРНК по существу соответствует дезоксирибонуклеотидной последовательности, изложенной в SEQ ID NO:15, (i) где нуклеотиды 83-103 в SEQ ID NO:15 замещены первой вариабельной нуклеотидной субпоследовательностью, размер которой варьирует от примерно 19 до примерно 30 нуклеотидов в зависимости от последовательности-мишени, экспрессия которой подлежит понижению, и (ii) кроме того, где нуклеотиды 172-192 в SEQ ID NO:15 замещены второй вариабельной нуклеотидной субпоследовательностью, размер которой варьирует от примерно 19 до примерно 30 нуклеотидов, причем указанная вторая вариабельная нуклеотидная субпоследовательность способна гибридизоваться с первой вариабельной субпоследовательностью предшественника миРНК.

Любой из этих выделенных фрагментов нуклеиновой кислоты может быть использован для создания рекомбинантной конструкции, включающей эти выделенные фрагменты нуклеиновой кислоты, функционально связанные, по меньшей мере, с одной регуляторной последовательностью.

Эти конструкции могут быть трансформированы в растительную клетку так, что трансформированная растительная клетка будет включать рекомбинантную конструкцию в своем геноме.

В другом аспекте данное изобретение относится к способу понижения экспрессии гена-мишени в растительной клетке, включающему:

(a) трансформацию, по меньшей мере, одной растительной клетки конструкцией нуклеиновой кислоты, включающей любой из выделенных фрагментов нуклеиновой кислоты, описанных в данном документе; и

(b) отбор той трансформированной растительной клетки (клеток), у которой уровень экспрессии последовательности-мишени понижен по сравнению с уровнем экспрессии гена-мишени в растительной клетке дикого типа.

ДЕТАЛЬНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Информацию, соответствующую данной заявке, можно найти в заявках на патенты США №№ 10/963238 и 10/963394, поданные 12 октября 2004 г. Полные содержания вышеуказанных заявок включены в данный документ путем ссылки.

Другие ссылки, которые можно использовать для понимания данного изобретения, включают заявку на патент США № 10/883374, поданную 1 июля 2004 г.; заявку на патент США № 10/913288, поданную 6 августа 2004 г., и заявку на патент США № 11/334776, поданную 6 января 2006 г.

Раскрытие каждой ссылки, изложенной в данном документе, настоящим включено ссылкой во всей своей полноте.

В данном документе и в приложенной Формуле изобретения формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если в контексте четко не диктуется иное. Таким образом, например, ссылка на "растение" включает множество таких растений, ссылка на "клетку" включает одну или более клеток и их эквивалентов, известных специалисту в данной области, и т.д.

В контексте данного раскрытия используется ряд выражений и аббревиатур. Представлены следующие определения.

“МикроРНК или миРНК” означает олигорибонуклеиновую кислоту, которая регулирует экспрессию полинуклеотида, включающего последовательность-мишень. МикроРНК (миРНК) являются некодирующими РНК длиной от примерно 19 до примерно 24 нуклеотидов (нк), которые идентифицированы и у животных, и у растений (Lagos-Quintana et al., Science 294:853-858 2001, Lagos-Quintana et al., Curr. Biol. 12:735-739 2002; Lau et al., Science 294:858-862 2001; Lee и Ambros, Science 294:862-864 2001; Llave et al., Plant Cell 14:1605-1619 2002; Mourelatos et al., Genes. Dev. 16:720-728 2002; Park et al., Curr. Biol. 12:1484-1495 2002; Reinhart et al., Genes. Dev. 16:1616-1626 2002), которые регулируют экспрессию полинуклеотида, включающего последовательность-мишень. Они получены из более длинных предшественников транскриптов, размер которых варьирует от приблизительно 70 до 2000 нуклеотидов или более, и эти предшественники транскрипты обладают способностью формировать стабильные шпилечные структуры. У животных фермент, вовлеченный в процессинг предшественников миРНК, называют Dicer, РНКаза III-подобный белок (Grishok et al., Cell 106:23-34 2001; Hutvagner et al., Science 293:834-838 2001; Ketting et al., Genes. Dev. 15:2654-2659 2001). Растения также имеют Dicer-подобный фермент, DCL1 (ранее названный CARPEL FACTORY/SHORT INTEGUMENTS1/ SUSPENSOR1), и недавние сведения показывают, что он, подобно Dicer, вовлечен в процессинг шпилечных предшественников для образования зрелых миРНК (Park et al., Curr. Biol. 12:1484-1495 2002; Reinhart et al., Genes. Dev. 16:1616-1626 2002). Кроме того, из последней работы становится ясно, что, по меньшей мере, некоторые шпилечные предшественники миРНК образуются как более длинные полиаденилированные транскрипты, а несколько различных миРНК и связанных шпилек могут присутствовать в одном транскрипте (Lagos-Quintana et al., Science 294:853-858 2001; Lee et al., EMBO J 21:4663-4670 2002). В последней работе также рассматривали выбор цепи миРНК из продукта двухцепочечной РНК, происходящего от процессинга шпильки с помощью DICER (Schwartz et al., 2003, Cell 115:199-208). Похоже, что стабильность (т.e. содержание G:C против A:U и/или ошибочные спаривания) двух концов процессированной двухцепочечной РНК влияет на выбор цепи, при этом конец низкой стабильности легче раскручивается геликазной активностью. Цепь с 5' концом на конце с низкой стабильностью включается в RISC комплекс, в то время как другая цепь распадается.

“Прай-миРНК” или “первичные миРНК” являются длинными полиаденилированными РНК, которые транскрибируются РНК полимеразой II и кодируют миРНК. “Пре-миРНК” являются первичными миРНК, которые процессированы с образованием более короткой последовательности, обладающей способностью формировать стабильную шпильку, и далее процессированы для высвобождения миРНК. В растениях оба этапа процессинга выполняются ферментом, подобным dicer, и поэтому трудно функционально дифференцировать “прай-миРНК” и “пре-миРНК”. Поэтому предшественник миРНК или первичная миРНК функционально определена в данном документе как нуклеотидная последовательность, которая способна продуцировать миРНК. Учитывая данное функциональное определение, и как будет ясно из Примеров и обсуждения в данном документе, предшественник миРНК, первичная миРНК и/или миРНК по данному изобретению можно представить как рибонуклеиновую кислоту или, альтернативно, в форме дезоксирибонуклеиновой кислоты, которая “по существу соответствует ” предшественнику миРНК, первичной миРНК и/или миРНК. Понятно, что ДНК в своей двухцепочечной форме будет включать цепь, которая способна быть транскрибированной в описанный предшественник миРНК. Описаны экспрессирующие конструкции, рекомбинантные ДНК-конструкции и трансгенные организмы, включающие миРНК кодирующую ДНК, которые приводят к экспрессии описанных предшественников миРНК.

“Вариабельная нуклеотидная субпоследовательность” означает часть нуклеотидной последовательности, которая заменяет часть пре-миРНК последовательности при условии, что эта субпоследовательность отличается от последовательности, которую замещают, т.e. не может быть той же последовательностью.

“Ген-мишень” означает ген, который кодирует РНК-мишень, т.e. ген, из которого РНК-мишень транскрибируется. Ген может кодировать мРНК, тРНК, малую РНК и т.д.

“Последовательность-мишень” означает РНК, экспрессия которой подлежит модулированию, например понижающему регулированию. Последовательность-мишень может быть частью открытой рамки считывания, 5' или 3' нетранслируемым участком, экзоном(экзонами), интроном(интронами), фланкирующим участком и т.д.

“Последовательность, отмеченная штрихом” представляет собой комплементарную последовательность в предшественнике миРНК, который формирует дуплекс с миРНК. Комплементарность последовательности, отмеченной штрихом, не должна быть совершенной. Иногда встречаются неспиральные разрывающие замещения (т.е. G:T пары оснований и т.д.), а также 1-3 ошибочные спаривания.

Выражение "геном" означает следующее: (1) полный комплемент генетического материала (гены и некодирующие последовательности), присутствующего в каждой клетке организма, или в вирусе, или в органелле; (2) целый набор хромосом, наследованный как (гаплоидная) единица от одного родителя.

"Потомство" включает любое последующее поколение растения. Потомство будет наследовать и стабильно сегрегировать гены и трансгены от своего родительского растения (растений).

Единицы, приставки и символы могут быть выражены в приемлемой форме СИ (международная система единиц). Если не указано иное, нуклеиновые кислоты пишутся слева направо в 5'-3' ориентации; аминокислотные последовательности пишутся слева направо в ориентации амино-карбоксил, соответственно. Числовые диапазоны, перечисляемые в спецификации, охватывают числа, определяющие диапазон, и включают каждое целое число в определенном диапазоне. Аминокислоты могут быть обозначены в данном документе либо общеизвестными трехбуквенными символами, либо однобуквенными символами, рекомендованными Комиссией по биохимической номенклатуре IUPAC-IUB. Нуклеотиды аналогичным образом могут быть обозначены их общепринятыми однобуквенными кодами. Если иное не предусмотрено, выражения программного обеспечения, электрические и электроники, используемые в данном документе, определены в The New IEEE Standard Dictionary of Electrical and Electronics Terms (5^th edition, 1993). Выражения, определенные ниже, более полно определены ссылкой на спецификацию в целом.

Выражения “рекомбинантная конструкция”, “конструкция экспрессии”, “химерная конструкция”, “конструкция” и “рекомбинантная ДНК-конструкция” используются в данном документе взаимозаменяемо. Рекомбинантная конструкция включает искусственную комбинацию фрагментов нуклеиновой кислоты, например регуляторные и кодирующие последовательности, которые не обнаруживаются вместе в природе. Например, химерная конструкция может включать регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, которые происходят из различных источников, или регуляторные последовательности и кодирующие последовательности, происходящие из одного и того же источника, но расположены способом, отличным от встречающегося в природе. Такая конструкция может быть использована отдельно или может быть использована в соединении с вектором. Если используется вектор, то выбор вектора зависит от способа, который будет использоваться для трансформации клеток-хозяев, как хорошо известно специалисту в данной области. Например, может использоваться плазмидный вектор. Специалисту хорошо известны генетические элементы, которые должны присутствовать в векторе для успешной трансформации, селекции и размножения клеток-хозяев, включающих какой-либо из выделенных фрагментов нуклеиновой кислоты по данному изобретению. Специалист также признает, что различные независимые события трансформации приведут к различным уровням и паттернам экспрессии (Jones et al., EMBO J. 4:2411-2418 (1985); De Almeida et al., Mol. Gen. Genetics 218:78-86 (1989)) и таким образом, что множественные события должны быть подвергнуты скринингу для получения линий, отображающих желаемые уровень и паттерн экспрессии. Такой скрининг среди прочих можно выполнять саузерн анализом ДНК, нозерн анализом мРНК экспрессии, анализом иммуноблоттинга белковой экспрессии или фенотипическим анализом.

Такая конструкция может включать любую комбинацию дезоксирибонуклеотидов, рибонуклеотидов и/или модифицированных нуклеотидов. Конструкция может транскрибироваться с образованием РНК, где РНК может быть способной формировать двухцепочечную РНК и/или шпилечную структуру. Такая конструкция может быть экспрессирована в клетке, или выделена, или получена синтетически. Конструкция может дополнительно включать промотор или другие последовательности, которые облегчают манипуляцию или экспрессию конструкции.

В данном документе “супрессия”, или “сайленсинг”, или “ингибирование” используются взаимозаменяемо для обозначения понижающей регуляции экспрессии продукта последовательности-мишени относительно ее нормального уровня экспрессии в организме дикого типа. Супрессия включает экспрессию, которая уменьшается на примерно 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% относительно уровня экспрессии дикого типа.

В данном документе “кодирует” или “кодирующая” означает ДНК последовательность, которая может быть процессирована с образованием РНК и/или полипептида.

В данном документе “экспрессия” или “экспрессирование” означает продуцирование функционального продукта, например образование РНК транскрипта из введенной конструкции, эндогенной ДНК последовательности или стабильно включенной гетерологичной ДНК последовательности. Выражение также может означать полипептид, полученный от мРНК, образованной из любого из вышеупомянутых предшественников ДНК. Таким образом, экспрессия фрагмента нуклеиновой кислоты может означать транскрипцию фрагмента нуклеиновой кислоты (например, транскрипция, приводящая к мРНК или другой функциональной РНК) и/или трансляцию РНК в предшественник или зрелый белок (полипептид).

В данном документе "гетерологичная" по отношению к последовательности означает последовательность, которая происходит от чужеродных видов, или, если от одних и тех же видов, является по существу модифицированной преднамеренным вмешательством человека от ее нативной формы в композиции и/или геномном локусе. Например, по отношению к нуклеиновой кислоте это может быть нуклеиновая кислота, которая происходит от чужеродных видов, или сконструирована синтетически, или если от одних и тех же видов является по существу модифицированным преднамеренным вмешательством человека от ее нативной формы в композиции и/или геномном локусе. Гетерологичный белок может происходить от чужеродных видов или, если от одних и тех же видов, является по существу модифицированным преднамеренным вмешательством человека от своей первоначальной формы.

Выражение "клетка-хозяин" означает клетку, которая включает или в которую введена конструкция нуклеиновой кислоты и которая поддерживает репликацию и/или экспрессию конструкции. Клетки-хозяева могут быть прокариотическими клетками, такими как E. coli, или эукариотическими клетками, такими как клетки грибов, дрожжей, насекомого, амфибии, нематоды или млекопитающего. Альтернативно, клетки-хозяева являются растительными клетками однодольных или двудольных растений. Примером клетки-хозяина однодольного растения является клетка-хозяин маиса.

“Растение" включает ссылку на целые растения, органы растений, ткани растений, семена и растительные клетки и их потомство. Растительные клетки включают, без ограничения, клетки из семян, суспензионных культур, зародышей, меристематических областей, каллюсной ткани, листьев, корней, побегов, гаметофитов, спорофитов, пыльцы и микроспор.

Выражение “растительные части” включает дифференцированные и недифференцированные ткани, включающие, но без ограничения, следующее: корни, стебли, побеги, листья, пыльца, семена, опухолевую ткань и различные формы клеток и культуру (например, отдельные клетки, протопласты, зародыши и каллюсная ткань). Растительная ткань может быть в растении или в органе растения, тканевой или клеточной культуре.

Выражение "орган растения" означает растительную ткань или группу тканей, которая составляет морфологически и функционально отдельную часть растения.

Выражение “введенный” означает доставку нуклеиновой кислоты (например, экспрессирующей конструкции) или белка в клетку. Введенный включает ссылку на включение нуклеиновой кислоты в эукариотическую или прокариотическую клетку, где нуклеиновая кислота может быть включена в геном клетки, и включает ссылку на транзиторное обеспечение клетки нуклеиновой кислотой или белком. Введенный включает ссылку на способы стабильной или транзиторной трансформации, а также половое скрещивание. Таким образом, “введенный” в контексте вставки фрагмента нуклеиновой кислоты (например, рекомбинантная ДНК-конструкция /экспрессирующая конструкция) в клетку означает “трансфекцию”, или “трансформацию”, или “трансдукцию” и включает ссылку на включение фрагмента нуклеиновой кислоты в эукариотическую или прокариотическую клетку, где фрагмент нуклеиновой кислоты может быть включен в геном клетки (например, хромосомная, плазмидная, пластидная или митохондриальная ДНК), превращен в автономный репликон или транзиторно экспрессированный (например, трансфицированная мРНК).

Выражение “геном”, как оно применяется для растительных клеток, охватывает не только хромосомную ДНК, обнаруженную в ядре, но и ДНК органелл, обнаруженную в субклеточных компонентах (например, митохондриальную, пластидную) клетки.

Выражение "выделенный" означает материал, такой как нуклеиновая кислота или белок, который является: (1) по существу или существенно не содержащим компоненты, которые обычно сопровождают или взаимодействуют с материалом, как его обнаруживают в его естественной среде, или (2) если материал в своей естественной среде, материалом, который изменен преднамеренным вмешательством человека в композицию и/или помещен в локус в клетке, отличного от локуса, нативного данному материалу.

В данном документе “домен” или “функциональный домен” означает последовательность (последовательности) нуклеиновой кислоты, которая способна вызывать биологический ответ в растениях. Данное изобретение касается миРНК, состоящей из, по меньшей мере, 21 нуклеотидной последовательности, действующей либо отдельно либо вместе с другими миРНК последовательностями, поэтому домен может означать или отдельные миРНК, или группы миРНК. Также миРНК последовательности, связанные с их последовательностями остова, можно считать доменами, используемыми для процессинга миРНК в ее активной форме. В данном документе “субдомены” или “функциональные субдомены” означают субпоследовательности доменов, которые способны вызывать биологический ответ в растениях. МиРНК можно считать субдоменом последовательности остова. “Смежные” последовательности или домены означают последовательности, которые последовательно связаны без добавленных нуклеотидов, находящихся между доменами. Пример цепи смежного домена обнаружен в SEQ ID NO:7957, который представляет SEQ ID NO: 1-2652 как непрерывную цепь, которая может быть представлена как 2652 миРНК последовательности, связанные вместе в последовательное соединение в виде цепочки.

РНК интерференция означает процесс специфического по последовательности пост-транскрипционного генного сайленсинга у животных, опосредованного короткими интерферирующими РНК (киРНК) (Fire et al., Nature 391:806 1998). Соответствующий процесс у растений обычно называют пост-транскрипционным генным сайленсингом (PTGS) или РНК сайленсингом, а также называют подавлением в грибах. Процесс пост-транскрипционного генного сайленсинга считается эволюционно-консервативным клеточным защитным механизмом, используемым для предотвращения экспрессии чужеродных генов, и обычно совместно используется разнообразной флорой и таксономическими типами (Fire et al., Trends Genet. 15:358 1999). Такая защита от экспрессии чужеродных генов могла развиться в ответ на продуцирование двухцепочечных РНК (днРНК), полученных от вирусной инфекции или от случайной интеграции транспозонных элементов в геном хозяина, путем клеточного ответа, который специфически разрушает гомологичную одноцепочечную РНК вирусной геномной РНК. Присутствие двухцепочечной РНК в клетках вызывает ответ РНК-интерференции через механизм, который полностью еще не охарактеризован.

Присутствие длинных днРНК в клетках стимулирует активность фермента рибонуклеаза III, названного “dicer”. Dicer вовлечен в процессинг днРНК до коротких кусков днРНК, известных как короткие интерферирующие РНК (киРНК) (Berstein et al., Nature 409:363 2001), и/или пре-миРНК в миРНК. Короткие интерферирующие РНК, полученные в результате активности dicer, обычно имеют длину от примерно 21 до примерно 23 нуклеотидов и включают дуплексы из примерно 19 пар оснований (Elbashir et al., Genes Dev. 15:188 2001). Dicer также причастен к вырезанию 21- и 22-нуклеотидных малых временных РНК (мвРНК) из РНК-предшественника консервативной структуры, которые вовлечены в трансляционный контроль (Hutvagner et al., 2001, Science 293:834). Ответ РНК-интерференции также характеризует эндонуклеазный комплекс, который обычно называют комплекс РНК-индуцированного сайленсинга (RISC), который опосредует расщепление одноцепочечной РНК, имеющей комплементарность последовательности к антисмысловой цепи дуплекса киРНК. Расщепление РНК-мишени происходит в середине участка, комплементарного антисмысловой цепи дуплекса киРНК (Elbashir et al., Genes Dev. 15:188 2001). Кроме того, РНК интерференция также может включать опосредованный малой РНК (например, микроРНК или миРНК) генный сайленсинг, вероятно, через клеточные механизмы, которые регулируют хроматиновую структуру и тем самым предотвращают транскрипцию генных последовательностей-мишеней (см., например, Allshire, Science 297:1818-1819 2002; Volpe et al., Science 297:1833-1837 2002; Jenuwein, Science 297:2215-2218 2002; и Hall et al., Science 297:2232-2237 2002). Таким образом, молекулы миРНК по данному изобретению можно использовать для опосредования генного сайленсинга через взаимодействие с РНК транскриптами или иначе взаимодействием с конкретными генными последовательностями, где такое взаимодействие приводит к генному сайленсингу или на транскрипционном или на пост-транскрипционном уровне.

РНК-интерференция исследована на ряде систем. Fire et al. (Nature 391:806 1998) первыми наблюдали РНК-интерференцию у C. elegans. Wianny и Goetz (Nature Cell Biol. 2:70 1999) описывают РНК-интерференцию, опосредованную двухцепочечной РНК в зародышах мышей. Hammond et al. (Nature 404:293 2000) описывают РНК-интерференцию в клетках Drosophila, трансфицированных двухцепочечной РНК. Elbashir et al. (Nature 411:494 2001) описывают РНК-интерференцию, индуцированную введением дуплексов синтетических 21-нуклеотидных РНК в культивируемых клетках млекопитающего, включая первичную почку человека и HeLa клетки.

Малые РНК играют важную роль в регуляции экспрессии гена. Регуляция многих связанных с развитием процессов, включая цветение, контролируется малыми РНК. Теперь можно конструировать изменения в генной экспрессии растительных генов путем использования трансгенных конструкций, которые продуцируют малые РНК в растении.

Малые РНК, как оказывается, функционируют спариванием оснований с комплементарной РНК или ДНК последовательностями-мишенями. При связывании с РНК малые РНК запускают или расщепление РНК, или трансляционное ингибирование последовательности-мишени. При связывании с ДНК последовательностями-мишенями считается, что малые РНК могут опосредовать ДНК метилирование последовательности-мишени. Следствием этих событий независимо от специфического механизма является то, что ингибируется генная экспрессия.

МикроРНК (миРНК) являются некодирующими РНК длиной от примерно 19 до примерно 24 нуклеотидов (нт), которые идентифицированы и у животных, и у растений (Lagos-Quintana et al., Science 294:853-858 2001, Lagos-Quintana et al., Curr. Biol. 12:735-739 2002; Lau et al., Science 294:858-862 2001; Lee и Ambros, Science 294:862-864 2001; Llave et al., Plant Cell 14:1605-1619 2002; Mourelatos et al., Genes. Dev. 16:720-728 2002; Park et al., Curr. Biol. 12:1484-1495 2002; Reinhart et al., Genes. Dev. 16:1616-1626 2002). Они получены из более длинных транскриптов-предшественников, размер которых варьирует от приблизительно 70 до 200 нт, и эти транскрипты-предшественники обладают способностью формировать стабильные шпилечные структуры. У животных фермент, вовлеченный в процессинг предшественников миРНК, называют Dicer, РНКаза III-подобный белок (Grishok et al., Cell 106:23-34 2001; Hutvagner et al., Science 293:834-838 2001; Ketting et al., Genes. Dev. 15:2654-2659 2001). У растений также есть Dicer-подобный фермент, DCL1 (ранее называемый CARPEL FACTORY/SHORT INTEGUMENTS1/ SUSPENSOR1), и последние данные показывают, что он, подобно Dicer, вовлечен в процессинг шпилечных предшественников для образования зрелых миРНК (Park et al., Curr. Biol. 12:1484-1495 2002; Reinhart et al., Genes. Dev. 16:1616-1626 2002). Кроме того, из последней работы становится ясно, что, по меньшей мере, некоторые шпилечные предшественники миРНК образуются как более длинные полиаденилированные транскрипты, и некоторые другие миРНК и связанные шпильки могут присутствовать в отдельном транскрипте (Lagos-Quintana et al., Science 294:853-858 2001; Lee et al., EMBO J 21:4663-4670 2002). Последняя работа также рассматривала выбор цепи миРНК от продукта двухцепочечной РНК, происходящего от процессинга шпильки с помощью DICER (Schwartz et al., 2003, Cell 115:199-208). Становится ясно, что стабильность (т.е. содержание G:C против A:U и/или ошибочные спаривания) двух концов процессированной двухцепочечной РНК влияет на выбор цепи, при этом конец с низкой стабильностью легче раскрутить геликазной активностью. Цепь с 5' концом низкой стабильности включена в RISC комплекс, тогда как другая цепь распадается.

У животных существуют прямые доказательства роли специфических миРНК в развитии. Обнаружили, что lin-4 и let-7 миРНК у C. elegans контролируют временное развитие на основе фенотипов, полученных при мутировании генов, продуцирующих lin-4 и let-7 миРНК (Lee et al., Cell 75:843-854 1993; Reinhart et al., Nature 403-901-906 2000). Кроме того, обе миРНК отображают временной паттерн экспрессии в соответствии с их ролями во временном паттерне развития. Другие животные миРНК отображают регулируемые развитием паттерны экспрессии как временные, так и специфические для ткани (Lagos-Quintana et al., Science 294:853-853 2001, Lagos-Quintana et al., Curr. Biol. 12:735-739 2002; Lau et al., Science 294:858-862 2001; Lee и Ambros, Science 294:862-864 2001), что привело к гипотезе, что миРНК могут быть во многих случаях вовлечены в регуляцию важных процессов развития. Кроме того, в растениях дифференциальные паттерны экспрессии многих миРНК предполагают роль в развитии (Llave et al., Plant Cell 14:1605-1619 2002; Park et al., Curr. Biol. 12:1484-1495 2002; Reinhart et al., Genes. Dev. 16:1616-1626 2002). Тем не менее, роль в развитии для миРНК непосредственно не доказана в растениях, поскольку до настоящего времени не было никаких сообщений об относящемся к развитию фенотипе, связанном со специфической растительной миРНК.

По-видимому, миРНК регулируют гены-мишени связыванием с комплементарными последовательностями, расположенными в транскриптах, которые продуцируются этими генами. В случае lin-4 и let-7 сайты-мишени расположены в 3' UTR мРНК-мишеней (Lee et al., Cell 75:843-854 1993; Wightman et al., Cell 75:855-862 1993; Reinhart et al., Nature 403:901-906 2000; Slack et al., Mol. Cell 5:659-669 2000), и имеется несколько ошибочных спариваний между lin-4 и let-7 миРНК и их сайтами-мишенями. По-видимому, связывание lin-4 или let-7 миРНК вызывает понижающую регуляцию установившихся уровней белка, кодируемого мРНК-мишенью, не влияя на сам транскрипт (Olsen и Ambros, Dev. Biol. 216:671-680 1999). С другой стороны, последние данные указывают на то, что миРНК могут в некоторых случаях вызывать специфическое РНК расщепление транскрипта-мишени на сайте-мишени (Hutvagner и Zamore, Science 297:2056-2060 2002; Llave et al., Plant Cell 14:1605-1619 2002). Вероятно, что миРНК могут вступать, по меньшей мере, в два