Способ получения и очистки плацентарной щелочной фосфатазы

Способ получения и очистки плацентарной щелочной фосфатазы

Реферат

Изобретение относится к области медицины, к биохимии и биотехнологии и касается способов выделения ферментов, в частности плацентарной щелочной фосфатазы.

Известно, что плацентарный фермент - термостабильная щелочная фосфатаза ассоциирован не только с фетоплацентарной недостаточностью, но и с другими, не акушерскими патологическими состояниями. Фермент щелочная фосфатазы плацентарного типа относится к онкомаркерам, поэтому разработка способа выделения плацентарной щелочной фосфатазы (ПЩФ) для конструирования иммунохимических тест-систем на этот белок имеет важное значение для медицины (Сухарев А.Е., Вайчулис Ю.В., Асфандияров Р.И., Панченко Л.Ф., Терентьев А.А., Беда Н.А., Москаленко Н.П. Плацентарная щелочная фосфатаза и острофазовые белки в клинико-лабораторной оценке факторов повышенного тромбогеморрагического риска в акушерстве. М. - Астрахань, 2006. - 282 с).

Кроме того, ведущие косметические и фармацевтические фирмы активно разрабатывают линейку продуктов на основе препаратов плаценты и среди комплекса биологически активных веществ плаценты, кроме низкомолекулярных регуляторов роста, ими заявляется фермент ПЩФ (UA патент №2006/ а200605513; RU 2235550 C2, 10.09.2004; RU 2033797 C1, 30.04.95; RU 2071336 C1, 10.01.97; US 4348316, 07.09.82; EP 0297455 A1, 04.01.89; Заявка: RU 2007120122/15, 16.05.2007).

Существующие способы выделени фосфатазы (Заявка: RU 4946819/13, 19.06.1991; US патент №4581332, кл. С 12N 9/52), как правило, основаны на основном уникальном биологическом свойстве ПЩФ - способности выдерживать нагревание до 65°C в течение 10-15 минут, в связи с чем ПЩФ имеет другое название - термостабильная плацентарная щелочная фосфатаза.

Известен классический способ выделения ПЩФ, предусматривающий экстрагирование фермента из плацентарного сырья 30%-ным бутанолом, фракционное осаждение ацетоном, кратковременную термообработку (обычно при 65°C), фракционирование белков сульфатом аммония (45-62%), хроматографию ферментсодержащего раствора на диэтиламиноэтилсефадексе A-50, гельфильтрацию на сефадексе G-100 и кристаллизацию (Lehman F.Y., Lehman D. Regan-isoenzyme isolirung der alkalischen Phosphatase aus Menschlicher Plazenta und Entwichlung einer empfindlichen Methode fiir die Tumordiagnostik. - Wern. Dtsch. Ger. Aim Med. 80 Kongr., Wiesbaden, 1974, 1658-1661).

Недостатками известных способов являются:

- падение активности фермента по сравнению с исходным экстрактом плаценты примерно на 50%, так как органические растворители типа бутанола, вызывают денатурацию белка и увеличивают потери активности;

- ухудшение органолептических и, следовательно, коммерческих свойств целевого продукта (запах бутанола сохраняется на протяжении всех этапов выделени фермента);

- трудоемкость, техническая сложность используемых методов для практического применения.

Наиболее близким к заявленному решению является патент - (RU 1082811 A1, 30.03.1984), в котором раскрыт способ получения плацентарной щелочной фосфатазы, заключающийся в том, что отмытую от крови человеческую плаценту гомогенизируют при 8000 об/мин. 5 мин., полученную массу экстрагируют ЗМ хлоридом калия в соотношении 1:3 и перемешивают на магнитной мешалке при 4°C в течение 12 часов. Раствор центрифугируют при 6000 об/мин 30 мин и осадок отбрасывают. Надосадочную жидкость диализируют, прогревают 10 мин при 65°C. Экстракт центрифугируют при 6000 об/мин 30 мин. В надосадочной жидкости на магнитной мешалке при комнатной температуре растворяют 1% раствор цитилпиридиния. Экстракт цинтрифугируют. Надосадочную жидкость отбрасывают, а осадок растворяют в 3,5% р-ре NaCl, диализуют. Далее экстракт насыщают сульфатом аммония до 65% насыщения, диализируют и центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин, надосадок отбрасывают. Осадок растворяют в минимальном объеме трис-буфера (pH 8,6), пробы ставят в препаративный электрофорез в полиакриламидном геле. Окрашивают гель, содержащий фермент на щелочную фосфатазу: субстрат - нафтил-AS-Ол-фосфат, краситель - прочный синий ВВ, буфер веронил-мединовый (pH 8,6). Под визуальным контролем вырезают узкие полоски окрашенных фракций плацентарной щелочной фосфатазы. Недостатками прототипа являются:

- относительно низкий выход фермента, равный 72% по отношению к содержанию в исходном продукте (плацентарном экстракте);

- потери фермента на неоднократных этапах диализа;

- удлинение процедуры выделения фермента на неоднократных этапах диализа;

- сложность отделения методом диализа детергента хлористого цетилпиридиния от целевого продукта;

- зависимость от фирм-поставщиков дефицитного детергента цетилпиридиния;

- трудоемкость используемых методов для практического применения;

- сложность используемых методов для получения целевого продукта в коммерческих масштабах;

- невозможность получения моноспецифических антисывороток к плацентарной щелочной фосфатазе при иммунизации из-за наличия минорных примесей посторонних белков;

- способ не гарантирует полного отсутствия вирусных частиц, что недопустимо для медицинских и косметических препаратов и препятствует использованию плацентарной щелочной фосфатазы в качестве ингредиента перспективных лечебно-косметических композиций.

Изобретение направлено на упрощение технологического процесса получения фермента плацентарной щелочной фосфатазы с существенным увеличением выхода целевого продукта.

Указанный технический результат достигается тем, что после первичного прогревания экстракта, проводят повторную термообработку экстракта в присутствии сульфата кадмия 0,14%-ной концентрации в течение 1-3 мин при 65°C с последующим охлаждением колбы под струей воды, добавляют сульфат аммония до 30% насыщения, отделяют осадок центрифугированием, надосадочную жидкость, подвергают гидрофобной хроматографии на колонке с фенил-сефарозой CL-4B, элюцию с колонки проводят 0,02М трис-глициновым электродным буфером pH 8,6, а ферментсодержащий элюат подвергают препаративному электрофорезу в 7%-ном полиакриламидном геле.

Предлагаемый способ основан на обнаруженном нами феномене относительной устойчивости ПЩФ к ионам тяжелых металлов (кадмия) при термообработке раствора белка. Соли кадмия издавна применяются как осадитель белка, но в отличие от других солей тяжелых металлов (ртути, серебра), избирательно осаждают белки, пропорционально концентрации и физико-химическим свойствам белка. В результате предварительных экспериментов нами подобрана концентрация сульфата кадмия 0,14% как оптимальная для сохранения термостабильных свойств ПЩФ при 65°C. При этом наблюдается максимальное выпадение в осадок балластных плацентарных белков.

Предварительные эксперименты показали, что лучше проводить повторную термообработку экстракта в присутствии сульфата кадмия после первой (классической) термообработки экстракта и удаления выпавших в осадок белков центрифугированием, чем проводить единственную термообработку в присутствии сульфата кадмия, так как образующийся обильный осадок денатурированных белков частично адсорбирует на себя очищаемый фермент и снижает его выход.

Температура 65°C относится к одной из трех стандартных критических точек (56, 65 и 100°C) исторически применяемых в биохимии, микробиологии и экспериментальной медицине для оценки термостабильности белков, поэтому и вторая термообработка термостабильной при 65°C плацентарной щелочной фосфатазы мы проводили именно при этой температуре. При этом выпадение в осадок балластных плацентарных белков при термообработке в присутствии сульфата кадмия достигала максимума через 1 мин термообработки при 65°C, до 3-х мин термообработки объем осадка не увеличивался, однако дальнейшая термообработка приводило к незначительному снижению концентрации ПЩФ, за счет его частичной денатурации. Этим объясняется необходимость спустя 1-3 мин термообработки при 65°C, достаточно быстрого (в течение 1 мин) снижения температуры ферментсодержащего раствора ниже минимальной критической точки в 56°C, остужая колбу под водопроводной водой. По достижению температуры 55°C скорость дальнейшего охлаждения раствора фермента ПЩФ не влияет на выход, степень очистки и активность фермента.

Из литературы известно, что белок ПЩФ высаливается сульфатом аммония в диапазоне 30-65% насыщения. При 30% насыщения сульфатом аммония из раствора в осадок выпадают попутные белки, а ПЩФ в этих условиях сохраняет растворимость.

Для дальнейшего фракционирования ПЩФ в солевом растворе сульфата аммония 30% насыщения обычно применяется его осаждение сульфатом аммония 65% насыщения, центрифугирование осадка, растворение его в минимальном объеме буфера и длительная стадия его обессоливания методом диализа. Альтернативой переосаждению и диализу препарата ПЩФ является метод гидрофобной хроматографии. Сам принцип гидрофобной хроматографии заключается в нанесении белка на колонку в растворе соли высокой концентрации и десорбции его с гидрофобного носителя буферными растворами низкой ионной силы, если белок не десорбируются и в этих условиях, в элюирующий раствор добавочно вносят полярные растворители (многоатомные спирты) и детергенты.

Нами установлено, что ПЩФ, растворимый в водном растворе сульфата аммония 30% насыщения эффективно адсорбируется на гидрофобном сорбенте фенил-сефарозе и легко десорбируется элюирующим буферным раствором низкой ионной силы, в частности, 0,02М трис-глициновым буфером, применяемым при электрофорезе в полиакриламидном геле.

Предлагаемый способ получения ПЩФ человека прошел успешную апробацию на 35 образцах плаценты в практической работе кафедры биологической химии и учебно-научно-диагностического центра Астраханской государственной медицинской академии в течение 2011 года.

Способ обеспечивает выход фермента ПЩФ до 92,9% от исходного содержания. Степень очистки ПЩФ по данному способу превышала 30 раз (табл.1). Удельная активность фермента при его концентрации 10 мг/л составляла 8-10 тыс нмоль/сек/л (ME).

Изменение концентрации ПЩФ и общего белка на этапах получения фермента представлены в таблице 1.

Ниже приводятся результаты апробации.

Пример 1. Получение первичного экстракта плаценты.

Нарезанную ножницами крупными кусками свежую плаценту от рожениц 40 недель беременности промывают несколько часов под холодной водопроводной водой в эксикаторе, накрытом марлей или сеткой. Отмытую от крови ткань плаценты гомогенизируют при 8000 об/мин 5 мин. К одному объему гомогената добавляют три объема ЗМ раствора хлорида калия и перемешивают на магнитной мешалке при 4°C в течение 12 часов. Раствор центрифугируют при 6000 об/мин 30 мин и осадок отбрасывают. (Общий объем 2000 мл, общий белок 44000 мг, ПЩФ 1240 мг, концентрация ПЩФ по белку 2,82%, выход 100%, степень очистки 1).

Термообработка первичного экстракта.

Надосадочную жидкость прогревают 10 мин при 65°C. Экстракт центрифугируют при 6000 об/мин 30 мин. Осадок отбрасывают. (Общий объем 2000 мл, общий белок 5200 мг, ПЩФ 1200 мг, концентрация ПЩФ по белку 23,1%, выход 96,8%, степень очистки 8,5).

Повторная термообработка с сульфатом кадмия.

В надосадочной жидкости на магнитной мешалке при комнатной температуре растворяют сухой сульфат кадмия до конечной концентрации ОД 4%. Проводят повторную термообработку экстракта при 65°C в присутствии сульфата кадмия в течение 1 мин, колбу с экстрактом быстро охлаждают под струей воды. Экстракт центрифугируют при 6000 об/мин 30 мин и осадок отбрасывают. (Общий объем 2000 мл, общий белок 2600 мг, ПЩФ 1170 мг, концентрация ПЩФ по белку 45%, выход 94,4%, степень очистки 16,9).

Обработка сульфатом аммония.

На следующем этапе выделения фермента экстракт насыщают сульфатом аммония до 30% насыщения и после формирования видимого осадка повторно центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин, осадок отбрасывают. (Общий объем 5000 мл, общий белок 1800 мг, ПЩФ 1160 мг, концентрация ПЩФ по белку 64,4%, выход 93,5%, степень очистки 24,4).

Гидрофобная хроматография.

Полученный раствор фермента в сульфате аммония, минуя стадию диализа, подвергают гидрофобной хроматографии на колонке с фенил-сефарозой CL-4B. Элюцию фермента с колонки проводят 0,02М трис-глициновым буфером (pH 8,6), являющегося электродным буфером для следующей стадии препаративного электрофореза. (Общий объем 50 мл, общий белок 1450 мг, ПЩФ 1160 мг, концентрация ПЩФ по белку 80%, выход 93,5%, степень очистки 30,3).

Препаративный электрофорез в полиакриламидном геле.

После этих этапов пробы ставят в препаративный электрофорез в 7%-ном полиакриламидном геле. Окрашивают гель, содержащий фермент на щелочную фосфатазу: субстрат - нафтил-фосфат AS-TR, краситель - прочный синий ВВ, буфер - трис-глициновый (pH 8,6). Под визуальным контролем вырезают узкие полоски окрашенных фракций плацентарной щелочной фосфатазы. (Общий объем 40 мл, общий белок 1300 мг, ПЩФ 1150 мг, концентрация ПЩФ по белку 88,5%), выход 92,9%, степень очистки 33,8).

Основные характеристики препарата ПЩФ на этапах получения очищенного фермента представлены в таблице 1.

Пример 2. Нарезанную ножницами плаценту от рожениц 37 недель беременности промывают, гомогенизируют, проводят экстракцию ЗМ раствором хлорида калия и прогревают 10 мин при 65°C как в примере 1. В надосадочной жидкости на магнитной мешалке при комнатной температуре растворяют сухой сульфат кадмия до конечной концентрации 0,14%. Проводят повторную термообработку экстракта при 65°C в присутствии сульфата кадмия в течение 3 мин, колбу с экстрактом быстро охлаждают под струей воды. Экстракт центрифугируют и осадок отбрасывают. Последующие этапы аналогичны примеру 1.

Сохраняется выход фермента ПЩФ до 92,9% от содержания в первичном экстракте плаценты. Удельная активность фермента при его концентрации 10 мг/л также оставалась высокой и составляла 8-10 тыс нмоль/сек/л (ME).

Предлагаемым способом достигается сокращение времени получения фермента до 2-х суток, увеличение выхода целевого продукта до 92,9% с высокой степенью очистки (33-кратной) удельной активности (см. табл.1) и снижение стоимости целевого продукта, а также при осуществлении предлагаемого способа требуется меньшее количество реактивов, исключается применение высокоскоростных рефрижераторных центрифуг и дорогостоящей аппаратуры.

Способ получения плацентарной щелочной фосфатазы, заключающийся в том, что гомогенизируют отмытую от крови плаценту человека, экстрагируют гомогенат в ЗМ растворе хлорида калия в соотношении 1:3, центрифугируют полученный экстракт 30 мин при 6000 об/мин, полученный надосадок прогревают 10 мин при 65°C, центрифугируют, добавляют раствор сульфата аммония, после проводят очистку полученного фермента методом препаративного электрофореза в полиакриламидном геле, окрашивают гель, содержащий фермент, и под визуальным контролем вырезают окрашенные фракции щелочной фосфатазы, отличающийся тем, что после первичного прогревания экстракта проводят его повторное прогревание в присутствии сульфата кадмия 0,14%-ной концентрации в течение 1-3 мин при 65°C с последующим быстрым охлаждением колбы, добавляют сульфат аммония до 30% насыщения, отделяют осадок центрифугированием, надосадочную жидкость подвергают гидрофобной хроматографии на колонке с фенил-сефарозой CL-4B, элюцию с колонки проводят 0,02М трис-глициновым электродным буфером pH 8,6, а ферментсодержащий элюат подвергают очистке препаративным электрофорезом в 7%-ном полиакриламидном геле.