Способы и композиции для иммунизации свиней против свиного цирковируса

Способы и композиции для иммунизации свиней против свиного цирковируса

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к области здоровья животных и в нем предложены способы и композиции для защиты свиней против патогенных штаммов свиного цирковируса типа 2В. Более конкретно, настоящее изобретение относится к вновь идентифицированным патогенным штаммам свиного цирковируса типа 2В, последовательностям нуклеиновых кислот, кодирующим эти штаммы типа 2В, и белкам, кодируемым этими нуклеиновыми кислотами. Это изобретение также относится к способам и композициям для индукции иммунного ответа к патогенному свиному цирковирусу путем путем введения композиции, содержащей иммуногенно эффективное количество по меньшей мере одного из этих свиных цирковирусов типа 2В, или нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один из этих свиных цирковирусов типа 2, или по меньшей мере один белок, кодируемый этими нуклеиновыми кислотами.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Свиной цирковирус (PCV) является мелким икосаэдрическим безоболочечным вирусом, который содержит одноцепочечный кольцевой ДНК-геном с размером примерно 1,76 т.п.н. Он был первоначально выделен в качестве контаминанта клеточной культуры линии клеток почки свиньи РК-15 (I. Tischer et al., Nature 295: 64-66 (1982); I. Tischer et al., Zentralbl. Bakteriol. Hyg. Otg. A. 226 (2): 153-167 (1974)). PCV классифицируют в семейство Circoviridae, которое состоит из трех других цирковирусов животных (вирус анемии кур (CAV), вирус болезни клюва и перьев попугаев (PBFDV) и недавно обнаруженный голубиный цирковирус (CoCV) из голубей) и трех цирковирусов растений (вирус кустистости верхушки банана, вирус увядания листьев кокосовой пальмы и вирус карликовости подземного клевера) (М.R.Bassami et al., Virology 249: 453-459 (1998); J. Mankertz et al., Virus Genes 16: 267-276 (1998); A.Mankertz et al., Arch. Virol. 145: 2469-2479 (2000); В.M.Meehan et al., J. Gen. Virol. 78: 221-227 (1997); В.M.Meehan et al., J. Gen. Virol. 79: 2171-2179 (1998); D.Todd et al., Arch. Virol. 117: 129-135 (1991)). Члены трех ранее идентифицированных цирковирусов животных (PCV, CAV и PBFDV) не имеют гомологии нуклеотидных последовательностей или антигенных детерминант между собой (M.R.Bassami et al., 1998, выше; D.Todd et al., 1991, выше). Экспериментальное инфицирование свиней вирусом PCV, полученным из клеток РК-15, не вызывает клинического заболевания, и поэтому этот вирус не считается патогенным для свиней (G.M.Allan et al., Vet. Microbiol. 44: 49-64 (1995); I.Tischer et al., Arch. Virol. 91: 271-276 (1986)). Этот непатогенный PCV, полученный из зараженной клеточной линии РК-15, обозначили как свиной цирковирус типа 1 или PCV1.

Синдром послеотъемного мультисистемного истощения (PMWS, postweaning multisystemic wasting syndrome), впервые описанный в 1991 г. (J.C.Harding and E.G.Clark, Swine Health and Production 5: 201-203 (1997)), представляет собой комплексное заболевание отъемных поросят, которое становится все более распространенным. PMWS в основном поражает свиней в возрасте 5-18 недель. Клинические признаки PMWS включают в себя прогрессирующую потерю массы тела, одышку, учащенное дыхание, анемию, диарею и желтуху. В Великобритании уровень смертности может варьировать от 1-2% до 40% в некоторых осложненных случаях (M. Muirhead, Vet. Rec. 150: 456 (2002)). Микроскопические поражения, характерные для PMWS, включают в себя гранулематозную интерстициальную пневмонию, лимфаденопатию, гепатит и нефрит (G.M.Allan and J.A.Ellis, J. Vet. Diagn. Invest. 12: 3-14 (2000); J.С.Harding and E.G.Clark, Swine Health and Production 5: 201-203 (1997)).

Хотя PCV1 является повсеместным у свиней, он не является патогенным для свиней. Первичным причиной PMWS обычно является патогенный штамм PCV, обозначенный как свиной цирковирус типа 2 или PCV2 (G.M. Allan et al., Vet. Rec. 142: 467-468 (1998); G.M.Allan etal., J. Vet. Diagn. Invest. 10:3-10 (1998); G.M.Allan et al., Vet. Microbiol. 66: 115-23 (1999); G.M.Allan and J.A.Ellis, J. Vet. Diagn. Invest. 12: 3-14 (2000); J. Ellis etal. Can. Vet. J. 39: 44-51 (1998); A.L.Hamel et al., J. Virol. 72: 5262-5267 (1998); B.M.Meehan et al., 1998, выше; I.Morozov et al,, J. Clin. Microbiol. 36: 2535-2541 (1998)). Была определена полная геномная последовательность PMWS-ассоциированного PCV2 (М.Fenaux et al., J. Clin. Microbiol. 38: 2494-503 (2000); A.L.Hamel et al., 1998, выше; J. Mankertz et al., 1998, выше; B.M.Meehan et al., 1997, выше; B.M.Meehan et al., 1998, выше; I.Morozov et al., 1998, выше).

Анализы последовательностей показывают, что PMWS-ассоциированный PCV2 имеет только примерно 75%-ную идентичность нуклеотидной последовательности с непатогенным PCV1. Ген ORF2 как непатогенного PCV1, так и патогенного PCV2, кодирует главный иммуногенный вирусный капсидный белок (Р.Nawagitgul et al., Immunol. Clin. Diagn. Lab Immunol. 1: 33-40 (2002); P.Nawagitgul et al., J. Gen. Virol. 81: 2281-2287 (2000)).

Из-за ее потенциального влияния на свиноводство, разработка вакцины против PCV2 приобрела огромную важность. Например, в патенте США №6287856 (Poet et al.) и WO 99/45956 описаны нуклеиновые кислоты из вируса болезни клюва и перьев попугаев (BFDV), цирковируса, который инфицирует птиц, и из свиного цирковируса (PCV). В данном патенте предложены вакцинные композиции, содержащие голую ДНК или мРНК, и описан нуклеиновокислотный вектор для временной экспрессии PCV в эукариотической клетке, содержащей цис-действующую последовательность, регулирующую транскрипцию или трансляцию, производную от энхансера или промотора немедленного или раннего гена человеческого цитомегаловируса, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты.

В патенте США №6217883 (Allan et al.) и французском патенте №2781159 В описано выделение пяти штаммов PCV из образцов легких и ганглиев, взятых от свиней, инфицированных PMWS в Канаде, Калифорнии и Франции (Бретань), и их применение в комбинации с по меньшей мере одним антигеном парвовируса свиней в вакцинной/иммуногенной композициях. Хотя белки, кодируемые открытыми рамками считывания (ORF) PCV2, состоящими из ORF1-ORF13, широко описаны в этом патенте, в нем нет никаких примеров какого-либо конкретного белка, демонстрирующего иммуногенные свойства. В этом патенте дополнительно описаны векторы, состоящие из ДНК-плазмид, линейных молекул ДНК и рекомбинантных вирусов, которые содержат и экспрессируют in vivo молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген PCV.

В некоторых других ссылках, например, патенте США №6391314 В1, патенте США №6368601 В1, французском патенте №2769321, французском патенте №2769322, WO 01/96377 А2, WO 00/01409, WO 99/18214, WO 00/77216 А2, WO 01/16330 А2, WO 99/29871 и т.д., описано введение полипептидов PCV1 или PCV2 или нуклеиновых кислот, кодирующих полипептиды из разных штаммов, в качестве вакцинных композиций.

Цитирование любой ссылки в данной заявке не следует понимать как допущение, что такую ссылку можно использовать в качестве предшествующего уровня техники для настоящего изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В его наиболее широком аспекте, в настоящем изобретении предложены выделение и идентификация двух новых штаммов свиных цирковирусов типа 2 (PCV2), каждый из которых можно использовать отдельно или в комбинации для получения вакцинной или иммуногенной композиции для применения в защите свиней против инфекции патогенным PCV2 или для облегчения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с синдромом послеотъемного мультисистемного истощения (PMWS).

Соответственно, согласно первому аспекту изобретения предложен выделенный свиной цирковирус типа 2, геном которого содержит молекулу нуклеиновой кислоты либо из SEQ ID NO:1 (обозначенную как FD07) либо 2 (обозначенную как FDJE), или геном которого содержит молекулу нуклеиновой кислоты, имеющую по меньшей мере 95%-ную гомологию последовательности с любой из SEQ ID NO:1 или 2.

В одном из воплощений два вновь идентифицированных и выделенных свиных цирковируса представляют собой свиные цирковирусы типа 2 В (PCV2B).

В одном из воплощений выделенные свиные цирковирусы имеют белок ORF2 с по меньшей мере 92%-ной идентичностью последовательности с любой из SEQ ID NO:3 (из FD07) или 4 (из FDJE).

В одном из воплощений выделенные свиные цирковирусы имеют белок ORF2, содержащий аминокислотную последовательность любой из SEQ ID NO:3 или 4.

Согласно второму аспекту изобретения предложена выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая патогенный свиной цирковирус типа 2 В или кодирующая по меньшей мере один белок из указанного цирковируса, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 95%-ную гомологию последовательности с любой из SEQ ID NO:1 или 2.

В одном из воплощений выделенная молекула нуклеиновой кислоты содержит нуклеотидную последовательность любой из SEQ ID NO:1 или 2.

В одном из воплощений выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок репликазу ORF 1 из FD07, содержит остатки с номерами 51-995 из SEQ ID NO:5, и выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая капсидный белок ORF 2 из FD07, содержит остатки с номерами 1033-1734 из SEQ ID NO:5.

В одном из воплощений выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая белок репликазу ORF 1 из FDJE, содержит остатки с номерами 51-995 из SEQ ID NO:6, и выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая капсидный белок ORF 2 из FDJE, содержит остатки с номерами 1033-1734 из SEQ ID NO:6.

В одном из воплощений выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует белок ORF2, имеющий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3 или 4.

Согласно третьему аспекту изобретения предложена иммуногенная или вакцинная композиция, содержащая по меньшей мере одно из следующего: по меньшей мере один из выделенных свиных цирковирусов типа 2В, как описано в данной заявке, или их комбинацию; по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один из свиных цирковирусов типа 2В, описанных в данной заявке; по меньшей мере одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один белок из по меньшей мере одного из свиных цирковирусов типа 2В, описанных в данной заявке; или по меньшей мере один белок, полученный по меньшей мере из одного свиного цирковируса типа 2В, описанного в данной заявке, и фармацевтически приемлемый адъювант.

В одном из воплощений вакцинная или иммуногенная композиция может содержать одно или более чем одно из следующего:

а) живой/аттенуированный или модифицированный живой PCV2B, геном которого содержит молекулу нуклеиновой кислоты любой из SEQ ID NO:1 или 2;

б) убитый/инактивированный PCV2B, геном которого содержит молекулу нуклеиновой кислоты любой из SEQ ID NO:1 или 2;

в) ДНК-вакцина против PCV2B (например плазмидный вектор, экспрессирующий ORF2 из PCV2B, геном которого содержит молекулу нуклеиновой кислоты любой из SEQ ID NO:1 или 2); или

г) инактивированный вирусный вектор (например бакуловирус, аденовирус или поксвирус, такой как поксвирус енота; или бактерия, такая как Е. coli), который экспрессирует ORF2 из PCV2B, геном которого содержит молекулу нуклеиновой кислоты любой из SEQ ID NO:1 или 2.

В одном из воплощений вакцинная или иммуногенная композиция, где ген ORF 2 получен из свиного цирковируса типа 2В из SEQ ID NO:1 или 2, может создавать перекрестную защиту против инфекций свиными штаммами типа 2А, типа 2С или типа 2D или любым другим вариантом. Введение такой вакцинной или иммуногенной композиции приводит к защите свиньи против штаммов типа 2А с низкой вирулентностью/низкой смертностью, и также приводит к перекрестной защите против патогенных штаммов свиных цирковирусов типа 2В с высокой вирулентностью/высокой смертностью. Используемую вакцинную или иммуногенную композицию можно вводить в виде одной дозы или в виде многократных доз. Введение приводит к защите свиньи от любого одного или более чем одного симптома или последствия, ассоциированного с синдромом послеотъемного мультисистемного истощения (PMWS). Более того, введение вакцинной или иммуногенной композиции, содержащей любое вышеуказанное воплощение, также приводит к снижению более высокой, чем средняя, смертности, ассоциированной со штаммами свиного цирковируса типа 2В с высокой вирулентностью/высокой смертностью.

В одном из воплощений иммуногенную или вакцинную композицию, описанную выше, можно использовать для индукции иммунного ответа против свиного цирковируса, или для защиты свиней против инфекции патогенным PCV2, или для облегчения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с этим заболеванием.

В одном из воплощений иммуногенная или вакцинная композиция, описанная выше, дополнительно содержит по меньшей мере один другой микроорганизм или антиген, полученный из указанного микроорганизма, иммунный ответ против которого является желательным. В одном из воплощений иммуногенная или вакцинная композиция, описанная выше, дополнительно содержит по меньшей мере одну другую молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один антиген из по меньшей мере одного другого микроорганизма, иммунный ответ против которого является желательным. Другой микроорганизм может быть выбран из группы, состоящей из вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), парвовируса свиней (PPV), Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropnemoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, бактерий лептоспира, вируса свиного гриппа, антигена Escherichia coli, респираторного коронавируса свиней, ротавируса, патогена, вызывающего болезнь Ауески, патогена, вызывающего трансмиссивный гастроэнтерит свиней, и второго другого штамма свиного цирковируса. Второй другой штамм свиного цирковируса может представлять собой цирковирус типа 2А или типа 2В.

В одном из воплощений иммуногенную или вакцинную композицию вводят с адъювантом или без адъюванта.

Водном из воплощений иммуногенную или вакцинную композицию вводят одной дозой или многократными дозами подкожным, внутримышечным, интраназальным, трансдермальным, внутрипеченочным, внутрилимфоидным путем.

Согласно четвертому аспекту изобретения предложен способ иммунизации свиньи против вирусной инфекции или синдрома послеотъемного мультисистемного истощения (PMWS) или предупреждения у свиньи PMWS, вызванного штаммом PCV2, или для облегчения по меньшей мере одного симптома, ассоциированного с PMWS, включающий введение указанной свинье иммуногенно эффективного количества композиции, содержащей любое одно или более чем одно из следующего:

а) иммуногенно эффективное количество по меньшей мере одного свиного цирковируса типа 2, кодируемого молекулой нуклеиновой кислоты любой из SEQ ID NO:1 или 2, как описано в данной заявке;

б) молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую по меньшей мере один из свиных цирковирусов типа 2 из а);

в) иммуногенно эффективное количество по меньшей мере одного белка, выделенного из по меньшей мере одного из свиных цирковирусов типа 2 из а); или

г) иммуногенно эффективное количество по меньшей мере одной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей по меньшей мере один белок из в).

В одном из воплощений в изобретении предложены способы иммунизации или защиты свиней против по меньшей мере одного патогенного штамма свиного цирковируса путем введения вакцинной или иммуногенной композиции, содержащей нетоксический, физиологически приемлемый носитель и иммуногенно эффективное количество убитого/инактивированного свиного цирковируса типа 2 или живого аттенуированного свиного цирковируса типа 2, как описано в данной заявке, геном которого содержит молекулу нуклеиновой кислоты любой из SEQ ID NO:1 или 2. В одном из воплощений способы по изобретению обеспечивают иммунизацию или защиту свиньи против инфекции свиным цирковирусом путем введения вакцинной или иммуногенной композиции, как описано выше, которая дополнительно содержит адъювант.

В одном из воплощений в изобретении предложены способы иммунизации или защиты свиньи против патогенного штамма свиного цирковируса типа 2В путем введения вакцинной или иммуногенной композиции, содержащей инфекционную нуклеиновую кислоту, кодирующую свиной цирковирус типа 2, как показано в SEQ ID NO:1 или 2, где введение приводит к ослаблению одного или более чем одного симптома инфекции свиным цирковирусом.

В одном из воплощений в изобретении предложены способы иммунизации или защиты свиньи против патогенного штамма свиного цирковируса типа 2В путем введения иммуногенно эффективного количества вакцинной или иммуногенной композиции, где указанная композиция содержит по меньшей мере один белок из свиного цирковируса типа 2, как описано в настоящем изобретении, или нуклеиновую кислоту, кодирующую белок из свиного цирковируса типа 2 по настоящему изобретению. В одном из воплощений белок из свиного цирковируса типа 2В по настоящему изобретению представляет собой белок ORF2. В одном из воплощений ген ORF-2, кодирующий белок ORF2 из свиных цирковирусов типа 2В по настоящему изобретению, обозначенных как FD07 и FDJE, содержит остатки с номерами 1033-1074 нуклеотидной последовательности, представленной в SEQ ID NO:5 и 6, соответственно, и белок, кодируемый геном ORF-2 из FD07 и FDJE содержит аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO:3 или 4, соответственно.

В одном из воплощений в изобретении предложены способы иммунизации или защиты свиньи против патогенного штамма свиного цирковируса типа 2В, включающий введение вакцинной или иммуногенной композиции, содержащей свиной цирковирус типа 2 или нуклеиновую кислоту, кодирующую свиной цирковирус типа 2, где свиной цирковирус кодируется нуклеотидной последовательностью, представленной в SEQ ID NO:1 или 2, их комплементарными цепями или последовательностью нуклеиновой кислоты, имеющей по меньшей мере 95%-ную гомологию с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1 или SEQ ID NO:2.

В одном из воплощений в изобретении предложены способы иммунизация или защиты свиньи против патогенного штамма свиного цирковируса типа 2В путем введения вакцинной или иммуногенной композиции, содержащей по меньшей мере один из двух новых свиных цирковирусов типа 2В, или нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один из двух новых свиных цирковирусов типа 2В по настоящему изобретению, или по меньшей мере один белок по меньшей мере из одного из двух штаммов типа 2В по настоящему изобретению, или нуклеиновую кислоту, кодирующую по меньшей мере один из этих двух белков, где патогенный штамм свиного цирковируса типа 2 В представляет собой штамм свиного цирковируса, который содержит капсидный белок, кодируемый геном ORF 2, который демонстрирует не менее чем 92%-ную идентичность последовательности с капсидным белком, кодируемым геном ORF 2 из по меньшей мере одного из двух штаммов свиных цирковирусов типа 2В, описанных в настоящем изобретении. Аминокислотные последовательности капсидных белков штаммов свиного цирковируса типа 2В по настоящемуизобретению показаны в SEQ ID NO:3 и 4.

В одном из воплощений способы по изобретению обеспечивают иммунизацию или защиту свиньи от инфекции патогенным штаммом свиного цирковируса типа 2В, включающую введение указанной свинье вакцинной или иммуногенной композиции, содержащей свиной цирковирус типа 2В, или нуклеиновую кислоту, кодирующую свиной цирковирус типа 2В или кодирующую по меньшей мере один белок из указанного свиного цирковируса по настоящему изобретению, где указанное введение приводит к ослаблению одного или более чем одного из следующих клинических симптомов:

уменьшение микроскопических поражений в одной или более чем одной лимфоидной или нелимфоидной ткани свиней, подвергнутых воздействию вирулентной формы свиного цирковируса типа 2В;

уменьшение виремии, ассоциированной с инфекцией свиным цирковирусом;

уменьшение уровня нуклеиновой кислоты типа 2А или типа 2В в одной или более чем одной ткани.

В одном из воплощений способ дополнительно включает введение иммуногенно эффективного количества второй другой иммуногенной композиции перед, в сочетании с или после введения иммуногенной композиции свиного цирковируса типа 2, как описано в данной заявке.

В одном из воплощений вторая другая иммуногенная композиция содержит иммуногенно эффективное количество по меньшей мере одного другого микроорганизма, который является патогенным для свиней, или по меньшей мере Одного антигена, полученного из указанного микроорганизма, или молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный антиген, где микроорганизм выбран из группы, состоящий из вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), парвовируса свиней (PPV), Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropnemoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, бактерий лептоспира, вируса свиного гриппа, антигена Escherichia coli, респираторного коронавируса свиней, ротавируса, патогена, вызывающего болезнь Ауески, патогена, вызывающего трансмиссивный гастроэнтерит свиней, и второго другого штамма свиного цирковируса. Второй другой штамм свиного цирковируса может представлять собой цирковирус типа 2А или 2В.

В пятом аспекте изобретения предложен вектор, содержащий по меньшей мере одну экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белок из свиного цирковируса типа 2А или типа 2В, где белок свиного цирковируса представляет собой белок ORF2, и где экзогенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая указанный белок, представлена остатками 1033-1734 из SEQ ID NO:5 или 6.

В одном из воплощений вектор представляет собой вектор на основе поксвируса енота, содержащий молекулу нуклеиновойкислоты, кодирующую по меньшей мере один белок из свиного цирковируса PCV2A или PCV2B, как описано в данной заявке, или их обоих.

В одном из воплощений вектор дополнительно содержит одну или более чем одну экзогенную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую антиген из микроорганизма, который является патогенным для свиней, где указанный микроорганизм выбран из группы, состоящей из вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRS), парвовируса свиней (PPV), Mycoplasma hyopneumoniae, Haemophilus parasuis, Pasteurella multocida, Streptococcum suis, Actinobacillus pleuropnemoniae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella choleraesuis, Erysipelothrix rhusiopathiae, бактерий лептоспира, вируса свиного гриппа, антигена Escherichia coli, респираторного коронавируса свиней, ротавируса, патогена, вызывающего болезнь Ауески, патогена, вызывающего трансмиссивный гастроэнтерит свиней, и второго другого штамма свиного цирковируса.

В шестом аспекте изобретения предложен способ определения того, имеет ли млекопитающее, представляющее собой свинью, синдром послеотъемного мультисистемного истощения (PMWS) или риск его развития, включающий:

(I) измерение количества нуклеиновой кислоты или белка PCV2, кодируемого указанной нуклеиновой кислотой, в образце ткани, полученном от млекопитающего, где указанная нуклеиновая кислота или белок PCV2 представляет собой:

а) нуклеиновую кислоту, содержащую любую из SEQ ID NO:1, 2, 5 или 6, или нуклеиновую кислоту, происходящую из нее;

б) белок, содержащий любую из SEQ ID NO:3 или 4;

в) нуклеиновую кислоту, содержащую последовательность, гибридизующуюся с любой из SEQ ID NO:1, 2, 5 или 6, или их комплементарными последовательностями в условиях высокой жесткости, или белок, содержащий последовательность, кодируемую указанной гибридизующейся последовательностью;

г) нуклеиновую кислоту, по меньшей мере на 95% гомологичную любой из SEQ ID NO:1, 2, 5 или 6 или их комплементарной последовательности, как определено с использованием алгоритма NBLAST; или белок, кодируемый ею; и

(II) сравнение количества указанной нуклеиновой кислоты или белка в образце ткани млекопитающего, у которого подозревают наличие или риск развития PMWS, с количеством нуклеиновой кислоты или белка в образце ткани нормального млекопитающего, или с установленным стандартом для нормального образца ткани, где повышенное количество указанной нуклеиновой кислоты или белка в образце ткани млекопитающего, представляющего собой свинью, имеющего или подозреваемого в наличии PMWS, по сравнению с количеством в образце нормальной ткани или установленным стандартом для образца нормальной ткани указывает на то, что млекопитающее имеет PMWS или риск его развития.

В одном из воплощений способ определения того, имеет ли млекопитающее, представляющее собой свинью, PMWS или риск его развития, обеспечивает измерение количества нуклеиновой кислоты или белка PCV 2 В по изобретению в образце ткани, выбранной из группы, состоящей из пахового поверхностного лимфатического узла, трахеобронхиального лимфатического узла, подчелюстного лимфатического узла, легкого, миндалины, селезенки, печени, почки, цельной крови и клеток крови.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Фиг.1. Полная геномная последовательность свиного цирковируса типа 2 В, обозначенного как FD07 (SEQ ID NO:1).

Фиг.2. Полная геномная последовательность свиного цирковируса типа 2 В, обозначенного как FDJE (SEQ ID NO:2).

Фиг.3. Аминокислотная последовательность капсидного белка ORF2 из PCV2B, обозначенного как FD07 (SEQ ID NO:3).

Фиг.4. Аминокислотная последовательность капсидного белка ORF2 из PCV2B, обозначенного как FDJE (SEQ ID NO:4).

Фиг.5. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей белки ORF1 и ORF2 из FD07 (SEQ ID NO:5).

Фиг.6. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующей белки ORF1 и ORF2 из FDJE (SEQ ID NO:6).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Перед тем, как будут описаны способы по настоящему изобретению и методология лечения, следует понимать, что данное изобретение не ограничивается конкретными описанными способами и экспериментальными условиями, поскольку такие способы и условия могут варьировать. Также следует понимать, что используемая в данной заявке терминология предназначена только для описания конкретных воплощений и не предназначена быть ограничивающей.

При использовании в данном описании и прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают в себя множественные ссылки, если контекст не указывает ясно на иное. Таким образом, например, ссылки на "способ" включают в себя один или более способов, и/или стадий описанного в данной заявке типа, и/или то, что должно быть очевидным специалисту в данной области при чтении этого описания, и т.д.

Соответственно, в настоящей заявке можно использовать стандартные методы молекулярной биологии, микробиологии и рекомбинантной ДНК в пределах уровня техники. Такие методы полностью разъяснены в литературе. См., например, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (в данной заявке "Sambrook et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization B.D. Hames & S.J. Higgins eds. (1985)); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984));

Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986)); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, (1986)); В. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).

Хотя на практике или при тестировании данного изобретения можно использовать любые способы и вещества, аналогичные или эквивалентные описанным в данной заявке, здесь описаны предпочтительные способы и вещества. Все публикации, упомянутые в данной заявке, включены посредством ссылки во всей своей полноте.

Определения

Термины, используемые в данной заявке, имеют значения, понятные и известные специалистам в данной области, однако для удобства и полноты, конкретные термины и их значения изложены ниже.

Термин "адъювант" относится к соединению или смеси, которое(ая) усиливает иммунный ответ на антиген. Адъювант может служить в качестве тканевого депо, которое медленно высвобождает антиген, а также в качестве активатора лимфоидной системы, который неспецифически усиливает иммунный ответ (Hood et al., Immunology, Second Ed., 1984, Benjamin/Cummings: Menio Park, California, p.384). В зависимости от обстоятельств, первичное воздействие антигеном в отдельности, в отсутствие адъюванта, может не вызвать гуморальный или клеточный иммунный ответ. Адъюванты включают в себя, но не ограничиваются ими, полный адъювант Фрейнда, неполный адъювант Фрейнда, сапонин, минеральные гели, такие как гидрат окиси алюминия, поверхностно-активные вещества, такие как лизолецитин, плюроновые полиолы, полианионы, пептиды, масляные или углеводородные эмульсии, гемоцианины лимфы улитки, динитрофенол и потенциально полезные для человека адъюванты, такие как BCG (бацилла Кальметта-Герена) и Corynebacterium parvum. Предпочтительно, адъювант является фармацевтически приемлемым.

"Антиген" означает молекулу, которая содержит один или более чем один эпитоп, способный стимулировать иммунную систему хозяина для индукции клеточного антиген-специфического иммунного ответа или гуморального антительного ответа, когда антиген представлен в соответствии с настоящим изобретением. В норме эпитоп будет включать в себя примерно 3-15, обычно примерно 5-15 аминокислот.Эпитопы данного белка могут быть идентифицированы с использованием любого числа методов картирования эпитопов, хорошо известных в данной области. См., например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol.66 (Glenn E.Morris, Ed., 1996) Humana. Press, Totowa, N. J. Например, линейные эпитопы могут быть определены, например, одновременным синтезом большого числа пептидов на твердых подложках, где эти пептиды соответствуют частям белковой молекулы, и взаимодействием этих пептидов с антителами, пока эти пептиды еще присоединены к подложкам. Такие методы известны в данной области и описаны, например, в патенте США №4708871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715, которые включены в данную заявку посредством ссылки во всей своей полноте. Аналогично, конформационные эпитопы легко идентифицируют путем определения пространственной конформации аминокислот, например, рентгеновской кристаллографией и 2-мерным ядерным магнитным резонансом. См., например, Epitope Mapping Protocols, выше. Более того, для целей настоящего изобретения "антиген" относится к белку, который включает в себя такие модификации, как делеции, добавления и замены (обычно консервативные по природе, но они могут быть и неконсервативными), относительно нативной последовательности при условии, что белок сохраняет способность вызывать иммунологический ответ. Эти модификации могут быть преднамеренными, как при сайт-направленном мутагенезе, или конкретных синтетических процедурах, или генно-инженерных подходах, или могут быть случайными, как при мутациях у хозяев, которые продуцируют антигены.

Термин "аттенуированный" при использовании в данной заявке описывает, например, "аттенуированный вирус" и тому подобное и относится к микроорганизму, например вирусу, который ограничен в его способности расти и реплицироваться in vitro или in vivo.

Термин "цирковирус" при использовании в данной заявке, если не указано иное, относится к любому штамму цирковируса, который подпадает под семейство Circoviridae. Например, в настоящем изобретении цирковирус является патогенным свиным цирковирусом. В конкретных воплощениях патогенный свиной цирковирус представляет собой штамм свиного цирковируса типа 2А с низкой вирулентностью/низкой смертностью или штамм свиного цирковируса типа 2В с высокой вирулентностью/высокой смертностью.

"Комплементарный" понимают в его общепринятом значении как идентифицирующий нуклеотид в одной последовательности, который гибридизуется (отжигается) с нуклеотидом в другой последовательности в соответствии с правилом А→Т, U и C→G (и наоборот) и таким образом "соответствует" его партнеру в рамках этого определения. Ферментативная транскрипция имеет измеримые и хорошо известные частоты ошибок (в зависимости от конкретного используемого фермента), таким образом, в пределах транскрипционной точности с использованием описанных в данной заявке вариантов специалист может понять, что надежность ферментативного синтеза комплементарной цепи не является абсолютной и что ампликон не обязательно полностью соответствует в каждом нуклеотидеу целевой или матричной РНК. Способами при использовании условий высокой жесткости являются следующие. Предварительную гибридизацию фильтров, содержащих ДНК, осуществляют в течение периода от 8 ч до в течение ночи при 65°С в буфере, состоящем из 6×SSC, 50 мМ Трис-HCI (рН 7,5), 1 мМ ЭДТА, 0,02% HYP, 0,02% Ficoll, 0,02% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 500 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Фильтры гибридизуют в течение 48 ч при 65°С в смеси для предварительной гибридизации, содержащий 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося (5-20)×10⁶ имп/мин ³²Р-меченого зонда. Промывку фильтров осуществляют при 37°С в течение 1 ч в растворе, содержащем 2×SSC, 0,01% HYP, 0,01% Ficoll и 0,01% BSA. За этим следует промывка в 0,1×SSC при 50°С в течение 45 мин перед авторадиографией. Другие условия высокой жесткости, которые могут быть использованы, хорошо известны в данной области (см., например, Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York; см. также, Ausubel et al., eds., в серии руководств по лабораторным методам Current Protocols in Molecular Biology, 1987-1997 Current Protocols,© 1994-1997 John Wiley and Sons, Inc.).

Надо отметить, что в данном описании такие термины, как "включает", "включал в себя", "включающий", "содержит", "содержащий" и тому подобные, могут иметь значение, приписанное им в патентном законодательстве США; например, они могут означать "включает в себя", "включен", "включающий в себя" и тому подобное. Такие термины как "состоящий по существу из" и "состоит по существу из" имеют значение, приписанное им в патентном законодательства США, например, они позволяют включать дополнительные ингредиенты или стадии, которые не отклоняются от новых или основных характеристик данного изобретения, т.е. они исключают дополнительные не перечисленные ингредиенты или стадии, которые отклоняются от новых или основных характеристик данного изобретения, и они исключают ингредиенты или стадии из предшествующего уровня техники, такие как документы в данной области, которые процитированы в данной заявке или включены в данную заявку посредством ссылки, особенно поскольку цель данного документа состоит в определении воплощений, которые являются патентоспособными, например новыми, неочевидными, изобретательскими относительно предшествующего уровня техники, например документов, которые процитированы в данной заявке или включены в данную заявку посредством ссылки. И термины "состоит из" и "состоящий из" имеют значение, приписанное им в патентном законодательства США; а именно, эти термины являются ограничивающими.

"Кодируемый" или "кодирующий" относится к последовательности нуклеиновой кислоты, которая кодирует полипептидную последовательность, где эта полипептидная последовательность содержит аминокислотную последовательность из по меньшей мере 3-5 аминокислот, более предпочтительно из по меньшей мере 8-10 аминокислот, и еще более предпочтительно из по меньшей мере 15-20 аминокислот, полипептид, кодируемый последовательностями нуклеиновой кислоты. Также охвачены полипептидные последовательности, которые являются иммунологически идентифицируемыми с полипептидом, кодируемым данной последовательностью. Таким образом, антигенный "полипептид", "белок" или "аминокислотная" последовательность может иметь по меньшей мере 70% Сходства, предпочтительно по меньшей мере примерно 80% сходства, более предпочтительно примерно 90-95% сходства и наиболее предпочтительно примерно 99% сходства с полипептидом или аминокислотной последовательностью антигена.

"Ген" при использовании в контексте настоящего изобретения представляет собой последовательность нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты (хромосоме, плазмиде и т.д.), с которой ассоциирована генетическая функция. Ген представляет собой наследственную единицу, например, организма, содержащую полинуклеотидную последовательность (например последовательность ДНК для млекопитающих), которая занимает специфическое физическое местоположение ("генный локус" или "генетический локус") в геноме организма. Ген может кодировать экспрессирующийся продукт, такой как полипептид или полинуклеотид (например, тРНК). Альтернативно, ген может определять геномное расположение конкретного(ой) события/функции, такого(ой) как связывание белков и/или нуклеиновых кислот (например, сайты присоединения фага), где ген не кодирует экспрессирующийся продукт. В типичных случаях ген включает в себя кодирующие последовательности, такие как полипептид-кодирующие последовательности, и некодирующие последовательности, такие как промоторные последовательности, последовательности полиаденилирования, последовательности регуляции транскрипции (например энхансерные последовательности). Многие эукариотические гены имеют "экзоны" (кодирующие последовательности), прерываемые "интронами" (некодирующими последовательностями). В некоторых случаях ген может иметь общие последовательности с другим(и) геном(ами) (например, перекрывающимися генами).

Таким образом, "гомология", или "идентичность", или "сходство" Относится к сходству последовательности между двумя пептидами или между двумя молекулами нуклеиновой кислоты. Гомология может быть определена путем сравнения положения в каждой последовательности, которое можно выровнять для целей сравнения. Если поло