Комплексы на основе рнк и катионных пептидов для трансфекции и иммуностимуляции

Комплексы на основе рнк и катионных пептидов для трансфекции и иммуностимуляции

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к РНК в составе комплекса, содержащего по крайней мере одну РНК и один или более олигопептидов, где длина олигопептида составляет от 8 до 15 аминокислотных остатков и характеризуется формулой (Arg)₁(Lys)_m(His)_n(Orn)_o(Xaa)_x. Настоящее изобретение также относится к способу трансфекции клетки или организма с применением РНК в составе комплекса по настоящему изобретению. Кроме того, в настоящем изобретении предлагаются фармацевтические композиции и наборы, содержащие РНК в составе комплекса по настоящему изобретению, а также применение РНК в составе комплекса по настоящему изобретению для трансфекции клетки, ткани или организма и/или для модуляции, предпочтительно, индукции или усиления иммунного ответа.

Трансфекция нуклеиновых кислот в клетки или ткани пациентов методом переноса генов является основным методом в молекулярной медицине и имеет важнейшее значение в терапии и профилактике многочисленных заболеваний. Применение способов трансфекции нуклеиновых кислот может приводить к усилению иммунитета ткани или организма. В альтернативном или дополнительном варианте после трансфекции нуклеиновых кислот может происходить обработка информации, кодированной введенными нуклеиновыми кислотами, т.е. трансляция необходимых полипептидов или белков. ДНК или РНК, являясь нуклеиновыми кислотами, представляют собой альтернативные подходы при разработке способов генной терапии. Трансфекция нуклеиновых кислот также может приводить к модуляции, например, к подавлению или усилению, экспрессии генов, в зависимости от типа трансфектированной нуклеиновой кислоты. Трансфекцию указанных нуклеиновых кислот обычно проводят по методике переноса генов.

Методы переноса генов в клетки или ткани интенсивно исследовались в течение последних десятилетий, однако, отчасти, с незначительным успехом. Хорошо известные способы включают физические или физико-химические методы, такие как (непосредственная) инъекция свободных нуклеиновых кислот или биобаллистический перенос генов. Биобаллистический перенос генов (известный также как биобаллистическая бомбардировка частицами) представляет собой метод, разработанный в Корнельском университете, и позволяет вводить генный материал в ткани и клетки. Биобаллистический перенос генов, как правило, проводят с применением поверхностно-покрытых металлических частиц, таких как частицы золота или серебра, при этом клетки обстреливают этими частицами, покрытыми адсорбированной ДНК, с помощью генной пушки. Однако до сих пор не было подтверждено, что биобаллистический перенос генов эффективен при переносе РНК, вероятно, из-за ее быстрого разрушения. Кроме того, данные методы не пригодны для применения in vivo, что является причиной серьезных ограничений при внедрении их на практике.

Другой физический или физико-химический метод включает метод электропорации in vitro, который основан на использовании высоковольтного тока для обеспечения проницаемости клеточных мембран, что позволяет вводить новую ДНК или РНК в клетку. Таким образом, прочность клеточных стенок обычно понижают перед трансфекцией, применяя химические реагенты или проводя осторожное замораживание, при этом клетки становятся «электрокомпетентными». Если электрокомпетентные бактерии или клетки (например, эукариотические клетки) смешать вместе с ДНК (или РНК), то в клетку можно перенести плазмиду за счет электрического разряда, посредством которого ДНК (или РНК) переносится в клетки по ходу искрового разряда, пересекающего реакционную камеру.

Еще один альтернативный физический или физико-химический метод включает использование наноплексов (систем наночастип), липоплексов (липосомальных систем) либо использование полиплексов или катионных полимеров. Такие наноплексы (системы наночастип) основаны на применении полиакрилатов, полиамидов, полистирола, цианоакрилатов, полилактата (ПЛА), сополимера молочной и гликолевой кислот (ПМГК), полиэтиленгликоля и т.п., в качестве систем-носителей для транспорта нуклеиновых кислот в клетки и ткани. Липоплексы или липосомальные системы, как правило, основаны на использовании катионных липидов, которые способны имитировать клеточную мембрану. При этом положительно заряженные остатки липидов взаимодействуют с отрицательно заряженными остатками нуклеиновых кислот и таким образом обеспечивают слияние с клеточной мембраной. Липоплексы или липосомальные системы включают, например, хлорид N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония (ДОТМА), диолеоилфосфатидилэтаноламин (ДОФЭ), трифторацетат 2,3-диолеилокси-N-[2(сперминкарбоксамидо)этил]-N,N-диметил-1-пропанамина (ДОСПА), хлорид N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N-триметиламмония (ДОТА), 3-6eTa-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)карбамоил]холестерин (ДК-Хол), пара-этилдимеристоилфосфатидилхолин (ЭДМФХ) и т.п. Полиплексы (катионные полимеры), как правило, образуют комплекс с отрицательно заряженными нуклеиновыми кислотами, что приводит к конденсации нуклеиновых кислот, что, в свою очередь, защищает эти нуклеиновые кислоты от разрушения. Транспорт в клетки с использованием полиплексов (катионных полимеров), как правило, происходит в результате опосредованного рецепторами эндоцитоза. При этом ДНК связывается с отдельной молекулой, такой как трансферрин, например, через полиплекс-поли-L-лизин (ПLЛ), который связывается с поверхностным рецептором и индуцирует эндоцитоз. Полиплексы (катионные полимеры) включают, например, поли-b-лизин (ПLЛ), хитозан, полиэтиленимин (ПЭИ), полидиметиламиноэтилметакрилат (ПДМАЭМА), полиамидоамин (ПАА).

Другие известные физические или физико-химические методы переноса генов в клетки или организмы включают такие методы, как трансфекция, основанная на использовании вирусов. Прежде всего, в качестве носителей ДНК могут быть использованы ДНК-содержащие вирусы. Благодаря их инфекционным свойствам, такие вирусы отличаются очень высоким уровнем трансфекции. Обычно используемые вирусы генетически модифицируют таким способом, чтобы исключить образование функциональных инфекционных частиц в трансфектированной клетке. Однако, несмотря на эти меры предосторожности, риск неконтролируемого размножения введенных терапевтически активных генов и вирусных генов нельзя исключить, например, вследствие возможных явлений рекомбинации.

Более предпочтительным, в данном контексте, является использование так называемых транслокационных белков или доменов белковой трансдукции (ДБТ) для транспорта макромолекул в клетки и ткани. Транслокационные белки обозначают группу пептидов, обеспечивающих эффективный транспорт макромолекул между клетками (транслокационные белки), таких как ВИЧ tat, сложный локус антеннопедии (антеннопедия у Drosophila), ВПГ VP22 (вирус простого герпеса), ФРФ (фактор роста фибробластов) или лактоферрин, и т.п. Напротив, домены белковой трансдукции (ДБТ) обозначают группу пептидов, обеспечивающих перенос указанных белков и пептидов, ковалентно связанных с этими последовательностями, в клетку через клеточную мембрану (см. статью Leifert и Whitton, Translocatory proteins and protein transduction domains: a critical analysis of their biological effects and the underlying mechanisms. Molecular Therapy, т.8, No.1 (2003)). Общим у транслокационных белков и у ДБТ является основный участок, который является, главным образом, ответственным за транспорт гибридных пептидов, так как он способен связывать полианионы, такие как нуклеиновые кислоты. Кроме того, находясь в несвязанном состоянии, ДБТ могут действовать аналогично реагентам катионной трансфекции, по механизму рецептор-опосредованного ненасыщенного адсорбционного эндоцитоза. ДБТ, как правило, связываются с белками или пептидами для воздействия или усиления ответа цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) при введении вакцины, содержащей пептид (см. обзор: Melikov и Chernomordik, Arg₁nine-rich cell penetrating peptides: from endosomal uptake to nuclear delivery, Cell. Mol. Life Sci. (2005)).

Домены белковой трансдукции (ДБТ) иногда также обозначают термином «пептиды, проникающие в клетку» (ППК) из-за способности проникать через клеточную мембрану и таким образом влиять на транспорт (макро-)молекул в клетки. ППК представляют собой короткие пептиды и обычно характеризуются высоким содержанием основных аминокислот, а также длиной от 7 до 30 аминокислотных остатков. Макромолекулы, которые, как было установлено, могут переноситься в клетки с помощью ППК, включают пептиды, а также ДНК, короткие интерферирующие РНК (киРНК) или ПНК (пептидные нуклеиновые кислоты), при этом ДБТ обычно связаны с этими макромолекулами ковалентной связью, и трансфектируются в клетки. Несмотря на то, что пептиды, проникающие в клетки (ППК), могут с успехом использоваться в качестве посредников для внутриклеточной доставки множества молекул, представляющих интерес для фармакологии как in vitro, так и in vivo, механизмы, благодаря которым осуществляется захват клетками, остаются невыясненными. Группа ППК очень неоднородна и включает амфипатические спиральные пептиды, такие как транспортан, пенетратин, гидрофобные пептиды, такие как MTS, VP22, MAP, KALA, PpTG20, пролин-обогащенные пептиды, MPG-пептиды, Рер-1, L-олигомеры, кальцитонин-пептиды, или катионные гидрофильные, аргинин-обогащенные пептиды, включая аргинин-обогащенные ППК, которые являются посредниками при захвате клеткой ковалентных молекулярных конъюгатов за счет связывания с протеогликанами клетки, такими как домен трандукции белка ВИЧ-1 tat (см. обзор: Deshayes и др., Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics, Cell. Mol. Life Sci. (2005)). Прежде всего, аргинин-обогащенные ППК описаны как носители белков или ДНК, например, плазмидной ДНК, и т.п. для переноса их в клетки. Полиаргинины также могут применяться для транспорта (макро-)молекул в клетки, при этом обычно их длина составляет по крайней мере от 60 до 80 аминокислотных остатков (прежде всего аргинина), более типично, от 1000 до 15000 аминокислотных остатков, и таким образом, представляют собой высокомолекулярные соединения. Даже учитывая, что механизм захвата клетками для ППК в целом остается невыясненным, предполагается, что для полиаргинина механизмом захвата является эндоцитоз. Эндоцитоз представляет собой клеточный процесс, в результате которого макромолекулы могут проникать в клетку, не проходя через клеточную мембрану, при этом были предложены три различных механизма эндоцитоза (клатрин-зависимый эндоцитоз, кавеолин-зависимый эндоцитоз и/или Р-актин-зависимый эндоцитоз, см., например, обзор: Melikov и Chernomordik, Arg₁nine-rich cell penetrating peptides: from endosomal uptake to nuclear delivery, Cell. Mol. Life Sci. (2005)). He ссылаясь ни на одну из теорий, можно утверждать, что в процессе эндоцитоза макромолекула в комплексе с ППК сначала связывается с отрицательно заряженной поверхностью клетки (с глюкозаминогликанами (ГАГ), включая гепараны (Г)). Затем ППК-связанная макромолекула проникает в клетку за счет клатрин-зависимого эндоцитоза, кавеолин-зависимого эндоцитоза и/или F-актин-зависимого эндоцитоза, например, за счет замыкания мембраны вокруг ППК-связанной макромолекулы вне клетки. При этом образуется везикула, в которой содержится ППК-связанная макромолекула. За счет переноса с помощью поздних эндосом и/или аппарата Гольджи и/эндоплазматического ретикулума (ЭР) ППК-связанная макромолекула переносится в цитоплазму, при этом данная стадия может включать ППК-индуцируемое открытие временных пор в липидном бислое. В другом варианте комплекс макромолекулы с ППК может переноситься в другие компартменты клетки, например, в эндосому, в зависимости от требуемого типа воздействия с определенной целью. Например, рецепторы TLR-7 и TLR-8, расположены в эндосоме. Таким образом, трансфекция клеток иммуностимулирующими РНК, которые, например, могут представлять собой лиганды Toll-подобных рецепторов (TLR), выбранных из лигандов TLR1-TLR13 (Toll-подобные рецепторы: TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12 или TLR13), может приводить к переносу в эндосомы и (в зависимости специфического взаимодействия и компонентов взаимодействия), например, к иммуностимуляции РНК-лигандом.

Пептиды, проникающие в клетки (ППК), как определено выше, известны в данной области техники. Однако, эти ППК (в качестве носителей) были использованы для транспорта пептидов, белков и ДНК, т.е. в качестве «нагрузки», при этом ППК обычно связаны с «нагрузкой» ковалентной связью. Напротив, было установлено, что клеточный транспорт РНК с использованием ППК наблюдается только в очень ограниченном числе случаев, прежде всего, для коротких последовательностей РНК, например, для двухцепочечных киРНК. В качестве примера в статье Futaki и др. (The Journal of Biological Chemistry, т.276, No.8, сс.5836-5840, (2001)) описано использование в качестве носителей олигопептидов (Arg)_n, длина которых составляет 4-16 аминокислотных остатков, для переноса пептидов in vitro в качестве «нагрузки», при этом пептиды-носители связаны ковалентной связью с переносимыми пептидами. Оптимальные условия переноса были установлены для пептидов (Arg)_n, содержащих 6 или 8 остатков аргинина, соответственно.

Трансмембранный транспорт пептидов или пептидомиметиков с помощью ППК также был описан в работах Deshayes и др. (2005 г. см. выше), включая использование олигопептидов Arg₇ и Arg₉ для переноса in vitro пептидов-«нагрузки» и переноса in vivo белков-«нагрузки», таких как циклоспорин или каталаза.

Для трансфекции клеток макромолекулами, такими как ДНК, пептиды или белки, были использованы высокомолекулярные пептиды, такие как поли-L-аргинины (обычно молекулярная масса которых составляет, например, от приблизительно 5000 Да до 15 кДа) или поли-L-лизины (обычно молекулярная масса которых составляет приблизительно 54 кДа), а также высокомолекулярный ПЭИ (полиэтиленимин) (обычно молекулярная масса которого составляет приблизительно 25 кДа), как описано в данном уровне техники (см. также Bettinger и др.. Nucleic Acids Research, т.29, No. 18 (2001)). Однако было установлено, что высокомолекулярный поли-L-лизин и ПЭИ неэффективны в качестве молекул-носителей. Кроме того, при использовании высокомолекулярных поли-L-аргининов при высокой концентрации наблюдаются токсические эффекты, приводящие к активации системы комплемента. Таким образом, были предприняты попытки разработки низкомолекулярных трансфектирующих агентов, таких как, например, низкомолекулярные полиаргинины. Однако, такие низкомолекулярные полиаргинины, как правило, характеризуются низкой стабильностью комплекса носитель-«нагрузка», т.е. комплекса, включающего, например, полиаргинин в качестве носителя и молекулу ДНК в качестве «нагрузки». Так, например, в статье McKenzie и др., A potent new class of reductively activated peptide gene delivery agents, The Journal of Biological Chemistry, т.274, No.14. (2000)) описаны попытки увеличить стабильность комплексов пептид-ДНК, за счет сшивки этих пептидов и ДНК глутаровым альдегидом через образование Шиффова основания. Однако такая сшивка приводит к исключительно низкой диссоциации комплекса в клетке и, следовательно, исключительно низкой экспрессии кодируемого белка в течение времени. Для решения этой проблемы (McKenzie и др. (2000) см. выше) вводили остатки цистеина в ППК-носитель, которые стабилизируют комплекс за счет образования дисульфидных связей между ППК и ДНК. В результате трансфекции эти дисульфидные связи разрушаются в восстанавливающих условиях внутри клетки, что приводит к увеличению экспрессии кодируемых пептидов. Однако такая сшивка является трудоемким процессом и может даже приводить к дополнительным нежелательным модификациям ДНК.

Кроме того, низкомолекулярный ПЭИ (например, обычно молекулярная масса которого составляет приблизительно 2000 Да) и низкомолекулярные поли-L-лизины (например, обычно молекулярная масса которых составляет приблизительно 3400 Да) могут использоваться для трансфекции таких макромолекул, как упомянуто выше. Однако даже, несмотря на то, что при использовании низкомолекулярного ПЭИ или поли-L-лизина в данных экспериментах наблюдается улучшенная трансфекция, уровень экспрессии не детектируется из-за образования исключительно устойчивых комплексов этих молекул-носителей с ДНК. В результате было установлено, что при использовании таких молекул в качестве носителей, не наблюдается диссоциация ДНК из комплекса, которая является необходимой стадией для трансляции и экспрессии кодируемого белка (см. статью Bettinger и др. (2001) см. выше).

Перенос ДНК с помощью ППК также был описан в статье Niidome и др., The Journal of Biological Chemistry, т.272, No.24, сс.15307-15312. (1997). В указанной статье описано использование ППК, прежде всего катионных альфа-спиральных пептидов, содержание аргинина в которых составляет 25%, а длина от 12 до 24 аминокислотных остатков, соответственно, для переноса плазмидной ДНК, в качестве «нагрузки». В результате было найдено, что длинные и/или гидрофобные пептиды могут прочно связывать ДНК и эффективно переносить ДНК в клетки. Кроме того, в статье Niidome и др., Bioconjugate Chem., 10, 773-780 (1999) было описано, что пептиды, длина которых составляет от 16 до 17 аминокислотных остатков, проявляют чрезвычайно высокую эффективность для переноса плазмидной ДНК. Однако было установлено, что в случае использования коротких пептидов (например, приблизительно 12 аминокислотных остатков) в качестве ППК, эффективность трансфекции ДНК в клетки значительно снижалась.

С целью повышения эффективности клеточной трансфекции коротких аргининовых молекул, в статье Futaki и др., Bioconjugate Chem. 12, 1005-1011 (2001) описано использование стеарилированных олигопептидов (Arg)_n, длина которых составляет 4-16 аминокислотных остатков. Эти олигопептиды использовали в экспериментах по трансфекции при сравнении с нестеарилированными олигопептидами (Arg)_n, длина которых составляет 4-16 аминокислотных остатков, и полиаргинином (с молекулярной массой 5000-15000 Да), для переноса in vitro плазмидной ДНК, кодирующей люциферазу. Таким образом, пептидные носители, использованные для трансфекции, смешивали с плазмидной ДНК, при этом образуется комплекс носитель/нагрузка. Оптимальную эффективность переноса была установлена для стеарилированного (Arg)_n, длина которого составляет 8 остатков аргинина, при этом было установлено, что при использовании аргининовых пептидов, содержащих 6-7 и 9-15 остатков аргинина, наблюдается значительное снижение активности клеточного транспорта. Кроме того, при использовании нестеарилированных аргининов и полиаргинина, наблюдается потеря транспортной активности. В статье Futaki и др. (2001) см. выше) было установлено, что наблюдаемое различие в эффективности трансфекции для стеарилированных и нестеарилированных пептидных носителей, таким образом, можно объяснить присутствием липидных остатков, которые значительно изменяют химические свойства использованных в этих экспериментах ППК.

Согласно статье Kim и др.. Basic peptide system for efficient delivery of foreign genes, Biochimica et Biophysica Acta, 1640, 129-136. (2003), короткие аргининовые пептидные носители, такие как (Arg)₉-(Arg)₁₅, можно использовать для комплексообразования и клеточной трансфекции ДНК, кодирующей зеленый флуоресцентный белок PEGFP-N3. При использовании аргининовых пептидов (Arg)₉-(Arg)₁₅, оптимальные результаты были получены при использовании (Arg)₁₅, при этом было установлено, что эффективность клеточной трансфекции повышается в ряду от (Arg)₉ до (Arg)₁₅. Эти результаты показывают, что оптимальные транспортные свойства для трансфекции ДНК в клетки достигаются при использовании (Arg)_n пептидного носителя, при этом n должно быть намного больше 15. Однако использование коротких аргининовых пептидов для трансфекции была описана только для молекул ДНК в качестве переносимого компонента в статье Kim и др. (2003 г. см. выше).

Клетки также можно трансфектировать с использованием ППК в комбинации с РНК. Однако только незначительное число реализуемых на практике примеров было описано для клеточного переноса РНК, по-видимому, из-за ее быстрой деградации и низкой стабильности в составе комплексов. Таким образом, было установлено, что применение трансфекции РНК с использованием ППК ограничено лишь использованием более стабильных двухцепочечных РНК, таких как киРНК. В качестве примера в статье Tonges и др., RNA, 12: 1431-1438 (2006) описано использование стеарилированного октааргинина (Arg)₈ для переноса in vitro двухцепочечной короткой киРНК в нервные клетки гиппокампуса, при этом стеарилированный октааргинин (Arg)₈ образовывал комплекс с киРНК. На основании результатов Tonges и др. (2006 г. см. выше) было установлено, что стеариловый компонент пептидных носителей является обязательным при переносе киРНК или переносе других молекул РНК.

В статье Veldhoen и др., Cellular delivery of small interfering RNA by a non-covalently attached cell penetrating peptide: quantitative analysis of uptake and biological effect, Nucleic Acids Research, (2006) также описано использование специфических ППК в нековалентных комплексах для трансфекции клеток двухцепочечными короткими киРНК. Для указанных экспериментов использовали пептиды: MPGalpha (Ac-GALFLAFLAAALSLMGLWSQPKKKRKV-Cya) и MPGalpha-mNLS (Ac-GALFLAFLAAALSLMGLWSQPKSKRKV-Cya). Эти специфические пептиды были дополнительно модифицированы при ацетилировании (Ас) N-концевого фрагмента и при включении цистамидного остатка в С-концевой фрагмент. Авторы установили, что происходит перенос двухцепочечной киРНК, содержащей приблизительно от 18 до 40 нуклеотидов, в клетки с использованием упомянутых ранее пептидных носителей.

Суммируя сказанное выше, можно заключить, что использование ППК или других пептидных носителей для клеточного транспорта макромолекул, было, в основном, описано для пептидов и молекул ДНК. И только в нескольких специальных публикациях описана способность двухцепочечной киРНК проникать в клетку.

Перенос РНК представляет собой важный инструмент современной молекулярной медицины и характеризуется преимуществом по сравнению с трансфекцией клеток с помощью ДНК, т.к. использование молекул ДНК может вызывать серьезные проблемы. Например, применение молекул ДНК связано с риском интегрирования ДНК в геном хозяина. Интегрирование чужеродной ДНК в геном хозяина может оказывать влияние на экспрессию генов хозяина и, возможно, индуцировать экспрессию онкогена или разрушение гена супрессии опухоли. Ген, а следовательно, генный продукт, который необходим для хозяина, также может инактивироваться в результате интеграции чужеродной ДНК в кодирующую область этого гена. Существует особая опасность в случае, если интегрирование ДНК происходит в ген, который принимает участие в регуляции клеточного роста. В этом случае клетка хозяина может перейти в дегенеративное состояние, что приводит к раку или образованию опухоли. Такая нежелательная интеграция в ДНК может оказаться даже более проблематичной, если ДНК, трансфектированная в клетку, содержит сильный промотор, такой как промотор вируса ЦМВ. Интеграция таких промоторов в геном обработанных клеток может приводить к нежелательным изменениям в регуляции экспрессии гена в клетке. Дополнительный недостаток заключается в том, что молекулы ДНК остаются в клеточном ядре в течение длительного времени, либо в виде эписомы, или, как было упомянуто, интегрируются в геном хозяина. Это явление приводит как к продуцированию трансгенного белка, которое не ограничено во времени или такое продуцирование нельзя ограничить во время, так и к опасности связанной с этим толерантности к этому трансгенному белку. Выработка антител против ДНК, описанная в статье Gilkeson и др., J. Clin. Invest., 95, 1398-1402 (1995), и развитие аутоиммунных заболеваний также дополнительно могут быть связаны с введением ДНК. Все эти перечисленные риски связаны с применением ДНК. Напротив, риски отсутствуют, если вместо ДНК использовать РНК, прежде всего, мРНК. Например, мРНК не интегрирует в геном хозяина, и не требуется использовать вирусные последовательности, такие как промоторы и т.п., для эффективной транскрипции, и т.п. Недостатки использования РНК могут быть связаны с ее нестабильностью по сравнению с ДНК (нестабильность РНК связана, прежде всего, с деградирующими РНК ферментами, так называемыми РНКазами (рибонуклеазами), но также с многочисленными другими процессами, которые снижают стабильность РНК. Однако, способы стабилизации РНК, тем не менее, известны в уровне техники, например, описаны в патентах WO 03/051401, WO 02/098443, WO 99/14346, EP-A-1083232, US 5580859 и US 6214804. Были также разработаны способы для защиты РНК от деградации рибонуклеазами, либо с использованием липосом (см. статью: Martinon и др., Eur. J. ImmunoL, 23, 1719-1722 (1993)) или при внутрицитозольном введении in vivo нуклеиновой кислоты с использованием баллистического устройства (генная пушка) (см. статью: Vassilev и др., Vaccine. 19, 2012-2019 (2001)).

Так как молекулы РНК сами по себе обладают лучшими свойствами по сравнению с ДНК, как обсуждалось выше, цель настоящего изобретения заключается в том, чтобы обеспечить пригодный и эффективный носитель для переноса РНК в клетки. В соответствии с этим, в настоящем изобретении предлагается эффективный способ трансфекции РНК в клетки.

Цель настоящего изобретения осуществляется за счет вариантов осуществления настоящего изобретения, как определено в формуле изобретения. Прежде всего, указанная выше задача решается при использовании РНК в составе комплекса, содержащего по крайней мере одну РНК, предпочтительно мРНК, и один или более олигопептидов, при этом, длина по крайней мере одного олигопептида составляет от 8 до 15 аминокислотных остатков, и при этом по крайней мере один олигопептид содержит 1 остатков Arg, m остатков Lys, n остатков His, о остатков Orn и х остатков Хаа, расположенных в любом порядке, при этом по крайней мере один олигопептид характеризуется общей формулой:

( A r g ) 1 ( L y s ) m ( H i s ) n ( O r n ) o ( X a a ) x                                 ( ф о р м у л а     I )

где

l+m+n+o+x=8-15, и

l, m, n или о независимо друг от друга могут равняться любому числу, выбранному из ряда: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15, при условии, что суммарное содержание Arg, Lys, His и Orn составляет, по крайней мере 50%, например, по крайней мере 60% или 70% в расчете на содержание всех аминокислот в олигопептиде; и Хаа может означать любую аминокислоту, выбранную из группы природных или не природных аминокислот, за исключением Arg, Lys, His или Orn; и х может равняться любому числу, выбранному из ряда: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8, при условии, что суммарное содержание Хаа не превышает 50%, например, не более 40% или 30%, в расчете на содержание всех аминокислот в олигопептиде.

В контексте настоящего изобретения, термин «РНК в составе комплекса» означает РНК, как определено в настоящем контексте, предпочтительно мРНК, которая образует комплекс с одним или более олигопептидов общей формулы (Arg)₁(Lys)_m(His)_n(Orn)_o(Xaa)_x, причем образуется нековалентный комплекс РНК и олигопептида(ов). В данном контексте «нековалентный» обозначает, что происходит обратимая ассоциация РНК и олигопептида за счет нековалентных взаимодействий между этими молекулами, при этом молекулы ассоциируют друг с другом по любому типу электронных взаимодействий, в отличие от ковалентной связи, например, за счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий, т.е. слабого электростатического притяжения за счет неспецифических сил притяжения между молекулами, входящими в комплекс. Ассоциация РНК по крайней мере с одним олигопептидом, находится в равновесии с диссоциацией комплекса. Не ссылаясь на какую-либо теорию, можно предположить, что внутри клетки равновесие сдвигается в сторону диссоциации РНК и олигопептида(ов).

По крайней мере, один олигопептид в составе комплекса с РНК, по настоящему изобретению, содержит от 8 до 15 аминокислотных остатков, предпочтительно от 8 до 14, от 8 до 13, от 8 до 12, от 9 до 12 или от 9 до 11 аминокислотных остатков, и более предпочтительно, от 8 до 10, от 9 до 11, от 10 до 12, от 11 до 13, от 12 до 14 или от 13 до 15 аминокислотных остатков, или даже более предпочтительно, выбран из пептидов указанной выше формулы, включающих 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислотных остатков.

Олигопептид в составе комплекса с РНК, по настоящему изобретению, характеризуется общей формулой (Arg)₁(Lys)_m(His)_n(Orn)_o(Xaa)_x, как определено выше, при этом l+m+n+o+x=8-15, и l, m, n или о, независимо друг от друга, могут равняться числу, выбранному из: 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15, или находится в любом диапазоне указанных двух значений, при условии, что общее содержание (основных аминокислотных остатков) Arg, Lys, His и/или Orn составляет по крайней мере 50% (например, по крайней мерее, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 или 59%), по крайней мере 60% (например, по крайней мере 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 или 69%), по крайней мере 70% (например по крайней мере 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77 78 или 79%), по крайней мере 80% (например по крайней мере 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 или 89%), по крайней мере 90% (например, по крайней мере 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%), или даже 100% в расчете на содержание всех аминокислотных остатков в составе олигопептида в составе комплекса с РНК по настоящему изобретению. Термины «Arg, Lys, His и Orn (в трехбуквенном коде)» обозначают аминокислоты аргинин, лизин, гистидин и орнитин, соответственно. В данном контексте, орнитин представляет собой аминокислоту формулы NH₂-CH₂-CH₂-CH₂-CHNH₂-СООН. Орнитин был искусственно включен в положение 21 олигопептида и не относится к природным 20 аминокислотам, то есть орнитин не кодируется ДНК, и, соответственно, не используется в первичном белковом синтезе. Однако, орнитин образуется в результате ферментативной реакции, причем, из L-аргинина. Было найдено, что орнитин не является частью генетического кода, т.к. полипептиды, содержащие незащищенные остатки орнитина, подвергаются спонтанной лактамизации. Орнитин относят к основным аминокислотам, т.к. он является одним из продуктов реакции фермента аргиназы с L-аргинином с образованием мочевины.

Согласно еще одному предпочтительному варианту, (отдельные) аминокислотные остатки в составе олигопептида в составе комплекса с РНК, по настоящему изобретению, общей формулы ( A r g ) 1 ( L y s ) m ( H i s ) n ( O r n ) o ( X a a ) x                                 ( ф о р м у л а     I ) , как было показано выше, могут встречаться с любой частотой, как определено выше в общей формуле, т.е. каждая основная аминокислота (так же, как Хаа) может встречаться в определенной выше общей формуле с определенными выше частотой или в диапазонах, при этом любой диапазон можно ограничивать двумя значениями, как определено выше. Однако, прежде всего, предпочтительно, чтобы содержание основной аминокислоты Arg в определенной выше общей формуле составляло, по крайней мере 10%, более предпочтительно по крайней мере 20%, даже более предпочтительно по крайней мере 30%, 40% или даже 50%, даже более предпочтительно по крайней мере 60%, 70%, 80% 90% или даже 100%, в расчете на общую формулу. Согласно другому предпочтительному варианту, содержание основной аминокислоты Lys в определенной выше общей формуле составляет по крайней мере 10%, более предпочтительно по крайней мере 20%, даже более предпочтительно по крайней мере 30%, 40% или даже 50%, даже более предпочтительно по крайней мере 60%, 70%, 80% 90% или даже 100%, в расчете на общую формулу. Согласно еще одному предпочтительному варианту, содержание основной аминокислоты His в определенной выше общей формуле составляет по крайней мере 10%, более предпочтительно по крайней мере 20%, даже более предпочтительно по крайней мере 30%, 40% или даже 50%, даже более предпочтительно по крайней мере 60%, 70%, 80% 90% или даже 100%, в расчете на общую формулу. Согласно еще одному предпочтительному варианту, содержание основной аминокислоты Orn в определенной выше общей формуле составляет по крайней мере 10%, более предпочтительно по крайней мере 20%, даже более предпочтительно по крайней мере 30%, 40% или даже 50%, даже более предпочтительно по крайней мере 60%, 70%, 80% 90% или даже 100%, в расчете на общую формулу. Любое из указанных выше значений содержания, величины или диапазона величин для основных аминокислот Arg, Lys, His и/или Orn, как определено выше, также можно комбинировать друг с другом, причем, предпочтительно, общее содержание всех основных аминокислот в составе олигопептида в составе комплекса с РНК, по настоящему изобретению, должно составлять по крайней мере 50% (по крайней мере, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58 или 59%), по крайней мере 60% (по крайней мере, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68 или 69%), по крайней мере 70% (по крайней мере, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 или 79%), по крайней мере 80% (по крайней мере, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 или 89%), по крайней мере 90% (по крайней мере 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%), или даже 100%, как было определено ранее.

Аминокислоты в указанной выше формуле (Arg)₁(Lys)_m(His)_n(Orn)_o(Xaa)_x, т.е. Arg, Lys, His и/или Orn, можно дополнительно выбирать из природных аминокислот Arg, Lys, His и Orn или неприродных аминокислот, производных этих аминокислот. В качестве неприродных аминокислот, производных аминокислот Arg, Lys, His и Orn, можно использовать любые известные производные этих аминокислот, из которых в результате химической модификации получают производные, которые не являются токсичными для клеток или организмов, при условии их включения в указанный выше олигопептид. (Такие производные аминокислот выпускаются различными фирмами, см., например, Sigma Aldrich (см. ссылку http://www.sigmaaldrich.com).

Кроме того, олигопептид в составе комплекса с РНК, по настоящему изобретению, может содержать аминокислотный остаток Хаа в указанной выше общей формуле (Arg)₁(Lys)_m(His)_n(Orn)_o(Xaa)_x, который можно выбрать из любых аминокислот, включающих природные или неприродные аминокислоты, за исключением Arg, Lys, His или Orn. Предпочтительно, Хаа можно выбрать, но, не ограничиваясь только ими, из природных (и гидрофобных) аминокислот, т.е. аминокислот, которые содержат нейтральные (и гидрофобные) боковые цепи, таких как аланин (Ala), валин (Val), лейцин (Leu), изолейцин (Ile), пролин (Pro), триптофан (Trp), фенилаланин (Phe) или метионин (Met), и/или из природных (и полярных) аминокислот, т.е. аминокислот, которые содержат нейтральные (и полярные) боковые цепи, таких как глицин (Gly), серии (Ser), треонин (Thr), тирозин (Туг), цистеин (Cys), аспарагин (Asn) или глутамин (Glu), и/или из природных кислотных аминокислот, т.е. аминокислот, которые содержат кислотные боковые группы, таких как аспарагиновая кислота (Asp) или глутаминовая кислота (Glu). Предпочтительно, олигопептид в составе комплекса с РНК, по настоящему изобретению, может содержать аминокислотный остаток Хаа в указанной выше общей формуле (Arg)₁(Lys)_m(His)_n(Orn)_o(Xaa)_x, который выбран из аминокислот, не содержащих кислотную боковую цепь. Даже более предпочтительно, Хаа в общей формуле (Arg)₁(Lys)_m(His)_n(Orn)_o(Xaa)_x выбирают из аминокислот, содержащих нейтральную боковую цепь, т.е. из аминокислот, содержащих в составе нейтральную (и гидрофобную) боковую цепь и/или из аминокислот, содержащих нейтральную (и полярную) боковую цепь, как было определено выше. Кроме того, в качестве Хаа в указанной выше общей формуле (Arg)₁(Lys)_m(His)_n(Orn)_o(Xaa)_x, можно использовать любые известные производные аминокислот, т.е. аминокислоты, из которых в результате химической модификации получены производные, которые не являются токсичными для клеток или организмов, при условии их включения в указанный выше олигопептид. (Такие производные аминокислот выпускаются различными фирмами, см., например, Sigma Aldrich (см. ссылку http://www.sigmaaldrich.com).

Хаа, как правило, содержится в указанной в