Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, кассета экспрессии, клетка, продуцирующая биосенсор, выделенный флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный биосенсор, оперативно слитая с нуклеиновой кислотой, кодирующей сигнал внутриклеточной локализации

Выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, кассета экспрессии, клетка, продуцирующая биосенсор, выделенный флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая флуоресцентный биосенсор, оперативно слитая с нуклеиновой кислотой, кодирующей сигнал внутриклеточной локализации

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Предлагаемое изобретение относится в основном к области биологии и химии. В частности, изобретение направлено на биосенсоры для детекции пероксида водорода, сконструированные на основе флуоресцентных белков.

Флуоресцентные белки семейства GFP (Green Fluorescent Protein, GFP), включая собственно GFP из медузы Aequorea victoria (avGFP), его мутанты и гомологи, сегодня широко известны благодаря их интенсивному использованию в качестве флуоресцентных маркеров in vivo в биомедицинских исследованиях, что детально рассмотрено Lippincott-Schwartz и Patterson в Science (2003) 300(5616):87-91 и Chudakov et al. (Physiol Rev 2010 Jul; 90(3):1103-63).

Флуоресцентные белки способны к флуоресценции при облучением светом подходящей длины волны. Флуоресцентные свойства этих белков обусловлены взаимодействием двух или более аминокислотных остатков, формирующих хромофор, а не флуоресценцией какого-либо одного аминокислотного остатка.

GFP гидромедузы Aequorea aequorea (синоним A. victoria), был описан Johnson et al. в J Cell Comp Physiol.(1962), 60:85-104, как часть биолюминесцентной системы медузы, где GFP играет роль вторичного эммитера, преобразовывающего синий свет от фотобелка экворина в зеленый свет, а

кДНК, кодирующая A. victoria GFP была клонирована Prasher et al. (Gene (1992), 111(2):229-33). Оказалось, что этот ген может быть гетерологично экспрессирован в практически любом организме благодаря уникальной способности GFP автокаталитически образовывать хромофор (Chalfie et al., Science 263 (1994), 802-805). Эти сведения открыли широкие перспективы для использования GFP в клеточной биологи, в качестве генетически кодируемой флуоресцирующей метки.

GFP был использован в широком спектре приложений, включая исследование экспрессии генов и локализацию белков (Chalfie et al.. Science 263 (1994), 802-805, and Heim et al. in Proc. Nat. Acad. Sci. (1994), 91: 12501-12504), как инструмент для визуализации внутриклеточного распределения органелл (Rizzuto et al., Curr. Biology (1995), 5: 635-642), для визуализации транспорта белков по секреторному пути (Kaether and Gerdes, FEBS Letters (1995), 369: 267-271).

Были проведены многочисленные, исследования для улучшения свойств avGFP (Aequorea victoria GFP) и для получения вариантов GFP, пригодных и оптимизированных для различных исследовательских целей. Была проведена оптимизация генетического кода avGFP (codon usage) для повышения уровня экспрессии в клетках млекопитающих ("гуманизированный" GFP, Haas, et al.. Current Biology (1996), 6: 315-324; Yang, et al., Nucleic Acids Research (1996), 24: 4592-4593). Были получены различные мутанты GFP, в том числе "усиленный зеленый флуоресцентный белок" (EGFP), имеющий две аминокислотные замены: F64L и S65T (Heim et al., Nature 373 (1995), 663-664). Другие мутанты являются синим, голубым и желто-зеленым спектральными вариантами avGFP и содержат замены аминокислотных остатков, формирующих хромофор, и/или остатков, формирующих окружение хромофора.

В 1999 г., гомологи GFP были клонированы из небиолюминесцентных видов Anthozoa (Matz et al., Nature Biotechnol. (1999), 17: 969-973). Это открытие продемонстрировало, что эти белки не являются обязательно компонентом биолюминесцентной системы.СРР-подобные белки из Anthozoa обладали большим спектральным разнообразием и включали циановые, зеленые, желтые, красные флуоресцентные белки и фиолетово-синие не-флуоресцентные хромопротеины (CPs) (Matz et al., Bioessays (2002), 24(10):953-959). В дальнейшем кДНК GFP-подобных белков были клонированы из ряда гидроидных медуз и из копепод (Shagin et al., Mol Biol Evol. (2004), 21(5):841-850). Сегодня семейство GFP-подобных белков включает сотни флуоресцентных и окрашенных гомологов GFP. Сходство этих белков с GFP варьирует от 80-90% до менее, чем 25% идентичности аминокислотной последовательности.

Были получены кристаллические структура avGFP дикого типа, GFP S65T мутанта и ряда гомологов GFP (Ormo et al. Science (1996) 273: 1392-1395; Wall et al. Nat Stmct Biol (2000), 7: 1133-1138; Yarbrough et al. Proc Nati Acad Sci U S A (2001) 98: 462-467; Prescott et al. Structure (Camb) (2003), 11: 275-284; Petersen et al. J Biol Chem (2003), 278: 44626-44631; Wilmann et al. J Biol Chem (2005), 280: 2401-2404; Remington et al. Biochemistry (2005), 44, 202-212; Quillin et al. Biochemistry (2005), 44: 5774-5787). Было постулировано, что все члены семейства обладают общей 3D структурой (GFP-подобным доменом), представляющей собой так называемый "бочонок" из 11 бета-слоев, образующих компактную встречно-параллельную структуру, внутри которой располагается альфа-спираль, содержащая хромофор. Хромофор формируется внутри GFP-подобного домена путем окислительной циклизации трех консервативных аминокислотных остатков в центральном регионе альфа-спирали (Cody et al., Biochemistry (1993) 32, 1212-1218). Положения аминокислотных остатков, формирующих хромофор, соответствует Ser65-Tyr66-Gly67 региону avGFP. Эти аминокислотные остатки легко могут быть идентифицированы у любого GFP-подобного белка путем выравнивания его последовательности с последовательностью avGFP.

Флуоресцентные белки представляют собой уникальное семейство структурно родственных белков, которые способны формировать хромофор автокаталитически без привлечения внешних субстратов или кофакторов. Под действием индуцирующего света, хромофор производит флуоресценцию, легко детектируемую с помощью современного лабораторного оборудования (спектрофлуориметр, флуоресцентный микроскоп, флуорес-центно-активируемый клеточный сортер, планшетный флуориметр).

Процесс автокаталитического формирования хромофора белков с различными спектральными свойствами подробно описан в ряде статей и включает несколько химических реакций (Heim et al. Proc Nati Acad Sci USA. 1994; 91: 12501-12504; Ormo et al. Science. 1996;273:1392-1395; Yang et al. Nat Biotechnol. 1996; 14:1246-1251; Brejc et al. J. Proc Nati Acad Sci USA. 1997; 94: 2306-2311; Palm et al. Nat Struct Biol. 1997;4:361-365; Gurskaya et al., BMC Biochem. 2001; 2:6; Gross et al. Proc Nati Acad Sci USA. 2000; 97:11990-11995; Wall et al. Nat Struct Biol. 2000; 7:1133-1138; Yarbrough et al., J. Proc Nati Acad Sci USA. 2001;98:462-467; Pakhomov, A. A. and Mar-tynov, V. I. Chem. Biol. 2008, 15, 755- 764; Quillinet al. (2005) Biochemistry 44, 5774-5787; Yampolsky et al. (2005) Biochemistry 44, 5788- 5793; Shu et al. (2006) Biochemistry 45, 9639- 9647; Kikuchi et al. (2008) Biochemistry 47, 11573-11580; Yampolsky et al., Biochemistry, 2009, 48 (33), pp 8077-8082).

GFP-подобные белки широко используют для создания генетически-кодируемых биосенсоров. Исследование внутриклеточных процессов с помощью таких генетически кодируемых биосенсоров становятся все более популярным, так как только такие сенсоры могут дать информацию об изменении исследуемого параметра.непосредственно в живой системе. Такие биосенсоры востребованы как в фундаментальных исследованиях сигнальных путей организма, так и при тестировании токсических и лекарственных препаратов на модельных клеточных линиях или организмах. В сравнении с химическими и физическими методами регистрации биологически активных субстанций биосенсорами, требующими экзогенно добавляемых красителей, субстратов или кофакторов, генетически кодируемые нанобиосенсоры относятся к классу;, безреагентных и многоразовых сенсоров. Использование флуоресцентных белков в качестве передатчиков информации стало наиболее эффективным подходом к разработке генетически-кодируемых сенсоров.

Биосенсоры на основе флуоресцентных белков представляют собой химерные белки, в состав которых входит сенсорный домен - белковый домен, чувствительный к изменению определенного параметра клетки, например, изменению концентрации какого-либо иона или молекулы (ионов кальция, перекиси водорода, ионов водорода и т.д.). В качестве сигнальной части биосенсора используют GFP-подобные белки или их варианты, подвергнутые круговой пермутации (Suslova and Chudakov, Trends Biotechnol. 23(12) (2005), 605-13; Griesbeck, Curr Opin NeurobioL, 2004, v.14(5), pp.636-641; Bunt and Wouters, Int Rev CytoL, 2004, v.237, pp.205-277).

Создание пермутированных GFP-подобных белков необходимо для увеличения подвижности хромофорного окружения и, следовательно, для большей лабильности спектральных свойств белка. Круговая пермутация флуоресцентных белков описана Topell S. и Glockshuber R. (Methods in Molecular Biology. 183, 31-48; 2002). Например, для круговой пермутации avGFP в его первичную структуру вносится разрыв в область между 144 и 149 аминокислотами, нативные N- и С - концы совмещаются при помощи полипептидного линкера. Новые N- и С - концы находятся в непосредственной близости от хромофора и могут влиять на его микроокружение. Круговая пермутация производится.на уровне нуклеиновой кислоты путем оперативного сшивания 3'- и 5'- концов нуклеотидной последовательности, кодирующей флуоресцентный белок, и внесения разрыва в последовательность между кодонами, кодирующими новые N и С - концевые аминокислоты. Методы для получения таких конструкций хорошо известны специалистам в данной области.

В результате круговой пермутации кпфб приобретает способность реагировать на конформационные перестройки в области новых N и С - концов изменением спектра флуоресценции (сенсоры с использованием обычных флуоресцентных белков оказались малочувствительными). Эффективность биосенсоров на основе кпфб, полученных из avGFP была продемонстрирована на примере сенсора на ионы кальция (Nagai et al, Proc Nati Acad Sci USA. 98(6) (2001), 197-202). кпфб был так же использован для изготовления сенсора на пероксид водорода HyPer (Belousov et al., Nature Method.4, 281-286; 2006).

HyPer представляет собой химерный белок, состоящий из регуляторного домена белка OxyR E.coli, реагирующего с пероксидом водорода и интегрированного в пептидную цепь OxyR пермутированного желтого флуорес-центного белка cpYFP (рис.1). HyPer представляет собой конструкцию, в которой cpYFP соединен с двумя^: фрагментами чувствительного к H₂O₂ домена OxyR посредством коротких пептидных линкеров. Нуклеотидные последовательности, кодирующие фрагменты белка OxyR и cpYFP оперативно сшиты между собой с использованием линкерных последовательностей. Линкерные последовательности - нуклеотидные последовательности, кодирующие одну или несколько аминокислот, используются для повышения подвижности частей химерного белка относительно друг друга и способствуют его лучшему фолдированию (формированию правильной 3D-структуры).

Транскрипционный фактор Е.coli OxyR активирует экспрессию ряда генов в ответ на увеличение концентрации H₂O₂. OxyR состоит из двух доменов, различающихся функционально. N-концевой домен (первые 80 аминокислот) образует ДНК-связывающий участок, в то время как С-концевой домен (81 - 305 аминокислот) выполняет регуляторную функцию и способствует олигомеризации белка (Choi et al., Cell. 105, 103 - 113;2001). В присутствии Нг02 происходит образование дисульфидной связи между цис-теиновыми остатками Cys-199 и Cys-208 OxyR белка, что приводит к кон-формационным изменениям всего регуляторного домена OxyR (Belousov et al., Nature Method.4, 281 - 286; 2006).

HyPer является уникальным инструментом, позволяющим анализировать изменение концентрации перекиси водорода внутри живых клеток. Перекись водорода (H₂O₂) - важная сигнальная молекуля, ответственная за включение ряда внутриклеточных каскадов (Yoshizumi et al, J Biol Chem. 2000, V. 275(16), pp.11706-11712; Abe et al, J Biol Chem. 1996, V. 271(28), pp.16586-16590; Schreck et al, EMBO J. 1991, V. 10(8), pp.2247-2258; Meyer et al, EMBO J. 1993, V. 12(5), pp.2005-2015). Многие внешние стимулы вызывают внутриклеточную продукцию H₂O₂, которая в свою очередь приводит к активации белковых каскадов. При появлении перекиси водорода в окружающей HyPer среде, происходит окисление домена OxyR и изменение его конформации, которое в свою очередь вызывает изменение спектральных характеристик флуоресцентного белка. Эти изменения могут быть зарегистрированы с помощью визуального скрининга, спектрофото-метрии, спектрофлуориметрии, флуоресцентной микроскопии, с помощью FACS или другим общепринятым способом для регистрации спектральных характеристик флуоресценции. Через некоторое время происходит восстановление биосенсора за счет работы клеточных системам, восстанавливающих дисульфидные связи в домене OxyR. Восстановление OxyR in vitro глуторедоксином-1 и тиоредоксином было показано Aslund et al. (Biochemistry. 96, 6161 - 6165;1999).

Был разработан вариант HyPer, названный HyPer2 с увеличенным динамическим диапазоном (Markvicheva et al., Bioorg Med Chem. 2011; 19(3):1079-84). HyPer2 был получен внесением; мутации A406V в последовательность HyPer. HyPer2 имеет улучшенный примерно в 2-раза динамический диапазон, нежели HyPer.

HyPer и HyPer2 позволяют отслеживать динамические изменения концентрации Нз02 в режиме реального времени, однако вследствие относительно высоких скоростей восстановления OxyR домена, невозможно выявлять и продолжительное время отслеживать клетки, которые прореагировали на стимуляцию производством пероксида водорода. Иными словами, биосенсоры HyPer и HyPer2 работают как «динамические» сенсоры, но не могут быть использованы как «накопительные». Это ограничивает область применения HyPer и HyPer2 для мониторинга изменений концентрации НзОз, например, в системах in vivo, или при сортировке клеток активированной флюоресценцией (FACS). То есть, когда нужно, чтобы сигнал биосенсора сохранялся в течение времени, необходимого для обработки биологических образцов (например, когда необходимо фиксировать ткани и изготовлять срезы тканей для дальнейшего'изучения или когда нужно время для нанесения образцов на FACS-машину).

Настоящее изобретение обеспечивает выделенные молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, обладающий уменьшенной скоростью восстановления после реакции с пероксидом водорода по сравнению с HyPer и HyPer2. В некоторых воплощениях, нуклеиновая кислота настоящего изобретения кодирует флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, аминокислотная последовательность которого отличается от последовательности HyPer2 (SEQ ID NO:1) по крайней мере, одной аминокислотной заменой. В некоторых воплощениях, это замена в регуляторном домене OxyR. В некоторых воплощениях, это замена по положению 34 в аминокислотной последовательности, представленной в (SEQ ID NO:1). В некоторых воплощениях, это замена H34Y.

В некоторых воплощениях, нуклеиновая кислота настоящего изобретения кодирует флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4. В некоторых воплощениях, нуклеиновая кислота настоящего изобретения имеет нук-леотидную последовательность, показанную в SEQ ID NO:03. В некоторых воплощениях, нуклеиновая кислота настоящего изобретения кодирует флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, слитый с сигналом внутриклеточной локализации.

В некоторых воплощениях, нуклеиновая кислота настоящего изобретения кодирует флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, который обладает меньшей скоростью восстановления после окисления, происходящего в процессе взаимодействия сенсора с пероксидом водорода, чем с HyPer и HyPer2.

Молекулы нуклеиновых кислот, которые отличаются от представленных нуклеотидных последовательностей вследствие вырожденности генетического кода так же входят в рамки настоящего изобретения. В других воплощениях также обеспечиваются векторы, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения. Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает кассеты экспрессии, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения и регуляторные элементы, необходимые для экспрессии нуклеиновой кислоты в выбранной клетке-хозяине. Кроме того, также обеспечиваются клетки, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения. В других воплощениях обеспечиваются функциональные флуоресцентные биосенсоры настоящего изобретения, которые кодируются нуклеиновыми кислотами указанными выше. Кроме того, обеспечиваются набор, содержащий нуклеиновые кислоты и/или векторы и/или экспрессионные кассеты, включающие указанные нуклеиновые кислоты настоящего изобретения.

Краткое описание рисунков

Рисунок 1 илюстрирует принципиальную схему строения биосенсора для детекции пероксида водорода.

Рисунок 2 иллюстрирует динамику изменения сигнала вариантов биосенсора HyPer во времени после добавления пероксида водорода.

Рисунок 3 показывает сравнение среднего значения для полупериода окисления и восстановления вариантов биосенсора HyPer (n=20, Р<0.05).

Осуществление изобретения

Для более полного раскрытия вышеперечисленных характеристик настоящего изобретения ниже предлагается детальное описание изобретения, кратко сформулированного выше, в виде ссылок на воплощения, некоторые из которых проиллюстрированы дополнительными фигурами. При этом следует отметить, что прилагаемые фигуры иллюстрируют лишь типичные воплощения настоящего изобретения и, следовательно, не должны быть восприняты в качестве ограничения объема изобретения, которое может допускать другие в равной степени эффективные воплощения.

Как указано выше, настоящее изобретение направлено на молекулы нуклеиновых кислот, которые кодируют мутантный вариант биосенсора HyPer, обладающие уменьшенной скоростью восстановления после реакции с пероксидом водорода. Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения получены с помощью рекомбинантных технологий. В предпочтительных воплощениях, нуклеиновые кислоты настоящего изобретения кодируют белок, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4. В некоторых воплощениях, нуклеиновые кислоты, кодируют белок, имеющий аминокислотную последовательность, показанную в SEQ ID NO:4, слитый с сигналом определенной внутриклеточной локализации. Также обеспечиваются векторы и кассеты экспрессии, включающие нуклеиновую кислоту настоящего изобретения. Кроме того, обеспечиваются клетки, стабильные клеточные линии, трансгенные животные и трансгенные растения, включающие нуклеиновые кислоты, векторы или экспрессионные кассеты настоящего изобретения.

Указанные нуклеиновые кислоты применяются во многих различных приложениях и методах, в частности, для мониторинга изменений концентрации пероксида водорода внутри живых клеток и выявления клеток, в которых произошла активация продукции переоксида водорода. Наконец, обеспечиваются наборы для их использования в таких методах и приложениях.

Определения

Различные термины, относящиеся к биологическим молекулам настоящего изобретения, используются выше и также в описании и в формуле изобретения.

Как здесь используется, термин "флуоресцентный белок" означает белок, относящийся к семейству GFP-подобных белков, который обладает способностью к флуоресценции; например, он может проявлять низкую, среднюю или интенсивную флуоресценцию при облучении светом с подходящей для возбуждения длиной волны. Флуоресцентное свойство флуоресцентного белка представляет собой такое свойство, которое является результатом работы хромофора, образующегося путем автокаталитической циклизации трех или более аминокислотных остатков в полипептидной цепи. Как таковые флуоресцентные белки настоящего изобретения не включают белки, которые обладают флуоресценцией за счет отдельных флуоресцирующих остатков, таких как триптофан, тирозин и фенилаланин. Термин «флуоресцентный белок» относится так же к флуоресцентным белкам GFP-семейства, подвергнутым круговой пермутации.

Как здесь используется, термин "avGFP" относится к зеленому флуоресцентному белку из медузы Aequorea victoria, включая варианты avGFP, известные из уровня техники, сконструированные для обеспечения большей интенсивности флуоресценции или флуоресценции в других цветовых областях. Последовательность дикого типа avGFP была раскрыта в Prasher et al. (1992, Gene 111: 229-33).

Как здесь используется, термин "флуоресцентный белок, подвергнутый круговой пермутации" или "кпфб" относится к белку, полученному из флуоресцентного белка (например из avGFP) с помощью генно-инженерной модификации нуклеиновой кислоты, в результате которой С- и N- концы исходного флуоресцентного белка оказываются оперативно слиты, а новые С- и N- концы формируются вблизи хромофора. Круговая пермутация не влияет на формирование «бочонка» GFP-подобного домена и формирование активного (способного к флуоресценции) хромофора. Круговая пермутация приводит к тому, что кпФБ приобретает способность менять спектральные характеристики при конформационных изменениях белковых доменов или полипептидов, оперативно слитых с его С- и N-концами.

Термин "гуманизированный" относится к изменению нуклеотидной последовательности флуоресцентного белка, сделанной для оптимизации генетического кода кодонов для экспрессии в клетках млекопитающих (Yang et al„ 1996, Nucleic Acids Research 24:4592-4593).

Как здесь используется, термин "выделенный" означает молекулу или клетку, которые находятся в среде, отличной от среды, в которой молекула или клетка находятся в естественных условиях.

Как здесь используется, термин "мутант" или "производное" относятся к белку, раскрытому в настоящем изобретении, в котором одна или более аминокислот добавлены и/или замещены и/или удалены (делегированы) и/или вставлены (инсертированы) в N-конец и/или С-конец, и/или в пределах нативных аминокислотных последовательностей белков настоящего изобретения. Как здесь используется, термин "мутант" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая кодирует мутантный белок. Кроме того, термин "мутант" здесь относится к любому варианту, который короче или длиннее белка или нуклеиновой кислоты.

Как здесь используется, "гомология" - это термин, использующийся для описания взаимосвязи последовательностей нуклеотидов или аминокислот с другими последовательностями нуклеотидов или аминокислот, которая определена степенью идентичности и/или сходства между указанными сравниваемыми последовательностями.

Как здесь используется, аминокислотная или нуклеотидная последовательности "по существу сходны" или "по существу такие же как референсная последовательность, если аминокислотная или нуклеотидная последовательности имеют по крайней мере 85% идентичности с указанной последовательностью внутри выбранного для сравнения региона. Таким образом, по существу сходные последовательности включают те, которые имеют, например, по крайней мере, 85% идентичности, по крайней мере, 90% идентичности, по крайней мере, 95% идентичности или по крайней мере, 96%б 97%б 98% или 99% идентичности. Две последовательности, которые идентичны одна другой, так же по существу сходны.

Процент идентичности последовательностей определяется на основании референсной последовательности. Алгоритмы для анализа последовательности известны в данной области, такие как BLAST, описанный в Altschul et al., J. Mol. BioL, 215, pp.403-10 (1990). Для целей настоящего изобретения сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей производимое с помощью пакета программ Blast, предоставляемого National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) с использованием содержащего разрывы выравнивания со стандартными параметрами, может быть использовано для определения уровня идентичности и сходства между нуклеотидными последовательностями и аминокислотными последовательностями.

Как здесь используется, термин "подобные белки" или "по существу сходные белки" относится к белкам, которые имеют аминокислотные последовательности, идентичные по крайней мере на 85%, как правило идентичные на 90% или более, чаще всего идентичные по крайней мере на 95% или более (например на 96% и более, 97% и более, 98% и более, 99% и более, 100%). Длина гомологичных аминокислотных последовательностей у «подобных белков» при этом может составлять, по крайней мере, 100 аминокислотных остатков, чаще, по крайней мере, 200 аминокислотных остатков, или 300 аминокислотных остатков.

В некоторых воплощениях, термин "подобные белки" или "по существу сходные белки" относится к белкам, которые имеют аминокислотные последовательности целого белка идентичные по крайней мере на 85%, как правило идентичные на 90% или более, чаще всего идентичные по крайней мере на 95% или более (например на 96% и более, 97% и более, 98% и более, 99% и более, 100%).

Как здесь используется, термин "функциональный" означает, что нуклеотидная или аминокислотная последовательность может функционировать для указанного испытания или задачи. Термин "функциональный", используемый для описания биосенсора для детекции пероксида водорода настоящего изобретения, означает, что он меняет спектральные характеристики при увеличении концентрации пероксида водорода в среде.

Как здесь используется, термин «среда» по отношению к биосенсору для детекции пероксида водорода означает любую среду, в которой этот биосенсор может функционировать. Для выделенного белка это может быть любой буферный раствор, в котором этот сенсор сохраняет функциональность. Для белка, экспрессированного в клетке, это цитоплазма или внутриклеточный компартмент, в котором биосенсор локализован.

Как здесь используется, "биохимические свойства" относятся к белковому фолдингу (сворачиванию) и скорости созревания, полупериоду окисления, полупериоду восстановления после реакции с пероксидом водорода, времени полужизни, способности к агрегации, способности к олигомеризации, рН и температурной стабильности, и другим подобным свойствам.

Как здесь используется, "флуоресцентные свойства" или "спектральные свойства" относятся к коэффициенту молярной экстинкции при подходящей длине волны, к квантовому выходу флуоресцентции, форме спектра возбуждения флуоресценции или спектра испускания, длине волны, соответствующей максимуму возбуждения флуоресценции, и длине волны, соответствующей максимуму испускания, отношению амплитуды возбуждения флуоресценции при двух разных длинах волн, отношению амплитуды испускания при двух разных длинах волн, времени жизни возбужденного состояния, и анизотропии оптических свойств. Измеряемая разница может быть определена как количество любого количественного флуоресцентного свойства, например, интенсивность флуоресцентции при определенной длине волны, или интегральная флуоресценция на всем спектре испускания.

Как здесь используется, "агрегация" относится к склонности или способности экспрессированного белка формировать нерастворимый осадок (агрегаты). "Агрегация" должна быть отличаема от "олигомеризации". В частности, мутанты с уменьшенной способностью к агрегации, например, с увеличенной растворимостью, не обязательно имеют уменьшенную способность к олигомеризации.

Как здесь используется, "олигомеризация" относится к склонности или способности экпрессированного белка формировать комплексы (олигоме-ры) в результате специфического взаимодействия двух или более полипептидов. Указанное специфическое взаимодействие наблюдается в специальных условиях, например, в физиологических условиях, и относительно стабильно в этих условиях. Ссылка на "способность" белков олигомеризоваться означает, что белки могут формировать димеры, триммеры, тетрамеры или подобные комплексы в специальных условиях. Как правило, флуоресцентные белки обладают способностью к олигомеризации в физиологических условиях. Флуоресцентные белки могут также олигомеризоваться при других, например, рН, нежели рН при физиологических условиях. Условия, при которых флуоресцентные белки формируют олигомеры или проявляют склонность к олигомеризации могут быть определены с помощью хорошо известных методов, таких как гель-фильтрация или иным способом известным в данной области.

Ссылка на нуклеотидную последовательность "кодирующую" полипептид означает, что с нуклеотидной последовательности в ходе трансляции и транскрипции мРНК продуцируется этот полипептид. При этом может быть указана как кодирующая цепь, идентичная мРНК и обычно используемая в списке последовательностей, так и комплементарная цепь, которая используется как матрица при транскрипции. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, термин так же включает любые вырожденные нуклеотидные последовательности кодирующие одинаковую аминокислотную последовательность. Нуклеотидная последовательности кодирующие полипептид включают последовательности, содержащие интроны.

Термин "оперативно связанный", «оперативно слитый» или ему подобный при описании структуры биосенсора или химерных белков на его основе относится к полипептидным последовательностям, которые находятся в физической и функциональной связи одна с другой. В наиболее предпочтительных воплощениях, основные функции полипептидных компонентов химерной молекулы не изменены по сравнению с функциональными свойствами выделенных полипептидных компонентов. Например, OxyR домен, входящий в состав биосенсора настоящего изобретения, сохраняет способность связывать пероксид водорода, а кпБФ - способность к флуоресценции. В случае, когда биосенсор настоящего изобретения сшит с представляющим интерес сигналом внутриклеточной локализации, химерный белок сохраняет способность реагировать на появление пероксида водорода, но локализуется в определенном клеточном компартменте. Как очевидно для любого специалиста в данной области техники, нуклеотидные последовательности, кодирующие химерный белок, включающий "оперативно связанные" компоненты (белки, полипептиды, линкерные последовательности, белковые домены и т.д.), состоят из фрагментов, кодирующих указанные компоненты, где эти фрагменты ковалентно связаны таким образом, что в ходе трансляции и транскрипции нуклеотидной последовательности продуцируется полноразмерный химерный белок. Иными словами, фрагменты соединены таким образом, что в местах их соединения отсутствуют 'сбойки' рамки считывания и стоп-кодоны.

Как здесь используется, термины «перекись водорода» и «пероксид водорода» относятся к молекуле, имеющей формулу H₂O₂.

Как здесь используется, термин «сигнал биосенсора» означает детектируемое изменение спектральной характеристики биосенсора в ответ на перок-сид водорода.

Как здесь используется, термин «динамический диапазон» означает отношение максимального уровня сигнала биосенсора (в полностью окисленном состоянии) к уровню исходного сигнала (в полностью восстановленном состоянии).

Как здесь используется, термин «скорость ответа» или «скорость окисления» в отношении биосенсора настоящего изобретения относится к скорости, с которой молекула биосенсора реагирует на увеличение концентрации или появление перекиси водорода в среде. Для нужд настоящего изобретения скорость ответа может быть охарактеризована «полупериодом окисления» (Т1/20Х) биосенсора - половиной времени, за который биосенсор достигает максимального значения сигнала, считая от момента добавления пероксида водорода в среду.

Как здесь используется, термин «скорость восстановления» в отношении биосенсора настоящего изобретения, относится к скорости, с которой молекула окисленного биосенсора восстанавливает способность реагировать на появление в среде пероксида водорода за счет взаимодействия с клеточными системами, восстанавливающими дисульфидные связи. Для нужд настоящего изобретения скорость восстановления может быть охарактеризована «полу периодом восстановления» (Т 1/2 RED) - половина времени, за которое биосенсор достигает минимального (первоначального, характекр-ного для восстановленной формы) значения сигнала, считая от момента достижения максимума сигнала при окислении.

Молекулы нуклеиновых кислот

Настоящее изобретение обеспечивает молекулы нуклеиновых кислот кодирующие флуоресцентный биосенсор для детекции пероксида водорода, имеющий аминокислотную последовательность SEQ ID NO:4.

Как здесь используется, молекула нуклеиновой кислоты это молекула ДИК, такая как геномная ДИК или кДНК молекула, или молекула РНК, такая как молекула мРНК. Как здесь используется, термин "кДНК" относится к нуклеиновым кислотам, которые обладают размещением элементов последовательности найденным в нативных зрелых видах мРНК, где элементы последовательности - это экзоныи 5' и 3' некодирующие области. Структура биосенсора схематически изображена на рисунке 1. Методы получения таких слитых белков хорошо известны в данной области. Например, части нуклеиновой кислоты, кодирующие различные элементы, могут быть встроены в полилинкер вектора, таким образом, что эти части окажутся оперативно связаны и между ними не будет стоп-кодонов в рамке считывания и не будет сбоек рамки считывания. Альтернативно, желательная нуклеотидная последовательность может быть собрана из фрагментов с помощью ДНК-лигазы или ПЦР с праймерами, содержащими части, комплементарные концевым последовательностям соединяемых фрагментов.

Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая флуоресцентный биосенсор, может быть синтезирована из подходящих нуклеозидтрифосфатов или выделена из биологических источников. Оба метода основаны на хорошо известных в данной области протоколах. Например, доступность информации о последовательности аминокислот или информации о нуклеотидной последовательности дает возможность изготовить выделенные молекулы нуклеиновых кислот настоящего изобретении с помощью олигонуклео-тидного синтеза. В случае информации о последовательности аминокислот может быть синтезировано несколько нуклеиновых кислот отличающихся друг от друга вследствие вырожденности генетического кода. Методы выбора вариантов кодонов для требуемого хозяина хорошо известны в данной области. Синтетические олигонуклеотиды могут быть приготовлены с помощью фосфорамидитного метода, и полученные конструкты могут быть очищены с помощью методов хорошо известных в данной области, таких как высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) или других методов как описано, например, в Sambrook et al.. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed., (1989) Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, и по инструкции, описанной в, например. United States Dept. of HHS, National Institute of Health (NIH) Guidelines for Recombinant DNA Research. Длинные двухцепочечные молекулы ДНК настоящего изобретения могут быть синтезированы за следующие стадии: несколько меньших фрагментов с необходимой комплементарностью, которые содержат подходящие концы способные к когезии с соседним фрагментом, могут быть. Соседние фрагменты могут быть сшиты с помощью ДНК-лигазы или метода, основанного на ПЦР. Нуклеиновая кислота, кодирующая биосенсор или его фрагмент, может быть выделена любым из многих известных методов.

Кроме того, также обеспечиваются вырожденные варианты нуклеиновых кислот, которые кодируют биосенсор настоящего изобретения. Вырожденные варианты нуклеиновых кислот включают замены кодонов нуклеиновой кислоты на другие кодоны, кодирующие те же самые аминокислоты. В частности вырожденные варианты нуклеиновых кислот создаются, чтобы увеличить экспрессию в клетке-хозяине. В этом воплощении, кодоны нуклеиновой кислоты, которые не являются предпочтительными или являются менее предпочтительными в генах клетки-хозяина, заменены кодонами, которые обильно представлены в кодирующих последовательностях генов в клетке-хозяине, где указанные замененные кодоны кодируют ту же самую аминокислоту.

Особенный интерес представляют гуманизированные версии нуклеиновых кислот настоящего изобретения. Как здесь используется, термин "гумани-зированный" относится к заменам, сделанным в последовательности нуклеиновой кислоты для оптимизации кодонов для экспрессии белка в клетках млекопитающих (человека) (Yang et al., Nucleic Acids Research (1996) 24: 4592-4593). См. также Патент США №5795737, который описывает гуманизацию белков, раскрытие которого здесь включено ссылкой. В некоторых воплощениях, молекула нуклеиновой кислоты настоящего изобретения - это ДНК (или кДНК) молекула, содержащая открытую рамку считывания, которая кодирует биосенсор настоящего изобретения и способна в подходящих условиях (например, физиологические внутриклеточные условия) быть использована для экспрессии белка в клетке-хозяине. Настоящее изобретение так же охватывает нуклеиновые кислоты, которые гомологичны, по существу сходны, идентичны, или получены из нуклеиновых кислот, кодирующих белки настоящего изобретения. Указанные нуклеиновые кислоты находятся в среде, отличной от среды, в которой они находятся в естественных условиях, например, они выделены, представлены в увеличенном количестве, находятся или экспрессированы в системах in vitro или в клетках или организмах, отличных от тех, в которых они находятся в естественных условиях.

Заявленные нуклеиновые кислоты могут быть выделены и получены по существу в очищенной форме. По, существу очищенная форма означает, что нуклеиновые кислоты являются, по меньшей мере, на 50% чистыми, обычно, по меньшей мере, на 90% чистыми и обычно являются "рекомбинантными", то есть, фланкированы одним или более нуклеотидов, - с которыми она обычно не связана в хромосоме, встречающейся в природе в ее естественном организме-хозяине.

Изменения или различия в нуклеотидной последовательности между высоко сходными нуклеотидными последовательностями могут представлять