Способ ферментативного удаления биопленки, композиция и набор

Способ ферментативного удаления биопленки, композиция и набор

Реферат

Родственные заявки

Настоящая заявка испрашивает приоритет к заявке на патент США № 61/015504, поданной 20 декабря 2007, которая включена в настоящее описание в полном объеме посредством ссылки.

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композициям фермента и способам удаления биопленок с поверхностей. В частности, способы удаления биопленки включают применение фермента пергидролазы совместно с другими ферментами к биопленке на поверхности.

Уровень техники

Биопленки состоят из присоединенного сообщества микроорганизмов, помещенного в вязкую экзополимерную матрицу, которое часто продолжает существовать, несмотря на контролируемые попытки с традиционными подходами, разработанными для уничтожения свободно плавающих микроорганизмов. Устойчивость биопленок к антибиотикам, антисептикам и окисляющим биоцидам было хорошо задокументировано.

Ферментативные способы предотвращения образования и/или сокращения биопленок были описаны, например, в PCT заявках на патент № WO 06/031554, WO 01/98214, WO 98/26807, WO 04/041988, WO 99/14312 и WO 01/53010. Однако существует потребность в улучшенных способах и композициях для контроля биопленок в областях применения промышленности, стоматологии и охраны здоровья.

Сущность изобретения

Изобретение обеспечивает способы, композиции и наборы для удаления биопленки. В одном аспекте изобретение обеспечивает способ удаления биопленки с поверхности, указанный способ, включающий применение фермента пергидролазы и смеси ферментов для удаления к указанной биопленке в течение времени, достаточного для сокращения указанной биопленки, по меньшей мере, на 25%, в котором указанная смесь ферментов выбрана из протеазы, глюканазы и эстеразы; протеазы, глюканазы, эстеразы и маннаназы; протеазы, глюканазы, фосфолипазы и маннаназы; трех протеаз, глюканазы, фосфолипазы и маннаназы; трех протеаз, глюканазы и маннаназы; двух протеаз, целлюлазы, глюканаз, фосфолипазы и маннаназы; протеазы, глюканазы и маннаназы; протеазы, целлюлазы, фосфолипазы и эстеразы; двух протеаз, глюканазы, фосфолипазы и эстеразы; двух протеаз, глюканазы, фосфолипазы и маннаназы; трех протеаз, целлюлазы, фосфолипазы и глюканазы; трех протеаз, целлюлазы, фосфолипазы и маннаназы; трех протеаз, глюканазы, фосфолипазы и эстеразы; протеазы, целлюлазы, глюканазы, фосфолипазы и эстеразы; по меньшей мере двух амилаз и глюканазы; по меньшей мере трех амилаз; и по меньшей мере двух амилаз, глюканазы и протеазы. В некоторых вариантах осуществления биопленка содержит Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes или Staphylococcus aureus. В некоторых вариантах осуществления фермент пергидролаза включает аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO:1, или разновидность, или ее гомолог. В одном варианте осуществления фермент пергидролаза представляет собой разновидность S54V SEQ ID NO:1.

В одном варианте осуществления смесь ферментов для удаления состоит из трех протеаз, глюканазы, фосфолипазы и маннаназы. В одном варианте осуществления смесь ферментов для удаления состоит из PROPERASE, PURAFECT, FNA, LAMINEX BG, GC 265 и LYSOMAX.

В одном варианте осуществления фермент пергидролазу и смесь ферментов для удаления применяют к биопленке одновременно. В другом варианте осуществления смесь фермента пергидролазы и смесь ферментов для удаления применяют к биопленке последовательно. В одном варианте осуществления фермент пергидролазу применяют до использования смеси ферментов для удаления. В одном варианте осуществления фермент пергидролаза и смесь ферментов для удаления действуют синергетически для удаления биопленки с поверхности.

В другом аспекте изобретение обеспечивает композицию для удаления биопленки с поверхности, указанная композиция, включающая фермент пергидролазу и смесь ферментов для удаления, в которой указанная смесь ферментов для удаления выбрана из протеазы, глюканазы и эстеразы; протеазы, глюканазы, эстеразы и маннаназы; протеазы, глюканазы, фосфолипазы и маннаназы; трех протеаз, глюканазы, фосфолипазы и маннаназы; трех протеаз, глюканазы и маннаназы; двух протеаз, целлюлазы, глюканаз, фосфолипазы и маннаназы; протеазы, глюканазы и маннаназы; протеазы, целлюлазы, фосфолипазы и эстеразы; двух протеаз, глюканазы, фосфолипазы и эстеразы; двух протеаз, глюканазы, фосфолипазы и маннаназы; трех протеаз, целлюлазы, фосфолипазы и глюканазы; трех протеаз, целлюлазы, фосфолипазы и маннаназы; трех протеаз, глюканазы, фосфолипазы и эстеразы; протеазы, целлюлазы, глюканазы, фосфолипазы и эстеразы; по меньшей мере двух амилаз и глюканазы; по меньшей мере трех амилаз; и по меньшей мере двух амилаз, глюканазы и протеазы.

В одном варианте осуществления смесь ферментов для удаления состоит из трех протеаз, глюканазы, фосфолипазы и маннаназы. В одном варианте осуществления смесь ферментов для удаления состоит из PROPERASE, PURAFECT, FNA, LAMINEX BG, GC 265 и LYSOMAX.

В некоторых вариантах осуществления фермент пергидролаза содержит аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO:1, или разновидность, или ее гомолог. В одном варианте осуществления фермент пергидролаза представляет собой разновидность S54V SEQ ID NO:1.

В другом аспекте изобретение обеспечивает набор для удаления биопленки с поверхности, указанный набор, включающий фермент пергидролазу и смесь ферментов для удаления, в котором указанная смесь ферментов выбрана из группы, состоящей из протеазы, глюканазы и эстеразы; протеазы, глюканазы, эстеразы и маннаназы; протеазы, глюканазы, фосфолипазы и маннаназы; трех протеаз, глюканазы, фосфолипазы и маннаназы; трех протеаз, глюканазы и маннаназы; двух протеаз, целлюлазы, глюканаз, фосфолипазы и маннаназы; протеазы, глюканазы и маннаназы; протеазы, целлюлазы, фосфолипазы и эстеразы; двух протеаз, глюканазы, фосфолипазы и эстеразы; двух протеаз, глюканазы, фосфолипазы и маннаназы; трех протеаз, целлюлазы, фосфолипазы и глюканазы; трех протеаз, целлюлазы, фосфолипазы и маннаназы; трех протеаз, глюканазы, фосфолипазы и эстеразы; протеазы, целлюлазы, глюканазы, фосфолипазы и эстеразы; по меньшей мере двух амилаз и глюканазы; по меньшей мере трех амилаз; и по меньшей мере двух амилаз, глюканазы и протеазы и необязательно, инструкции по применению для способа удаления биопленки, как описано в настоящей заявке. В одном варианте осуществления фермент пергидролаза и смесь ферментов для удаления находятся в отдельных емкостях. В одном варианте осуществления фермент пергидролаза и смесь ферментов для удаления находятся в одной емкости.

В одном варианте осуществления смесь ферментов для удаления состоит из трех протеаз, глюканазы, фосфолипазы и маннаназы. В одном варианте осуществления смесь ферментов для удаления состоит из PROPERASE, PURAFECT, FNA, LAMINEX BG, GC 265 и LYSOMAX.

В некоторых вариантах осуществления фермент пергидролаза включает аминокислотную последовательность, описанную в SEQ ID NO:1, или разновидность, или ее гомолог. В одном варианте осуществления фермент пергидролаза представляет собой разновидность S54V SEQ ID NO:1.

Подробное описание

Изобретение обеспечивает способы, композиции и наборы для контроля, то есть удаления или сокращения биопленки на поверхности или предотвращения образования или роста биопленки на поверхности. Композиции, содержащие ферменты, и способы изобретения применяют для контроля биопленок, например, в управлении промышленным водоснабжением, таком как градирни, питьевая вода, сточные воды, стоматологической гигиене, медицинских имплантах и устройствах, системах гемодиализа, регенерации масла, биоремедиации колодцев, целлюлозно-бумажной обработке, корпусах кораблей, оборудовании для обработки продуктов и водных системах доставки, например, трубы, шланги труб и подобные.

Если в настоящем описании не определено иначе, все технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют то же самое значение, как обычно понимает специалист в данной области техники. Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, second ed., John Wiley and Sons, New York (1994) и Hale & Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991) обеспечивают специалиста в данной области техники общим словарем многих терминов, используемых в этом изобретении. Любые способы и материалы, подобные или эквивалентные описанным в настоящей заявке, могут использовать на практике или при испытании настоящего изобретения.

Числовые диапазоны, представленные в настоящем описании, включают числа, определяющие диапазон.

Если не обозначено иначе, нуклеиновые кислоты написаны слева направо в направлении 5'-3'; аминокислотные последовательности написаны слева направо в направлении от амино к карбокси, соответственно.

Определения

«Биопленка» относится к сообществу микроорганизмов, заключенному во внеклеточную матрицу полимера, присоединенную к поверхности. Биопленка дополнительно включает воду и может включать другие захваченные частицы. Биопленка может включать один или более микроорганизмов, включая грам-положительные или грам-отрицательные бактерии (аэробные или анаэробные), морские водоросли, простейшие животные организмы и/или дрожжи или мицелиальные грибы. В некоторых вариантах осуществления биопленка включает живые клетки бактерий родов Staphylococcus, Streptomyces, Pseudomonas, Listeria, Streptococcus и Escherichia.

«Поверхность» относится к любой структуре, имеющей достаточную массу для присоединения биопленки. Твердые поверхности включают, но не ограничиваются ими, металл, стекло, керамический материал, дерево, минерал (например, горная порода, камень, мрамор, гранит), агрегированные материалы, такие как бетон, пластмасса, композитный материал, эбонитовый материал и гипс. Твердый материал может быть покрыт эмалью и/или краской. Твердые поверхности обнаружены, например, в оборудовании и резервуарах для обработки и хранения воды, оборудовании и оснащении молочной и пищевой промышленности, оборудовании и оснащении медицины, например, хирургические инструменты, постоянные и временные импланты и промышленном фармацевтическом оборудовании и на заводах. Мягкие поверхности включают, но не ограничиваются ими, волосы и текстильные изделия. Пористые поверхности могут быть биологическими поверхностями, включая, но не ограничиваясь ими, кожу, кератин и внутренние органы. Пористые поверхности могут также быть найдены в определенном керамическом материале так же как в мембранах, которые используют для фильтрации. Другие поверхности включают, но не ограничиваются ими, корпуса кораблей и плавательные бассейны.

«Дозировка фермента» относится к количеству смеси ферментов, количеству единичного фермента в смеси ферментов или количеству используемого отдельно единичного фермента, применяемому для обработки биопленки. Факторы, влияющие на дозировку фермента, включают, но не ограничиваются ими, тип фермента, поверхность, которую будут обрабатывать, и намеченный результат. В некоторых вариантах осуществления дозировка фермента представляет собой количество смеси ферментов, необходимое для сокращения биопленки по меньшей мере на приблизительно 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 98 или 99%. Обычно содержание фермента в смеси ферментов представляет собой в общем приблизительно 1% или менее, 2% или менее, 3% или менее или 5% или менее (вес./вес.).

«Обработка» или «контроль», или «удаление» биопленки относится к сокращению или удалению биопленки с поверхности, включая уничтожение и/или ингибирование роста микробов в биопленке и/или профилактическое предотвращение образования или роста биопленки на поверхности.

«Смесь ферментов» относится по меньшей мере к двум ферментам. Описанные в настоящей заявке ферменты, используемые в смесях ферментов, могут быть получены из растительных или животных источников, бактерий, грибов или дрожжей и могут быть дикого типа или различными ферментами.

«Кислотная среда», «нейтральная среда» и «основная среда» хорошо известны специалисту в данной области техники. Как правило, «кислотная среда» относится к pH от около 4 до приблизительно 6. «Нейтральная среда» относится к pH от приблизительно 6 до приблизительно 8. «Основная среда» относится к pH от приблизительно 8 до приблизительно 10.

«Пергидролаза» относится к ферменту, который способен к катализу реакции пергидролиза, которая приводит к получению достаточно большого количества перкислоты, подходящей для использования, такого как очистка, отбеливание, дезинфекция или стерилизация объекта (например, обработка биопленки, как описано в настоящей заявке). Обычно фермент пергидролаза, используемый в способах, описанных в настоящей заявке, показывает высокое отношение реакций пергидролиза к гидролизу. В некоторых вариантах осуществления пергидролаза включает, состоит из или состоит по существу из пергидролазы Mycobacterium smegmatis аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO:1, или разновидности, или ее гомолога. В некоторых вариантах осуществления фермент пергидролаза включает активность ацилтрансферазы и катализирует водную реакцию переноса ацила.

«Перкислота» представляет собой органическую кислоту формулы RC(=O)OOH.

«Пергидролиз» или «пергидролизировать» относится к ферментативной реакции, в результате которой получают перкислоту. В некоторых вариантах осуществления перкислоту получают пергидролизом основания сложного эфира формулы R₁C(=O)OR₂, в которой R₁ и R₂ представляют собой одинаковые или различные органические части, в присутствии пероксида водорода (H₂O₂).

Фраза «источник пероксида водорода» включает пероксид водорода так же как компоненты системы, которая может самопроизвольно или ферментативно производить пероксид водорода в качестве продукта реакции.

Фраза «отношение пергидролиза к гидролизу» относится к отношению количества ферментативно полученной перкислоты к количеству ферментативно полученной кислоты с помощью фермента пергидролазы из основания сложного эфира при определенных условиях и в пределах определенного времени.

Используемый в настоящем описании термин «ацил» относится к органической кислотной группе, которая представляет собой остаток карбоновой кислоты после удаления гидроксильной группы (-ОН) (например, этаноилхлорид, CH₃CO-Cl, представляет собой ацилхлорид, образованный из этановой кислоты, CH₃CO-ОН). Название индивидуальной ацильной группы обычно образуют, заменяя «-вая» кислоты на «-ил».

Используемый в настоящем описании термин «ацилирование» относится к химическому превращению, в котором ацильной группой (RCO-) группой замещают в молекуле обычно активный водород -ОН группы.

Используемый в настоящем описании термин «трансфераза» относится к ферменту, который катализирует перенос функциональной группы от одного субстрата к другому субстрату.

Используемый в настоящем описании «белок» относится к любой композиции, состоящей из аминокислот и признанной белком специалистом в данной области техники. Термины «полипептид», «олигопептид», «пептид» и «белок» используют в настоящем описании взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты и он может быть прерван не аминокислотами. Термины также охватывают аминокислотный полимер, который был модифицирован естественным образом или при помощи вмешательства; например, образование дисульфидной связи, гликозилирование, липидизация, ацетилирование, фосфорилирование или любое другое превращение или модификация, такое как конъюгация с меченым компонентом. Также в пределах определения находятся, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислоты (включая, например, неприродные аминокислоты и т.д.), также как другие модификации, известные специалисту в данной области техники.

Используемый в настоящем описании «мультимер» относится к двум или более белкам или пептидам, которые ковалентно или нековалентно связаны и существуют в качестве комплекса в растворе. «Димер» представляет собой мультимер, который содержит два белка или пептида; «тример» содержит три белка или пептида, и т.д. Используемый в настоящем описании «октамер» относится к мультимеру из восьми белков или пептидов. Белки или пептиды мультимера могут быть одинаковыми или различными.

Используемое в настоящем описании «эффективное количество фермента» относится к количеству фермента, необходимому для достижения ферментативной активности, требуемой в определенной заявке (например, удаление биопленки).

Полагают, что используемые в настоящем описании функционально и/или структурно подобные белки представляют собой «родственные белки». В некоторых вариантах осуществления родственные белки получают из различных родов и/или видов, включая различия между классами или организмами (например, бактериальный белок и грибковый белок). В некоторых вариантах осуществления родственные белки получают из одинаковых видов. Кроме того, термин «родственные белки» охватывает гомологи с третичной структурой и гомологи с первичной последовательностью. Термин также охватывает белки, которые являются иммунологически перекрестно-активными. В некоторых вариантах осуществления ферменты, родственные пергидролазе, показывают высокие отношения пергидролиза к гидролизу.

Используемый в настоящем описании термин «производное» относится к белку, который получают из исходного белка добавлением одной или более аминокислот или к любому из двух, или к обоим вместе C- и N-концу(ам), замещением одной или более аминокислот на одном или множестве различных участков в аминокислотной последовательности и/или удалением одной или более аминокислот на любом из двух или обоих вместе C- и N-конце(ах) и/или на одном или более участках аминокислотной последовательности, и/или вставкой одной или более аминокислот на одном или более участках аминокислотной последовательности. Получение производного белка часто достигают модифицированием последовательности ДНК, которая кодирует нативный белок, превращением модифицированной последовательности ДНК в подходящего хозяина и экспрессией модифицированной последовательности ДНК для получения производного белка.

Родственные (и производные) белки охватывают «вариантные» белки. Вариантные белки отличаются от исходного белка и/или друг от друга небольшим количеством остатков аминокислот. В некоторых вариантах осуществления число различных остатков аминокислот представляет собой любое из приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45 или 50. В некоторых вариантах осуществления варианты отличаются от приблизительно 1 до приблизительно 10 аминокислот.

В некоторых вариантах осуществления родственные белки, такие как вариантные белки, включают любую из по меньшей мере приблизительно 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 99,5% идентичность аминокислотной последовательности.

Используемый в настоящем описании термин «аналогичная последовательность» относится к последовательности полипептида в пределах белка, которая обеспечивает подобную функцию, третичную структуру и/или сохраненные остатки относительно эталонного белка. Например, в областях антигенной детерминанты, которые содержат структуру альфа-спирали или бета-листа, замещение аминокислот(ы) в аналогичной последовательности поддерживает одинаковый структурный элемент. В некоторых вариантах осуществления обеспечивают аналогичные последовательности, которые приводят к вариантным ферментам, показывающим подобную или улучшенную функцию относительно исходного белка, из которого получен вариант.

Используемый в настоящем описании «гомологичный белок» относится к белку (например, фермент пергидролаза), который имеет подобную функцию (например, ферментативная активность) и/или структуру как эталонный белок (например, фермент пергидролаза из различных источников). Гомологи могут быть эволюционно связанными или несвязанными видами. В некоторых вариантах осуществления гомолог имеет четвертичную, третичную и/или первичную структуру, подобную структуре эталонного белка, таким образом потенциально учитывая замещение сегмента или фрагмента в эталонном белке на аналогичный сегмент или фрагмент гомолога с уменьшенным разрушением структуры и/или функции эталонного белка по сравнению с замещением сегмента или фрагмента последовательностью негомологичного белка.

Используемый в настоящем описании «соответствующий» относится к аминокислотному остатку в одном белке или пептиде, который представляет собой аналогичный, гомологичный или эквивалентный перечисленному остатку аминокислоты в другом белке или пептиде.

Используемая в настоящем описании «соответствующая область» относится к аналогичным, гомологичным или эквивалентным положениям или областям в полипептидных последовательностях двух белков или пептидов, включая два производных, или вариантные белки, или производное, или вариантный белок и исходный белок.

Используемые в настоящем описании «дикого типа», «нативные» и «природные» белки представляют собой белки, обнаруженные в природе. Термины «последовательность дикого типа» относятся к последовательности аминокислоты или нуклеиновой кислоты, которая обнаружена в природе или естественным образом. В некоторых вариантах осуществления последовательность дикого типа представляет собой отправную точку проекта белковой инженерии, например, получение вариантных белков.

Фразы «по существу подобный» и «по существу идентичный» в контексте по меньшей мере двух нуклеиновых кислот или полипептидов обычно означают, что полинуклеотид или полипептид содержит последовательность, которая имеет по меньшей мере приблизительно 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, или 99,5% идентичность последовательности по сравнению с эталонным (например, дикого типа) полинуклеотидом или полипептидом. Идентичность последовательности могут определить, применяя известные программы, такие как BLAST, ALIGN и CLUSTAL, используя стандартные параметры. (См., например, Altshul et al. (1990) J MoI. Biol. 215:403-410; Henikoff et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. 89:10915; Karin et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:5873; и Higgins et al. (1988) Gene 73:237). Программное обеспечение для проведения исследования BLAST общедоступно через Национальный Центр Биотехнологической Информации. Кроме того, базы данных могут обнаружить, используя FASTA (Person et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:2444-2448). В некоторых вариантах осуществления по существу идентичные полипептиды отличаются только одним или более консервативными замещениями аминокислоты. В некоторых вариантах осуществления по существу идентичные полипептиды являются иммунологически перекрестно-активными. В некоторых вариантах осуществления по существу идентичные молекулы нуклеиновой кислоты гибридизируются друг с другом при соблюдении жестких условий (например, в пределах диапазона среды в жестких условиях).

«Выделенный» полипептид или полинуклеотид представляет собой такой, который является по существу свободным от материалов, с которыми он связан в природе. По существу свободный означает на по меньшей мере 50%, часто по меньшей мере 70%, более часто по меньшей мере 80% и даже более часто по меньшей мере 90% свободный от материалов, с которыми он связан в природе.

Смеси ферментов

Множество различных ферментов могут использовать в смесях ферментов и способах, описанных в настоящей заявке для сокращения биопленки. Смеси ферментов, описанные в настоящей заявке, включают по меньшей мере два фермента, такие как комбинации карбогидраз, такие как целлюлазы, эндоглюканазы, целлобиогидролазы и бета-глюкозидазы; амилазы, такие как альфа-амилазы; протеазы, такие как сериновые протеазы, например, субтилизины; эстеразы и кутиназы; ферменты, гидролизирующие гранулированный крахмал; липазы, такие как фосфолипазы; и гемицеллюлазы, такие как маннаназы. Такие смеси ферментов в настоящем описании также называют «смесью ферментов для удаления», и они включают комбинацию ферментов, как описано в настоящей заявке. В настоящей заявке описано, что смесь ферментов для удаления не включает фермент пергидролазу, но используется совместно с одним или более ферментами пергидролазы или одновременно, или последовательно в способе для сокращения биопленки.

Гидролазы (E.C.3.), которые могут использовать, включают, например, протеазы, глюканазы (семейство 16 гликозилгидролаз), целлюлазы, эстеразы, маннаназы и арабиназы. Нейтральные и сериновые протеазы, например, субтилизины, могут использовать в настоящем изобретении. Нейтральные протеазы представляют собой протеазы, которые имеют оптимальную протеолитическую активность при нейтральном диапазоне pH приблизительно 6-8. Подходящие нейтральные протеазы представляют собой аспартат и металлопротеазы. Коммерчески доступные металлопротеазы представляют собой MULTIFECT, PURAFECT L, FNA, PROPERASE L, PURADAX EG7000L и GC 106 из Aspergillus niger - все доступные от Genencor Division, Danisco US, Inc., Palo Alto ("Genencor"), California и Alcalase, Savinase, Esperase и Neutrase (Novo Nordisk A/S, Denmark). Нейтральные протеазы могут быть получены из бактериального, грибкового или дрожжевого источника, или растительного или животного источника и могут быть дикого типа или вариантными ферментами. Вариантные ферменты получены в источниках, которые экспрессируют гены, которые были мутированы из родительских генов.

Примеры целлюлаз, которые могут использовать в настоящем изобретении, включают эндоглюканазы, целлобиогидролазы и бета-глюкозидазы, включая целлюлазы, имеющие оптимальную активность при диапазоне pH от кислотного до нейтрального, например, PURADAX, полученный из бактериального источника, или LAMINEX и INDIAGE от Genencor, - оба, полученные из грибкового источника. Целлюлазы могут получить, например, из грибов родов Aspergillus, Trichoderma, Humicola, Fusarium и Penicillium.

Примеры пригодных ферментов, гидролизирующих гранулированный крахмал, включают глюкоамилазы, полученные из штаммов Humicola, Aspergillus и Phizopus. Ферменты, гидролизирующие гранулированный крахмал (GSH), относят к ферментам, которые гидролизируют крахмал в гранулированной форме. Глюкоамилаза относится к классу ферментов амилоглюкозидаз (например, EC.3.2.1.3 глюкоамилаза, 1,4-альфа-D-глюканглюкогидролаза). Они представляют собой экзо-активные ферменты, которые высвобождают глюкозильные остатки с невосстановленных концов молекул амилозы и амилопектина. Фермент также гидролизует альфа-1,6 и альфа-1,3 положения. Активность глюкоамилазы могут измерить, используя хорошо известные методы анализа, основываясь на способности глюкоамилазы катализировать гидролиз п-нитрофенил-альфа-D-глюкопиранозида (PNPG) до глюкозы и п-нитрофенола. При щелочном pH нитрофенол имеет желтый цвет, который является пропорциональным активности глюкоамилазы и измерен при 400 нм до сравнения со стандартом фермента, измеренным в качестве GAU. GAU (единица активности глюкоамилазы) определяют как количество фермента, которое производит 1 г восстановленного сахара, вычисленное как глюкоза в час из растворимого основания крахмала (4% пл.) при pH 4,2 и 60°C. Подходящие коммерчески доступные глюкоамилазы от Genencor включают OPTIDEX, DISTILLASE и G-ZYME.

Примеры липаз, которые могут использовать в настоящем изобретении, включают кислотные, нейтральные и щелочные липазы и фосфолипазы. Коммерчески доступные липазы и фосфолипазы от Genencor включают LYSOMAX и CUTINASE.

Примеры гемицеллюлазных маннаназ, которые могут использовать в настоящем изобретении, включают GC265 из Bacillus lentus, HEMICELL и PURABRITE - обе из Bacillus lentus от Genencor и маннаназы, описанные в Stahlbrand et al. (1993) J. Biotechnol. 29:229-242.

Примеры эстераз и кутиназ, которые могут использовать в настоящем изобретении, могут быть из любого источника, включая, например, бактериальные источники, такие как Pseudomonas mendocina, или грибковые источники, такие как Humicula или Fusarium. Некоторые из таких ферментов доступны от Genencor.

Примеры амилаз, которые могут использовать в настоящем изобретении, включают альфа- или бета-амилазы, которые могут получить из бактериальных или грибковых источников, таких как амилазы Bacillus (B. amyloliquefaciens, B. licheniformis и B. stearothermophilus) и грибковых амилаз, например, из Aspergillus, например, A. niger, A. kawachi или A. oryzae, Humicola и Trichoderma. Амилазы, доступные от Genencor, включают SPEZYME FRED, SPEZYME AA, CLARASE, AMYLEX и смесь амилаз SPEZYME ETHYL. Амилазы, доступные от Novozymes A/S (Дания), включают BAN, AQUAZYM, AQUAZYM Ultra и TERMAMYL. Другие амилазы включают смеси амилаз, такие как М1 от Biocon и CuConc от Sumizyme, Aris Sumizyme L (эндо 1,5 альфа-L арабиназа), ACH Sumizyme (бета-манназа), Humicola глюкоамилаза, декстраназа, декстрамаза, хитиназа, ENDOH и OPTIMAX L1000 (глюкоамилаза).

В находящейся в процессе одновременного рассмотрения заявке PCT № PCT/US2007/016461 проверили более 375 различных смесей ферментов на свойства удаления биопленки. Скрининг привел к определению 33 удивительных смесей ферментов, которые привели к значительному сокращению биопленки. 33 смеси ферментов включают смеси альфа-амилазы и маннаназы; амилазы и протеазы; амилазы и арабиназы; по меньшей мере одной альфа-амилазы и по меньшей мере двух других амилаз; протеазы, целлюлазы и глюканазы; протеазы, целлюлазы и трех глюканаз; протеазы, целлюлазы и маннаназы; протеазы, целлюлазы и амилазы; протеазы, амилазы и глюканазы; протеазы, маннаназы и амилазы; целлюлазы, арабиназы и амилазы; протеазы, целлюлазы, маннаназы и фосфолипазы; протеазы, глюканазы, амилазы и арабиназы; протеазы, целлюлазы и двух глюканаз; протеазы, целлюлазы и трех глюканаз; трех протеаз, целлюлазы, маннаназы и фосфолипазы; трех протеаз, целлюлазы, фосфолипазы и эстеразы; трех протеаз, маннаназы, фосфолипазы и эстеразы; трех протеаз, целлюлазы и маннаназы; двух протеаз, целлюлазы и глюканазы; двух протеаз, целлюлазы, глюканазы и маннаназы; двух протеаз, целлюлазы, глюканаз, фосфолипазы и маннаназы; по меньшей мере трех амилаз и целлюлазы; амилазы, арабиназы и целлюлазы; амилазы, арабиназы и протеазы; по меньшей мере трех амилаз и протеазы; по меньшей мере трех амилаз, протеазы и целлюлазы; глюканазы и смесь амилазы; целлюлазы и смесь амилазы.

В некоторых вариантах осуществления используют одну из следующих смесей ферментов: протеаза, глюканаза и эстераза; протеаза, глюканаза, эстераза и маннаназа; протеаза, глюканаза, фосфолипаза и маннаназа; три протеазы, глюканаза, фосфолипаза и маннаназа; три протеазы, фосфолипаза, эстераза и маннаназа; три протеазы, глюканаза и маннаназа; две протеазы, целлюлаза, глюканаза, фосфолипаза и маннаназа; протеаза, глюканаза и маннаназа; протеаза, целлюлаза, фосфолипаза и эстераза; две протеазы, глюканаза, фосфолипаза и эстераза; две протеазы, глюканаза, фосфолипаза и маннаназа; три протеазы, целлюлаза, фосфолипаза и глюканаза; три протеазы, целлюлаза, фосфолипаза и маннаназа; три протеазы, глюканаза, фосфолипаза и эстераза; протеаза, целлюлаза, глюканаза, фосфолипаза и эстераза; две или более амилаз и глюканаза; по меньшей мере три амилазы; по меньшей мере две амилазы, глюканаза и протеаза.

В некоторых вариантах осуществления используют одну из следующих смесей ферментов: протеаза, глюканаза и кутиназа, которую могут получить, используя коммерчески доступные ферменты MULTIFECT NEUTRAL; LAMINEX BG и кутиназа; протеаза, глюканаза, маннаназа и кутиназа, которую могут получить, используя коммерчески доступные ферменты MULTIFECT NEUTRAL; LAMINEX BG; маннаназа и кутиназа; протеаза, глюканаза, маннаназа и фосфолипаза, которую могут получить, используя коммерчески доступные ферменты MULTIFECT NEUTRAL; LAMINEX BG; маннаназа и LYSOMAX; смесь трех протеаз плюс целлюлаза, маннаназа и кутиназа, которую могут получить, используя коммерчески доступные ферменты PROPERASE L; PURAFECT L; FNA; и LAMINEX BG, маннаназа и кутиназа.

Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают следующие коммерчески доступные получения фермента от Genencor: MULTIFECT NEUTRAL; LAMINEX; LYSOMAX; PROPERASE; PURADAX, PURAFECT; и SPEZYME, - все из которых зарегистрированы под торговой маркой Genencor.

MULTIFECT NEUTRAL содержит протеазу Bacillus amyloliquefaciens (EC3.4.24.28); LAMINEX BG, имеющий уровень активности приблизительно 3200 МЕ/г, включает В-глюканазу Trichoderma (целлюлаза EC3.3.1.6); LYSOMAX, имеющий уровень активности приблизительно 400 Е/г, содержит фосфолипазу Streptomyces violceoruber; PROPERASE, имеющий уровень активности приблизительно 1600 PU/г, содержит протеазу Bacillus alcalophilus (EC3.4.21.62); PURAFECT, имеющий уровень активности приблизительно 42,000 GSU/г, содержит субтилизин протеазу (EC3.4.21.62), как описано в патенте США №5624829; FNA содержит протеазу Bacillus subtilis (EC3.4.21.62), как описано в патентах США № RE 34606 и 5310675; PURADAX, имеющий уровень активности приблизительно 32 Е/г, содержит целлюлазу Trichoderma reesei (EC3.2.1.4), как описано в патенте США № 5753484; SPEZYME FRED, имеющий уровень активности приблизительно 15,100 Ед/г, содержит альфа-амилазу из Bacillus licheniformis (EC3.2.1.1), как описано в Патенте США №№ 5736499; 5958739; и 5824532.

В некоторых вариантах осуществления смеси ферментов, используя коммерчески доступные ферменты, включают следующие:

1. MULTIFECT NEUTRAL; LAMINEX BG и кутиназа.

2. MULTIFECT NEUTRAL; LAMINEX BG; маннаназа и кутиназа.

3. MULTIFECT NEUTRAL; LAMINEX BG; маннаназа и LYSOMAX.

4. PROPERASE L; PURAFECT L; FNA; LAMINEX BG, маннаназа и кутиназа.

5. PROPERASE L; PURAFECT L; FNA; маннаназа, кутиназа и LYSOMAX.

6. PROPERATE L; PURAFECT L, FNA, маннаназа, LAMINEX BG.

7. MULTIFECT NEUTRAL; LAMINEX BG; и маннаназа.

8. FNA; PURADAX EG 7000L; LAMINEX BG и кутиназа.

9. PURAFECT L; FNA; LAMINEX BG; и LYSOMAX.

10. PROPERASE L; FNA; LAMINEX BG; и LYSOMAX.

11. PROPERASE L; PURAFECT L; FNA; LAMINEX BG; PURADAX EG 7000L; и LYSOMAX.

12. PROPERASE L; PURAFECT L; FNA; LAMINEX BG; кутиназа и LYSOMAX.

13. MULTIFECT NEUTRAL; PURADAX EG 7000L; LAMINEX BG; LYSOMAX; и кутиназа.

14. PROPERASE L; LAMINEX BG; LYSOMAX и кутиназа.

В некоторых вариантах осуществления смеси ферментов представляют собой комбинации 1, 2, 3 и 4, упомянутые выше. Дополнительные комбинации ферментов включают: SPEZYME, который содержит альфа-амилазу, полученную из Bacillus licheniformis; CuCONC, который представляет собой торговую марку для штамма Кодзи глюкоамилазы Rhizopus niveus, который имеет гидролизирующую активность гранулированного крахмала (Shin Nihon Chemical Co. Ltd. Япония); AFP GC 106, который представляет собой кислотную грибковую протеазу (Shin Hihon Chemical Co. Ltd. Япония); М1, который является доступным от Biocon India, Ltd., Бангалор, Индия); ARIS SUMIZYME (1,5-альфа арабиназа); и ACH SUMIZYME.

15. SPEZYME FRED L; CuCON и LAMINEX BG.

16. SPEZYME FRED L; Aris SUMIZYME и LAMINEX BG.

17. SPEZYME FRED L и CuCONC.

18. SPEZYME FRED L; CuCONC и GC106.

19. SPEZYME FRED L и GC106.

20. SPEZYME FRED L и M1.

21. SPEZYME FRED L; Aris SUMIZYME и GC106.

22. SPEZYME FRED L; CuCONC; LAMINEX BG и GC106.

23. SPEZYME FRED L; ACH SUMIZYME и GC106.

24. SPEZYME FRED L; Aris SUMIZYME; LAMINEX BG и GC106.

25. CuCONC и LAMINEX BG.

26. SPEZYME FRED L и Aris SUMIZYME.

27. M1 и LAMINEX BG.

28. SPEZYME FRED L; LAMINEX BG и GC106.

29. CuCONC; LAMINEX BG и GC106.

Фермент пергидролаза

Выше описано, что один или более ферментов пергидролазы могут использовать в способах изобретения для удаления биопленки совместно со смесями ферментов.

В некоторых вариантах осуществления фермент пергидролаза встречается в природе (то есть фермент пергидролаза, кодируемый геномом клетки). В некоторых вариантах осуществления пергидролаза фермент содержит, состоит из или состоит по существу из аминокислотной последовательности, которая является по меньшей мере на приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 99,5% идентичной аминокислотной последовательности фермента пергидролазы, встречающегося в природе.

В некоторых вариантах осуществления фермент пергидролаза представляет собой встречающийся в природе фермент пергидролазу M. smegmatis. В некоторых вариантах осуществления фермент пергидролаза содержит, состоит из или состоит по существу из аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO:1 или разновидности, или ее гомолога. В некоторых вариантах осуществления фермент пергидролаза содержит, состоит из или состоит по существу из аминокислотной последовательности, которая является по меньшей мере на приблизительно 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 99,5% идентичной аминокислотной последовательности, описанной в SEQ ID NO:1.

Аминокислотная последовательность пергидролазы M. smegmatis показана ниже:

MAKRILCFGDSLTWGWVPVEDGAPTERFAPDVRWTGVLAQQLGADFEVIEEGL

SARTTNIDDPTDPRLNGASYLPSCLATHLPLDLVIIMLGTNDTKAYFRRTPLDIAL

GMSVLVTQVLTSAGGVGTTYPAPKVLVVSPPPLAPMPHPWFQLIFEGGEQKTTE

LARVYSALASFMKVPFFDAGSVISTDGVDGIHFTEANNRDLGVALAEQVRSLL

(SEQ ID NO:1)

Соответствующая полинуклеотидная последовательность, кодирующая пергидролазу M. Smegmatis представляет собой:

5'-ATGGCCAAGCGAATTCTGTGTTTCGGTGATTCCCTGACCTGGGGCTGGGTCC

CCGTCGAAGACGGGGCACCCACCGAGCGGTTCGCCCCCGACGTGCGCTGGA

CCGGTGTGCTGGCCCAGCAGCTCGGAGCGGACTTCGAGGTGATCGAGGAGG

GACTGAGCGCGCGCACCACCAACATCGACGACCCCACCGATCCGCGGCTCA

ACGGCGCGAGCTACCTGCCGTCGTGCCTCGCGACGCACCTGCCGCTCGACCT

GGTGATCATCATGCTGGGCACCAACGACACCAAGGCCTACTTCCGGCGCACC

CCGCTCGACATCGCGCTGGGCATGTCGGTGCTCGTCACGCAGGTGCTCACCA

GCGCGGGCGGCGTCGGCACCACGTACCCGGCACCCAAGGTGCTGGTGGTCTC

GCCGCCACCGCTGGCGCCCATGCCGCACCCCTGGTTCCAGTTGATCTTCGAG

GGCGGCGAGCAGAAGACCACTGAGCTCGCCCGCGTGTACAGCGCGCTCGCG

TCGTTCATGAAGGTGCCGTTCTTCGACGCGGGTTCGGTGATCAGCACCGACG

GCGTCGACGGAATCCACTTCACCGAGGCCAACAATCGCGATCTCGGGGTGGC

CCTCGCGGAACAGGTGCGGAGCCTGCTGTAA-3' (SEQ ID NO:2)

В некоторых вариантах осуществления фермент пергидрола