Способ получения рекомбинантного инсулина гларгина

Способ получения рекомбинантного инсулина гларгина

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к способам отделения и/или очистки примесей, дающим очищенный продукт гетерологичного белка, свободный от родственных примесей или с практически минимальными количествами данных гликозилированных примесей. Более конкретно изобретение относится к идентификации гликозилированных форм аналогов инсулина, таких как примеси гларгина, характеризующиеся постэкспрессией в системах на основе дрожжей, таких как Pichia pastoris. Изобретение также относится к способам, используемым для клонирования гена, кодирующего белок инсулина гларгина; инсерции соответствующего гена в подходящие дрожжи-хозяин; получения культуры рекомбинантного штамма, стимуляции экспрессии гетерологичного полипептида, его секреции и очистки после ферментации и соответствующих ферментных конверсий.

Уровень техники

Рекомбинантные формы инсулина, аналоги и/или производные инсулина получены в различных микробных экспрессирующих системах. В настоящее время такие организмы, как E.coli, S.cerevisiae, используют для коммерческого получения рекомбинантного человеческого инсулина и его производных. Вследствие ряда недостатков данных систем, таких как низкие уровни экспрессии, трудности последующей очистки и т.п., предпочтительно использование метилотрофных дрожжей Pichia pastoris в качестве системы экспрессии белка. Экспрессирующая система дает ряд преимуществ, например высокий уровень экспрессии, простая обработка, низкая стоимость производства, культура высокой плотности (US 6800606).

Дрожжевые экспрессирующие системы популярны, поскольку их легко выращивать, они быстро развиваются и масштабируются; однако некоторые дрожжевые экспрессирующие системы дают нестабильные результаты, и иногда трудно достигнуть высоких выходов. Одной из дрожжевых экспрессирующих систем, которая демонстрирует высокую перспективность, является метилотрофная Pichia pastoris. По сравнению с другими эукариотическими экспрессирующими системами Pichia дает много преимуществ, поскольку у нее отсутствует проблема эндотоксина, связанная с бактериями, или проблема заражения вирусами, характерная для белков, образуемых в культурах клеток животных (см. статью Cino, Am Biotech Lab, May 1999). Скорость продуктивного роста Pichia делает ее легко масштабируемой для широкомасштабного производства, хотя проблемы масштабирования включают контроль рН, ограничение кислорода, ограничение питательных веществ, колебания температуры и другие вопросы безопасности (см. статью Gottschalk, 2003, BioProcess IntI 1(4):54-61; Cino Am Biotech Lab, май 1999).

Хотя с экспрессирующими системами на основе дрожжей, таких как Pichia pastoris, связывают различные преимущества, одним из основных недостатков данной системы является посттрансляционная модификация полученных в результате белков, которые затем присутствуют в качестве примесей в конечном продукте, который трудно очистить. Несмотря на то, что известен ряд посттрасляционных модификаций белков, наиболее распространенной формой посттрансляционной модификации является гликозилирование (см. статью Hart G.W, Glycosylation, Curr. Opin. Cell. Biol 1992; 4:1017). Гликозилирование может быть либо N-связанным, либо O-связанным в зависимости от экспрессирующей системы (см. статью Gemmill TR et al., Overview of N- and O- linked oligosaccharide structures found in various yeast species (Обзор N- и O-связанных олигосахаридных структур, обнаруженных в различных видах дрожжей), Biochemica et Biophysica Acta, 1999; 1426:227). Гликозилирование влияет на стабильность конформации белка, иммуногенность, скорость выведения, защиту от протеолиза и повышает растворимость белка (см. статью Walsh G, Biopharmaceutical benchmarks 2006, Nature Biotechnology, 2006; 24:769).

Несмотря на большие успехи в усовершенствовании биотехнологического производства, не существует никаких общих решений для каждого белка. Способ производства специфического терапевтического белка требует новых и инновационных решений проблем, которые могут быть специфическими для данного белка или семейства белков. Аналогично удачные варианты коммерческого применения часто основаны на сочетании специфических свойств белка или семейства белков и способов получения, используемых для производства данного белка или семейства белков в качестве фармацевтических продуктов.

Настоящее изобретение относится к идентификации различных гликоформ аналогов инсулина, более конкретно инсулина гларгина, посредством химических способов идентификации, связанных с методами масс-спектрометрии, таких как электроспрей ионизация и ионизация путем матричной лазерной десорбции. Таким образом изобретение будет давать возможность избирательной очистки продукта от вышеуказанных примесей с помощью оптимизированных дальнейших способов очистки, связанных с более глубоким пониманием природы примесей, присутствующих в конечном продукте. Конечный продукт, очищенный таким образом, будет в существенной степени свободен от примесей, описанных в данном изобретении.

US 4444683 и родственные ей заявки раскрывают гликозилированные инсулины, в которых глюкоза или манноза, которые связаны с инсулином через спейсерную группу, получены из дикарбоновых кислот, ангидридов кислот или фениламинов либо их комбинаций.

WO 90/10645, в частности, раскрывает гликозилированный инсулин, содержащий одну или более моносахаридных групп либо одну или более олигосахаридных групп, содержащих до трех сахарных групп. Описаны моногликозилированные или тригликозилированные инсулины в положениях А1, В1 или В29.

WO 99/52934 заявляет способ отделения гликозилированных белков от негликозилированных белков путем хроматогрфической обработки раствора, содержащего гликозилированные и негликозилированные белки, с использованием содержащего Са++ элюента и получения фракции, содержащей негликозилированные белки, причем указанная фракция в существенной степени свободна от гликозилированных белков.

Гликоформы гларгина не раскрыты ни в одном из материалов, соответствующих предшествующему уровню техники. В изобретении обсуждают способы очистки аналогов инсулина, таких как инсулин гларгин с пониженными уровнями данных охарактеризованных гликозилированных примесей, для получения продукта гларгина 100% чистоты после ферментации с помощью экспрессирующих систем на основе дрожжей.

Раскрытие изобретения

Основной целью настоящего изобретения является разработка способа получения очищенного биологически активного гетерологичного белка, рекомбинантно экспрессирующегося в дрожжевой экспрессирующей системе, отличающегося тем, что указанный очищенный белок свободен от или содержит практически минимальные количества гликозилированных побочных продуктов.

Другой целью настоящего изобретения является разработка способа получения очищенного биологически активного гетерологичного белка, рекомбинантно экспрессируемого в клетке-хозяине.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа получения очищенного биологически активного гетерологичного белка.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение очищенного биологически активного продукта гетерологичного белка с чистотой по меньшей мере 96%.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение очищенного биологически активного продукта гетерологичного белка с чистотой, лежащей в интервале 97-100%.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение очищенного инсулина гларгина с чистотой по меньшей мере 96%.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение очищенного инсулина гларгина, содержащего меньше чем 1% гликозилированных примесей.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение очищенного инсулина гларгина, свободного от гликозилированных примесей.

Еще одной целью настоящего изобретения является получение очищенного инсулина гларгина, свободного от гликозилированных примесей, причем гликозилированная форма белка может быть моногликозилированной, тригликозилированной или полигликозилированной.

Соответственно, настоящее изобретение относится: к способу получения очищенного биологически активного гетерологичного белка, рекомбинантно экспрессирующегося в дрожжевой экспрессирующей системе, отличающемуся тем, что указанный очищенный белок свободен или содержит практически минимальные количества гликозилированных побочных продуктов; способу получения очищенного биологически активного гетерологичного белка, рекомбинантно экспрессирующегося в клетке-хозяине, причем способ включает стадии: а) культивирования клеток-хозяев, трансформированных вектором, содержащим последовательность ДНК, определенную формулой I, кодирующей гетерологичный белок, в условиях, подходящих для экспрессии белка; b) выделения экспрессирующегося белка, включающего выделение указанного белка из клеток-хозяев для получения препарата выделенного белка; с) обработки белка, выделенного на стадии (b), на стадии кристаллизации; d) проведение стадии ферментной конверсии в присутствии трипсина или фермента, подобного трипсину; е) очистку указанного белка, содержащего по меньшей мере одну родственную примесь, включающую контактирование указанной смеси белков с хроматографической матрицей, причем очистку проводят с использованием полярного органического буферного растворителя в водной фазе, содержащей буфер на основе органической кислоты; и f) осаждение элюированного белка; способу получения очищенного биологически активного гетерологичного белка по п.9, который предусматривает: а) инокуляцию водной ферментационной среды трансформантом штамма дрожжей, несущим экспрессирующий вектор, который направляет экспрессию указанного белка; и b) выращивание трансформированного штамма в ферментационной среде в условиях, эффективных в плане экспрессии указанного белка; к очищенному биологически активному гетерологичному белку с чистотой по меньшей мере 96%; очищенному биологически активному продукту гетерологичного белка с чистотой, лежащей в интервале 97-100%; очищенному инсулину гларгину с чистотой по меньшей мере 96%; очищенному инсулину гларгину, содержащему меньше чем 1% гликозилированных примесей; очищенному инсулину гларгину, свободному от гликозилированных примесей; и очищенному инсулину гларгину, причем гликозилированная форма белка может быть моногликозилированной, тригликозилированной или полигликозилированной.

Настоящее изобретение относится к способу получения очищенного биологически активного гетерологичного белка, рекомбинантно экспрессирующегося в дрожжевой экспрессирующей системе, отличающемуся тем, что указанный очищенный белок свободен или содержит практически минимальные количества гликозилированных побочных продуктов.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения ДНК, кодирующая гетерологичный белок, представлена формулой I

Х-В-Y-А,

в которой

Х представляет собой последовательность лидерного пептида, содержащую по меньшей мере одну аминокислоту;

В представляет собой последовательность аминокислот В-цепи молекулы инсулина, ее производных или аналогов;

Y представляет собой линкерный пептид, содержащий по меньшей мере две аминокислоты;

А представляет собой последовательность аминокислот А-цепи молекулы инсулина, ее производных или аналогов и А- и В-цепь могут быть модифицированы заменой, делецией и/или добавлениями аминокислот.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения линкерный пептид может представлять собой любую последовательность, содержащую по меньшей мере две аминокислоты, при условии, что первые две аминокислоты представляют собой "RR".

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный белок определен SEQ ID:1 или SEQ ID:2.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин дрожжевой экспрессирующей системы выбрана из Pichia sp.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин дрожжевой экспрессирующей системы выбрана из группы, включающей Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces cerevisiae, Schisosaccharomyces pombe, Yarrovia lipolitica, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения гликозилированная форма белка может быть моногликозилированной, тригликозилированной или полигликозилированной.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный очищенный белок содержит меньше чем 1% гликозилированных примесей.

Настоящее изобретение также относится к способу получения очищенного биологически активного гетерологичного белка, рекомбинантно экспрессирующегося в клетке-хозяине, причем способ предусматривает стадии:

a) культивирования клеток-хозяев, трансформированных вектором, содержащим последовательность ДНК, определенную формулой I, кодирующей гетерологичный белок в условиях, подходящих для экспрессии белка;

b) выделения экспрессированного белка, включающего отделение указанного белка от клеток-хозяев с целью получения препарата выделенного белка;

c) воздействия на выделенный белок, соответствующий стадии (b), для проведения стадии кристаллизации;

d) проведения стадии ферментной конверсии в присутствии трипсина или фермента, подобного трипсину;

e) очистки указанного белка, содержащего по меньшей мере одну родственную примесь, предусматривающей контактирование указанной смеси белков с хроматографической матрицей, причем очистку осуществляют с использованием полярного органического буферного растворителя в водной фазе, содержащей буфер на основе органической кислоты, и

f) осаждения элюированного белка.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения ДНК, кодирующая гетерологичный белок, представлена формулой I

Х-B-Y-A

в которой

Х представляет собой последовательность лидерного пептида, содержащую по меньшей мере одну аминокислоту;

В представляет собой последовательность аминокислот В-цепи молекулы инсулина, ее производных или аналогов;

Y представляет собой линкерный пептид, содержащий по меньшей мере две аминокислоты;

А представляет собой последовательность аминокислот А-цепи молекулы инсулина, ее производных или аналогов, и А- и В-цепь могут быть модифицированы заменой, делецией и/или добавлениями аминокислот.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения линкерный пептид может представлять собой любую последовательность, содержащую по меньшей мере две аминокислоты, при условии, что первые две аминокислоты представляют собой "RR".

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения ген, определенный SEQ ID 1 или 2, клонирован в рамке считывания с сигнальным пептидом.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения ген, определенный SEQ ID 1 или 2, клонирован в рамке считывания с сигнальным пептидом mat-or.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин выбрана Pichia sp.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин выбрана из группы, содержащей Pichia pastoris, Pichia methanolica, Saccharomyces cerevisiae, Schisosaccharomyces pombe, Yarrovia lipolitica, Hansenula polymorpha, Kluyveromyces lactis.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин представляет собой Pichia pastoris.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения штамм-хозяин представляет собой GS115.

Настоящее изобретение также относится к способу получения очищенного биологически активного гетерологичного белка, который предусматривает:

a) инокуляцию водной ферментационной среды трансформантом штамма дрожжей, несущим экспрессирующий вектор, который направляет экспрессию указанного белка, и

b) выращивание трансформированного штамма в ферментационной среде в условиях, эффективных для экспрессии указанного белка.

Настоящее изобретение также относится к способу получения очищенного биологически активного гетерологичного белка, причем экспрессирующийся белок выделяют из ферментационного бульона с использованием ионообменной хроматографии.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ содержит стадию кристаллизации белка путем добавления хлорида цинка и фенола.

Настоящее изобретение также относится к способу получения очищенного биологически активного гетерологичного белка, причем указанный способ предусматривает стадию ферментной конверсии, осуществляемую в присутствии трипсина в смешивающемся с водой органическом растворителе.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения смешивающийся с водой органический растворитель выбран из группы, включающей ДМСО (диметилсульфоксид), ДМФ (диметилформамид), этанол, ацетон, ацетонитрил, этилацетат или их смеси.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения указанный способ предусматривает стадию очистки ОФ-ВЭЖХ (обращенно-фазовой ВЭЖХ) смеси белков, содержащей по меньшей мере одну родственную примесь, путем контактирования указанной смеси белков с матрицей хроматографической смолы, причем очистку проводят с использованием полярного органического буферного растворителя в водной фазе, содержащей буфер на основе органической кислоты.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения полярный буферный растворитель представляет собой ацетонитрил.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения буфер на основе органической кислоты выбран из группы, содержащей лимонную кислоту, уксусную кислоту, борную кислоту, муравьиную кислоту, хлористоводородную кислоту и фосфорную кислоту.

Настоящее изобретение также относится к продукту очищенного биологически активного гетерологичного белка, полученному согласно любому из предшествующих пунктов формулы, с чистотой по меньшей мере 96%.

Настоящее изобретение также относится к способу получения продукта очищенного, биологически активного гетерологичного белка с чистотой, лежащей в интервале 97-100%.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен очищенный инсулин гларгин с чистотой по меньшей мере 96%.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен очищенный инсулин гларгин, содержащий меньше чем 1% гликозилированных примесей.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения очищенный инсулин гларгин не содержит гликозилированных примесей.

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен очищенный инсулин гларгин, причем гликозилированная форма белка может быть моногликозилированной, тригликозилированной или полигликозилированной.

Теперь будет сделана подробная ссылка на представленные в настоящее время предпочтительные варианты осуществления изобретения, которые вместе со следующим примером служат для объяснения принципов изобретения.

Нижеследующие примеры приведены, чтобы помочь в понимании изобретения, но они не предназначены и их не следует истолковывать как ограничивающие его объем каким-либо образом. Примеры не включают детальные описания принятых способов, используемых для конструирования векторов, инсерции генов, кодирующих полипептиды, в данные векторы или интродукции полученных в результате плазмид в хозяев. Кроме того, примеры не включают детальное описание принятых способов, используемых для анализа полипептидов, продуцируемых данными векторными системами хозяина. Данные способы хорошо известны обычным специалистам в области техники и описаны в многочисленных публикациях, включенных в виде примеров.

Согласно одному из аспектов изобретения представлен способ получения очищенного, биологически активного гетерологичного белок, рекомбинантно экспрессирующегося в клетке-хозяин, причем способ включает стадии:

a) культивирования клеток-хозяев, трансформированных вектором, содержащим последовательность ДНК, определенную SEQ ID 1 или 2, кодирующей гетерологичный белок в условиях, подходящих для экспрессии белка;

b) выделения экспрессирующегося белка, включающего отделение указанного белка от клеток-хозяев с целью получения препарата выделенного белка;

c) воздействия на выделенный белок, соответствующий стадии (b), для проведения стадии кристаллизации;

d) проведения стадии ферментной конверсии в присутствии трипсина или фермента, подобного трипсину;

е) очистки указанного белка, содержащего по меньшей мере одну родственную примесь, предусматривающей контактирование указанной смеси белков с хроматографической матрицей, причем очистку осуществляют с использованием полярного органического буферного растворителя в водной фазе, содержащей буфер на основе органической кислоты,

f) осаждения элюированного белка.

Определения:

Термины "клетки" или "культуры клеток" или "рекомбинантные клетки-хозяева" или "клетки-хозяева" часто используют взаимозаменяемо, как будет ясно из контекста. Данные термины включают непосредственную данную клетку, которая экспрессирует требуемый белок, соответствующий настоящему изобретению, и, конечно, их потомство. Следует понимать, что не все потомство абсолютно идентично родительской клетке вследствие случайных мутаций или различий в окружающей среде. Однако данное измененное потомство включено в данные термины до тех пор, пока потомство сохраняет характеристики, соответствующие тем, которые присущи исходной трансформированной клетке.

Как используют в данном контексте, термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. Термин "экспрессирующий вектор" включает плазмиды, космиды или фаги, способные синтезировать данные белки, кодируемые соответствующими им рекомбинантными генами, переносимыми вектором. Предпочтительными векторами являются векторы, способные к автономной репликации и/или экспрессии нуклеиновых кислот, с которыми они связаны. В настоящей заявке термины "плазмида" и "вектор" используют взаимозаменяемо, поскольку плазмида представляет собой наиболее часто используемую форму вектора. Более того, изобретение предусматривает включение данных других форм экспрессирующих векторов, которые выполняют эквивалентные функции и которые станут известны в области техники после появления данного материала.

Имеют в виду, что полипептиды, на которые ссылаются в данном контексте, как на обладающие активностью инсулина гларгина, например, представляют собой инсулин гларгин, имеют последовательность аминокислот с двумя изменениями структуры человеческого инсулина: замену аминокислотой глицином нативного аспарагина в положении А21 А-цепи человеческого инсулина и добавление двух молекул аргинина в NH2-концевую часть В-цепи человеческого инсулина, полученного технологией рекомбинантной ДНК. Первичным действием любого инсулина, включая инсулин гларгин, является регуляция метаболизма глюкозы. Инсулин и его аналоги снижают уровни глюкозы в крови путем стимуляции периферического поглощения глюкозы, особенно в скелетной мускулатуре и жире, и путем ингибирования образования глюкозы в печени.

ДНК, кодирующая гетерологичный белок, представлена формулой I

Х-В-Y-A

в которой

Х представляет собой последовательность лидерного пептида, содержащую по меньшей мере одну аминокислоту;

В представляет собой последовательность аминокислот В-цепи молекулы инсулина, ее производных или аналогов;

Y представляет собой линкерный пептид, содержащий по меньшей мере две аминокислоты;

А представляет собой последовательность аминокислот А-цепи молекулы инсулина, ее производных или аналогов, и А- и В-цепь могут быть модифицированы заменой, делецией и/или добавлениями аминокислот.

Термин "С-пептид" или "линкерный пептид", как используют в данном контексте, включает все формы С-пептида инсулина, включая нативные или синтетические пептиды. Данные С-пептиды инсулина могут представлять собой человеческие пептиды или могут быть выделены у других видов и родов животных, предпочительно млекопитающих. Таким образом варианты и модификации нативного С-пептида инсулина включены до тех пор, пока они сохраняют активность С-пептида инсулина. В области техники известно, что можно модифицировать последовательности белков или пептидов, пока сохраняется их полезная активность, и этого можно достигнуть при использовании способов, которые являются стандартными в области техники и широко описаны в литературе, например, ненаправленный или сайт-направленный мутагенез, расщепление и лигирование нуклеиновых кислот и т.п. Таким образом, функционально эквивалентные варианты или производные нативных последовательностей С-пептида инсулина могут быть легко получены согласно способам, хорошо известным в области техники, и включают последовательности пептидов, обладающих функциональной, например биологической, активностью нативного С-пептида инсулина. Все данные аналоги, варианты, производные или фрагменты С-пептида инсулина, в частности, включены в объем данного изобретения и объединены под термином "С-пептид инсулина".

Линкерная последовательность может представлять собой любую последовательность, имеющую по меньшей мере две аминокислоты. Линкерный участок может включать от 2 до 25, от 2 до 15, от 2 до 12 или от 2 до 10 аминокислотных остатков, хотя длина не является важной и может быть подобрана для удобства или согласно необходимости.

Линкерный пептид может представлять собой любую последовательность, содержащую по меньшей мере две аминокислоты при условии, что первые две аминокислоты представляют собой "RR". Более того, как правило, будут иметь в виду, что в некоторых случаях будет полезным получить гомологи форм данного белка инсулина гларгина, которые представляют собой либо агонисты, либо антагонисты только подгруппы биологических активностей данного белка. Таким образом можно получить специфические биологические эффекты путем лечения гомологом ограниченной функции и с меньшими побочными эффектами.

В одном варианте осуществления нуклеиновая кислота, соответствующая изобретению, кодирует полипептид, который представляет собой либо агонист, либо антагонист белка человеческого инсулина гларгина и содержит последовательность аминокислот, представленную SEQ ID No:2. Предпочтительные нуклеиновые кислоты кодируют пептид, обладающий активностью белка инсулина гларгина и по меньшей мере на 90% гомологичный, более предпочтительно на 95% гомологичный и наиболее предпочтительно на 97% гомологичный последовательности аминокислот, приведенной в SEQ ID No:2. Нуклеиновые кислоты, которые кодируют агонистические или антагонистические формы белка инсулина гларгина и имеют гомологию по меньшей мере приблизительно 98-99% с последовательностью, приведенной в SEQ ID No:2, также входят в объем изобретения. Предпочтительно, когда нуклеиновая кислота представляет собой молекулу кДНК, содержащую по меньшей мере часть нуклеотидной последовательности, кодирующей белок инсулина гларгина, приведенный в SEQ ID No.1.

Термин "функциональные элементы", как обсуждают в данном контексте, включает по меньшей мере один промотор, по меньшей мере один оператор, по меньшей мере одну лидерную последовательность, по меньшей мере одну последовательность Шайна-Дальгарно, по меньшей мере один кодон терминатора и любые другие последовательности ДНК, необходимые или предпочтительные для правильной транскрипции и последующей трансляции векторной ДНК. В частности, предусматривают, что данные векторы будут содержать по меньшей мере один ориджин репликации, распознаваемый микроорганизмом-хозяином, вместе с по меньшей мере одним выбираемым маркером и по меньшей мере одной промоторной последовательностью, способной инициировать транскрипцию синтетической последовательности ДНК. Кроме того, предпочтительно, когда вектор в одном варианте осуществления содержит ряд последовательностей ДНК, способных действовать как регуляторы, и другие последовательности ДНК, способные кодировать регуляторный белок. Данные регуляторы в одном из вариантов осуществления служат для предупреждения экспрессии последовательности ДНК при некоторых условиях окружающей среды, а при других условиях окружающей среды дают возможность транскрипции и последующей экспрессии белка, кодируемого последовательностью ДНК.

Кроме того, предпочтительно, когда присутствует соответствующая секреторная лидерная последовательность либо в векторе, либо на 5'-конце последовательности ДНК. Лидерная последовательность находится в положении, которое позволяет лидерной последовательности непосредственно прилегать к начальной части нуклеотидной последовательности, способной направлять экспрессию ингибитора требуемого белка без какого-либо нарушения сигналов терминации трансляции. Присутствие лидерной последовательности требуется отчасти по одной или более из следующих причин:

1) присутствие лидерной последовательности может облегчать процессинг хозяином исходного продукта с получением продукта зрелого рекомбинантного белка;

2) присутствие лидерной последовательности может облегчать очистку продукта рекомбинантного белка, направляя ингибитор протеазы из цитоплазмы клетки;

3) присутствие лидерной последовательности может действовать на способность продукта рекомбинантного белка укладываться в свою активную структуру, направляя белок из цитоплазмы клетки.

Термин "последовательность регуляции транскрипции" является генетическим термином, используемым на протяжении описания в отношении последовательностей ДНК, таких как сигналы инициации, энхансеры и промоторы, которые индуцируют или контролируют транскрипцию последовательностей, кодирующих белок, с которыми они функционально связаны. В предпочтительных вариантах осуществления транскрипция гена рекомбинантного инсулина гларгина находится под контролем промоторной последовательности (или другой последовательности регуляции транскрипции), которая контролирует экспрессию рекомбинантного гена в типе клеток, в котором планируют осуществить экспрессию.

Термин "контролирующие последовательности" относится к последовательностям ДНК, необходимым для экспрессии функционально связанной кодирующей последовательности в конкретном организме-хозяине. Контролирующие последовательности, которые подходят для прокариот, например, включают промотор, необязательно последовательность оператора, сайт связывания рибосом и, возможно, другие, пока еще недостаточно понятные последовательности. Эукариотические клетки, как известно, используют промоторы, сигналы полиаденилирования и энхансеры.

Термин "трансформация" означает интродукцию ДНК в организм, так что ДНК реплицируется либо как внехромосомный элемент, либо путем интеграции в хромосому. В зависимости от используемой клетки-хозяина трансформацию осуществляют с использованием стандартных способов, подходящих для данных клеток. Основные аспекты трансформаций системы клеток млекопитающих-хозяев описаны Axel в патенте США No.4399216, выданном 16 августа 1983 г. Трансформации в дрожжах, как правило, проводят согласно способу, описанному в статьях Van Solingen, P., et al., J. Bad, 130: 946 (1977) и Hsiao, С.L, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76: 3829 (1979).

Рекомбинантную экспрессирующую систему выбирают из прокариотических и эукариотических хозяев. Эукариотические хозяева включают дрожжевые клетки (например, Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris), клетки млекопитающих или клетки растений. Бактериальные и эукариотические клетки доступны для компетентных специалистов в области техники в ряде различных источников, включая коммерческие источники, например, Американскую коллекцию типовых культур (АТСС; Rockville, Md.). Коммерческие источники клеток, используемых для экспрессии рекомбинантных белков, представляют также инструкции по использованию клеток. Выбор экспрессирующей системы зависит от свойств, необходимых для экспрессируемого полипептида.

Следовательно, целью настоящего изобретения является экспрессирующая система или кассета, которая является функциональной в клетке, выделенной из дрожжей, выбранных из группы, состоящей из штамма Pichia, особенно выбранных из группы, состоящей из Pichia pastoris, Pichia methanolica и Schizosaccharomyces pombe, и дающей возможность экспрессии требуемого полипептида, кодирующего фрагменты его белка, помещенная под контроль элементов, необходимых для его экспрессии.

Термин "рекомбинантный", как используют в данном контексте для описания белка или полипептида, означает полипептид, образованный путем экспрессии рекомбинантного полинуклеотида. Термин "рекомбинантный", как используют в данном контексте в отношении клеток, означает клетки, которые могут быть или были использованы в качестве реципиентов для рекомбинантных векторов или другого переноса ДНК, и включает потомство исходной клетки, которая была трансфицирована. Следует понимать, что потомство одной родительской клетки может не быть полностью идентичным исходному родителю по морфологии или комплементу геномной либо общей ДНК вследствие случайной или направленной мутации. Потомство родительской клетки, которое достаточно близко родителю, характеризуемое соответствующим свойством, таким как присутствие нуклеотидной последовательности, кодирующей требуемый полипептид, также считают потомством.

"Ген, представляющий интерес" (далее ГПИ), является любой последовательностью нуклеиновой кислоты, повышенная транскрипционная экспрессия которой необходима. ГПИ может кодировать функциональную молекулу нуклеиновой кислоты (например, РНК, такую как антисмысловая молекула РНК) или, более типично, кодирует пептид, полипептид или белок, повышенная продукция которого необходима. Векторы, соответствующие изобретению, можно использовать для экспрессии "гетерологичного" белка. Как используют в данном контексте, термин "гетерологичный" означает последовательность нуклеиновой кислоты или полипептид, которые происходят из других видов или которые в значительной степени модифицированы относительно их исходной формы, если они происходят от одного и того же вида. Более того, модифицированные или немодифицированные последовательности нуклеиновой кислоты или полипептид, которые в норме не экспрессируются в клетке, считают гетерологичными. Векторы, соответствующие изобретению, могут иметь один или более ГПИ, введенные в один и тот же или различные сайты инсерции, причем каждый ГПИ функционально связан с регуляторной последовательностью нуклеиновой кислоты, которая обеспечивает возможность экспрессии ГПИ.

Термин "очистка" пептида из композиции, содержащей пептид и одну или более примесей, означает повышение, таким образом, степени чистоты пептида в композиции путем снижения содержания по меньшей мере одной примеси из композиции пептидов. Более конкретно способ очистки, соответствующий настоящему изобретению, дает в результате биологически активный гетерологичный белок, рекомбинантно экспрессирующийся в дрожжевой экспрессирующей системе, отличается тем, что указанный очищенный белок свободен или содержит практически минимальные количества гликозилированных побочных продуктов.

Помимо гликозилированных форм, с помощью MALDI (m/Z: 6089) подтверждают наличие неполярных примесей. Присутствие данной неполярной примеси варьирует в интервале 0-0,5% в конечном продукте, который получают во время процессинга гларгина. Разница в массе между гларгином (m/z: 6063) и неполярными примесями (m/z: 6089) составляет 26 единиц. Химическая идентичность, основанная на молекулярной массе, указывает на вероятность потери воды в одной из аминокислот и ацетилирование.

Термин "хроматография" относится к способу, которым представляющее интерес растворенное вещество в смеси отделяют от других растворенных веществ в смеси в результате различий в скоростях, с которыми индивидуальные растворимые вещества смеси проходят через стационарную среду под воздействием подвижной фазы, или в процессах связывания и элюции.

Термин "высокоэффективная жидкостная хроматография", как используют в данном контексте, относится к такой хроматографической процедуре, в которой частицы (стационарная фаза), используемые в упаковке колонки, маленькие (от 3 до 50 мк) и правильной формы с незначительными отклонениями от выбранного размера. В данной хроматографии, как правило,