Сочетание рекомбинантной микробактерии и биологически активного средства в качестве вакцины

Сочетание рекомбинантной микробактерии и биологически активного средства в качестве вакцины

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Настоящее изобретение относится к сочетанию, содержащему по меньшей мере два компонента, к применению такого сочетания в качестве фармацевтической композиции и в производстве лекарственного средства, к способам лечения пациента с использованием такого сочетания, а также к способу промышленного получения такого сочетания.

Современная молекулярная медицина уделяет большое внимание применению иммуногенных соединений или соединений, модулирующих иммунную систему пациента, для лечения такого пациента. Заболевания, которые можно лечить с помощью таких соединений, включают в себя, в числе прочих, опухоли и инфекционные заболевания.

В обоих случаях антигенные соединения, т.е. соединения, способные вызывать или усиливать иммунный ответ, вводят в организм пациента. Однако применение указанных соединений ограничено в тех случаях, когда для достижения соответствующих клиническим требованиям эффективности и интенсивности воздействия требуется усиление иммунного ответа. Такого усиления можно достичь путем повторного введения указанного средства или путем применения адъюванта.

На предыдущем уровне техники предлагаются различные адъюванты, такие как минеральные масла, инактивированные микобактерии, соединения алюминия и т.п.

Однако известные в данной области адъюванты не всегда удовлетворяют потребностям медицины, особенно при использовании новых способов лечения, таких как применение клеток, экспрессирующих цитокины, которые описаны, например, в международной патентной заявке PCT/US94/01631.

Таким образом, основной задачей настоящего изобретения является получение композиций, более конкретно, фармацевтических композиций, которые содержат по меньшей мере первый компонент и второй компонент, где первый компонент представляет собой адъювант, а второй компонент представляет собой биологически активное средство.

В первом аспекте данная задача решается благодаря сочетанию, включающему в себя первый компонент и второй компонент, где первый компонент представляет собой бактериальную клетку, содержащую по меньшей мере одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или полипептид фаголизосомального истечения (пептид или полипептид, способствующий транспортировке соединений из фаголизосомы); и где второй компонент представляет собой биологически активное средство.

В одном из вариантов осуществления бактериальная клетка является дефицитной по уреазе.

В другом варианте осуществления бактериальная клетка представляет собой клетку Mycobacterium.

В предпочтительном варианте осуществления клетка представляет собой клетку Mycobacterium bovis.

В предпочтительном варианте осуществления нуклеиновая кислота бактериальной клетки, кодирующая по меньшей мере одну клеточную субъединицу уреазы, является инактивированной.

В более предпочтительном варианте осуществления инактивированной является последовательность, кодирующая по меньшей мере субъединицу С бактериальной уреазы.

В одном из вариантов осуществления домен фаголизосомального истечения представляет собой домен фаголизосомального истечения Listeria.

В одном из вариантов осуществления фаголизосомальный домен кодирует молекула нуклеиновой кислоты, выбранная из группы, состоящей из

a) нуклеотидной последовательности, содержащей нуклеотиды 211-1722, как показано в SEQ ID NO: 1;

b) нуклеотидной последовательности, кодирующей такую же аминокислотную последовательность, как и последовательность пункта a); и

c) нуклеотидной последовательности, гибридизующейся в жестких условиях с последовательностью пункта a) или b).

В одном из вариантов осуществления бактериальная клетка содержит по меньшей мере одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или полипептид, способный индуцировать иммунный ответ у млекопитающего.

В предпочтительном варианте осуществления пептид или полипептид выбирают из аутоантигенов, опухолевых антигенов, вирусных антигенов, паразитарных антигенов, бактериальных антигенов и их иммуногенных фрагментов.

В другом предпочтительном варианте осуществления пептид или полипептид является частью слитого полипептида.

В одном из вариантов осуществления слитый полипептид содержит

a) по меньшей мере один домен полипептида, где полипептидный домен способен вызывать иммунный ответ у млекопитающего, и

b) домен фаголизосомального истечения.

В предпочтительном варианте осуществления полипептид представляет собой полипептид по пункту 9 или его часть.

В другом предпочтительном варианте осуществления домен фаголизосомального истечения представляет собой домен фаголизосомального истечения по любому из пунктов 1-11.

В предпочтительном варианте осуществления бактериальная клетка представляет собой rBCG:Hly или rBCGΔureC:Hly.

В одном из вариантов осуществления биологически активное средство представляет собой эукариотическую клетку, более предпочтительно, генетически измененную эукариотическую клетку, которая экспрессирует цитокин.

В предпочтительном варианте осуществления цитокин выбран из группы, включающей в себя интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин-12 и интерферон-гамма.

В более предпочтительном варианте осуществления клетка одновременно экспрессирует два или более цитокинов.

В еще более предпочтительном варианте осуществления клетка одновременно экспрессирует IL-2 и интерферон-гамма.

В предпочтительном варианте осуществления клетка является аутологичной по отношению к субъекту, которому вводят или собираются вводить данную клетку и/или композицию.

В предпочтительном альтернативном варианте осуществления клетка является аллогенной по отношению к субъекту, которому вводят или собираются вводить данную клетку и/или композицию.

В предпочтительном варианте осуществления клетка выбрана из группы, включающей в себя непрофессиональные антиген-презентирующие клетки, профессиональные антиген-презентирующие клетки, опухолевые клетки и дендритные клетки.

В более предпочтительном варианте осуществления опухолевая клетка представляет собой клетку иммуногенной опухоли, где опухолевая клетка предпочтительно выбрана из группы, включающей в себя клетки меланомы, клетки рака почки, клетки опухоли молочной железы, клетки опухоли мозга, клетки опухоли простаты, клетки немелкоклеточной карциномы легкого, клетки карциномы толстой кишки, клетки сквамозной опухоли головы и шеи.

В предпочтительном варианте осуществления клетка является аллогенной и сингенной по антигенам HLA класса I.

В другом предпочтительном варианте осуществления клетка экспрессирует другую иммунную молекулу, выбранную из группы, включающей в себя цитокин, молекулу адгезии, кофактор стимуляции, ассоциированный с опухолью антиген, опухолеспецифический антиген и паразитарный антиген.

В более предпочтительном варианте осуществления паразитарный антиген представляет собой белок gp190/MSP1 Plasmodium, предпочтительно Plasmodium falciparum, или его фрагмент, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего.

В предпочтительном варианте осуществления биологически активное средство представляет собой белок gpl90/MSPl Plasmodium, предпочтительно Plasmodium falciparum, или его фрагмент, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего.

В одном из вариантов осуществления биологически активное средство представляет собой человеческий цитомегаловирус.

В предпочтительном варианте осуществления биологически активное средство представляет собой вирусную частицу или совокупность вирусных частиц, предпочтительно высвобождаемых после инфицирования клеток млекопитающего человеческим цитомегаловирусом, при этом частицы (a) окружены липидной мембраной, в которую внедрены вирусные гликопротеины, и (b) не содержат ни вирусной ДНК, ни капсидов.

В предпочтительном варианте осуществления частицы содержат слитый белок, включающий в себя одну или несколько частей T-клеточного антигена pp65 (UL83) и одну или несколько частей одного или нескольких белков, отличных от pp65.

В предпочтительном варианте осуществления T-клеточный антиген pp65 слит с одним или несколькими фрагментами гликопротеина человеческого цитомегаловируса, где гликопротеин выбран из группы, включающей в себя гликопротеин gH HCMV, белок IE₁ (ppUL123) HCMV и гликопротеин gB HCMV.

В предпочтительном варианте осуществления T-клеточный антиген слит с одним или несколькими фрагментами белка, который является частью человеческого патогена, отличного от HCMV.

В предпочтительном варианте осуществления патоген выбран из группы, включающей в себя HIV-I, HBV, HCV и вирус гриппа.

В предпочтительном варианте осуществления частица(ы) содержит фрагменты по меньшей мере двух гликопротеинов, которые являются вариантами конкретных гликопротеинов из разных штаммов HCMV.

В более предпочтительном варианте осуществления один из двух вариантов конкретного гликопротеина HCMV представляет собой вариант, полученный из штамма HCMV Towne, а другой представляет собой вариант, полученный из штамма HCMV Ad169.

В предпочтительном варианте осуществления клетки млекопитающего представляют собой фибробласты, предпочтительно, фибробласты крайней плоти.

В предпочтительном варианте осуществления частица представляет собой плотное тело.

В предпочтительном варианте осуществления биологически активное средство представляет собой плотное тело, предпочтительно, плотное тело HCMV или плотное тело, определенное в данном описании.

В одном из вариантов осуществления биологически активное средство представляет собой антиген микобактерии, предпочтительно Mycobacterium ssp.

В предпочтительном варианте осуществления микобактерия выбрана из группы, включающей в себя M.tuberculosis, M.bovis, M.canettii, M.africanum и M.paratuberculosis.

В предпочтительном варианте осуществления антиген представляет собой антиген 85.

Во втором аспекте задача настоящего изобретения решается благодаря композиции, предпочтительно фармацевтической композиции, содержащей сочетание, предлагаемое в первом аспекте настоящего изобретения, и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.

В третьем аспекте задача настоящего изобретения решается благодаря сочетанию, предлагаемому в первом аспекте настоящего изобретения, или сочетанию, предлагаемому во втором аспекте настоящего изобретения, или каждому из компонентов такого сочетания, в производстве лекарственного средства.

В одном из вариантов осуществления лекарственное средство предназначено для профилактики и/или лечения заболевания, выбранного из группы, включающей в себя раковые и инфекционные заболевания.

Специалисты в данной области могут подтвердить, что композицию настоящего изобретения и ее компоненты, по отдельности или в сочетании, желательно использовать для профилактики заболевания. Соответствующие предпочтительные варианты осуществления основаны на том факте, что первый компонент сочетания способен вызывать иммунный ответ, более конкретно, специфический иммунный ответ, который позволяет соответствующему организму человека или животного бороться с заболеванием до проявления заболевания, более конкретно, до проявления клинических или медицинских симптомов заболевания.

В предпочтительном варианте осуществления рак представляет собой иммуногенную опухоль, где опухоль предпочтительно выбрана из группы, включающей в себя рак простаты, меланому, рак почки, опухоль молочной железы, опухоли мозга, немелкоклеточную карциному легкого, рак толстой кишки и сквамозную опухоль головы и шеи.

В альтернативном варианте осуществления инфекционное заболевание представляет собой малярию.

В предпочтительном варианте осуществления биологически активное средство представляет собой белок gp190/MSP1 Plasmodium или его фрагмент, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего.

В альтернативном варианте осуществления инфекционное заболевание представляет собой инфекцию HCMV, предпочтительно, инфекцию человеческого HCMV.

В предпочтительном варианте осуществления биологически активное средство представляет собой плотное тело, как указано в данном описании.

В альтернативном варианте осуществления инфекционное заболевание представляет собой туберкулез.

В предпочтительном варианте осуществления биологически активное средство представляет собой антиген из микобактерии, предпочтительно Mycobacterium ssp. Более предпочтительно, микобактерия выбрана из группы, включающей в себя M.tuberculosis, M.bovis, M.canettii, M.africanum и M.paratuberculosis. Еще более предпочтительно, антиген представляет собой антиген 85.

В четвертом аспекте задача настоящего изобретения решается благодаря применению сочетания, предлагаемого в первом аспекте настоящего изобретения, или каждого из компонентов такого сочетания, в производстве вакцины.

В пятом аспекте задача настоящего изобретения решается благодаря способу лечения пациента, страдающего заболеванием и нуждающегося в таком лечении, причем данный способ включает в себя введение сочетания, предлагаемого в первом аспекте настоящего изобретения, или фармацевтического сочетания, предлагаемого во втором аспекте настоящего изобретения.

В шестом аспекте задача настоящего изобретения решается благодаря способу промышленного получения фармацевтического сочетания, предпочтительно, фармацевтической композиции согласно второму аспекту настоящего изобретения, который включает в себя стадии

- предоставления в качестве первого компонента бактериальной клетки, которая содержит по меньшей мере одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или полипептид фаголизосомального истечения;

- предоставления в качестве второго компонента биологически активного средства; и

- получения фармацевтической композиции, содержащей первый и второй компоненты.

В седьмом аспекте задача настоящего изобретения решается благодаря способу промышленного получения фармацевтического сочетания, предпочтительно, фармацевтической композиции согласно второму аспекту настоящего изобретения, который включает в себя стадии

- предоставления в качестве первого компонента бактериальной клетки, которая содержит по меньшей мере одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или полипептид фаголизосомального истечения;

- предоставления в качестве второго компонента биологически активного средства; и

- получения отдельных композиций первого и второго компонентов.

В одном из вариантов осуществления композицию первого компонента и композицию второго компонента помещают в одну упаковку.

Альтернативно, композицию первого компонента и композицию второго компонента помещают в разные упаковки.

В более предпочтительном варианте осуществления упаковки могут содержать одну разовую дозу или несколько разовых доз.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что грамположительная или грамотрицательная бактериальная клетка, экспрессирующая пептид или полипептид фаголизосомального истечения, является особенно эффективным адъювантом, который можно использовать в сочетании с биологически активным средством. Более конкретно, авторы настоящего изобретения обнаружили, что Mycobacterium bovis, предпочтительно бацилла Кальметта-Герена (BCG) Mycobacterium bovis, и более предпочтительно микобактерия, такая как BCG, кодирующая или экспрессирующая пептид или полипептид фаголизосомального истечения, является подходящим средством для индуцирования или усиления иммунного ответа, особенно при использовании биологически активных средств, более предпочтительно других биологически активных иммуногенных средств. К наиболее предпочтительному типу биологически активных средств, вызывающих иммунный ответ, относятся клетки, экспрессирующие по меньшей мере один цитокин или паразитарный антиген, или опухолевый или паразитарный антиген, или вирусный антиген.

Без связи с какой-либо теорией, авторы настоящего изобретения считают, что пептид или полипептид фаголизосомального истечения позволяет антигенам, полученным из бактериальной клетки или из биологически активного средства, более эффективно индуцировать иммунный ответ, если такой пептид фаголизосомального истечения является доступным. Другими словами, истечение антигенов, образующихся при улавливании бактериальной клетки фаголизосомами, из фаголизосомов и презентирование их для иммунной системы увеличивает доступность специфических антигенов BCG и, следовательно, обеспечивает превосходный эффект адъюванта, используемого в соответствии с настоящим изобретением.

Данный вид доставки пептидов в путь презентирования MHC класса I может усиливать уже существующий BCG-специфичный иммунный ответ и адъювантную активность BCG.

Адъювантный эффект BCG, более конкретно, BCG или любого микроорганизма, предпочтительно любого микроорганизма Mycobacterium, который кодирует или экспрессирует пептид или полипептид фаголизосомального истечения, является другим неожиданным открытием авторов настоящего изобретения, которому можно найти применение путем использования такого микроорганизма, вызывающего адъювантный эффект, в сочетании или при совместном введении с другим или вторым биологически активным средством. В отличие от других адъювантов, которые индуцируют иммунный ответ TH2, описанный выше адъювант, т.е. микроорганизм, может вызывать иммунный ответ TH1. Такой иммунный ответ TH1 полезен тем, что он индуцирует клеточный иммунный ответ. Следовательно, в другом аспекте данное изобретение относится к применению микроорганизма, который кодирует и/или экспрессирует пептид фаголизосомального истечения, причем микроорганизм предпочтительно представляет собой BCG, более предпочтительно BCG, описанный в данном документе, и наиболее предпочтительно ureC-дефицитный BCG, в качестве адъюванта.

Еще более неожиданным для авторов настоящего изобретения оказалось то, что микроорганизм, предпочтительно BCG или его производные, которые кодируют и/или экспрессируют пептид фаголизосомального истечения, более предпочтительно BCG, описанный в разных вариантах осуществления данного документа, включающий в себя, без ограничения, rBCG:Hly, и наиболее предпочтительно ureC-дефицитный BCG, такой как BCG:rBCGΔureC:Hly, а также их производные, превосходят BCG, не содержащий пептид фаголизосомального истечения, поскольку они способны индуцировать четко выраженный ответ CD8, специфичный для соответствующего микроорганизма, такого как микобактерия, и, кроме того, четко выраженный ответ CD8, специфичный для антигена, представленного биологически активным средством, или в виде биологически активного средства, как раскрыто и/или определено в данном описании. Другими словами, микроорганизм, используемый или упоминаемый здесь как первый компонент, в соответствии с данным вариантом осуществления содержащий пептид фаголизосомального истечения и, более предпочтительно, также отрицательный по ureC, не ограничивается способностью вызывать микроорганизм-специфичный иммунный ответ CD8, в противоположность тому, что могли ожидать специалисты в данной области.

В предпочтительном варианте осуществления такой пептид или полипептид фаголизосомального истечения представляет собой полипептид фаголизосомального истечения L.monocytogenes, листериолизин (Hly). Листериолизин представляет собой порообразующий сульфгидрил-активированный цитолизин и отвечает за высвобождение микроорганизмов L.monocytogenes из фаголизосомальных вакуолей в цитозоль клетки-хозяина. Как описано в международной патентной заявке PCT/EP2004/004345, данная функция высвобождения может выполняться в отношении разных бактериальных клеток, таких как Bacillus subtilis, штаммы Salmonella ssp. с пониженной вирулентностью, а также микобактерии. Кроме того, международная патентная заявка WO 99/101496 раскрывает рекомбинантные штаммы Mycobacterium bovis, которые секретируют биологически активные слитые белки листериолизина. Таким образом, бактериальная клетка, образующая первый компонент композиции настоящего изобретения, обладает механизмом образования пор, обеспечивающим перфорацию эндосомальных мембран и, как следствие, превосходную иммунологическую защиту.

Специалистам в данной области известно, что существует несколько доменов фаголизосомального истечения, причем домен фаголизосомального истечения листерии, описанный, например, в US 5733151, является предпочтительным. Более предпочтительно, домен фаголизосомального истечения получают из организма L.monocytogenes, наиболее предпочтительно домен фаголизосомального истечения кодирует молекула нуклеиновой кислоты, выбранная из a) нуклеотидной последовательности, содержащей нуклеотиды 211-1722 последовательности SEQ ID NO: 1, b) нуклеотидной последовательности, которая кодирует такую же аминокислотную последовательность, что и последовательность пункта a), и c) нуклеотидной последовательности, гибридизующейся в жестких условиях с последовательностью пункта a) или b). Другие полипептиды фаголизосомального истечения, которые можно использовать с такой целью, включают в себя, в числе прочих, гемолизин (Perfringolysin) из Clostridium perfringens (O'Brien DK, et al. Infect Immun. 2004 Sep; 72(9): 5204-15); гемолизин из Vibrio, более конкретно, Vibrio vulnificus (Lee SE et al., Biochem Biophys Res Commun. 2004 Nov 5; 324(1): 86-91); гемолизин/цитолизин из стрептококков группы B (Liu GY et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Oct 5; 101(40): 14491-14496. Epub 2004 Sep 20); гемолизин BL из Bacillus, более конкретно, Bacillus cereus (Moravek M et al., FEMS Microbiol Lett. 2004 Sep 1; 238(1): 107-13); гемолизин из Bordetella, более конкретно, Bordetella pertusis (Bassinet L et al., Infect Immun. 2004 Sep; 72(9): 5530-3); гемолизин из Escherichia coli (Wyborn NR et al., Microbiology. 2004 May; 150(Pt 5): 1495-505) и гемолизин из Shigella (Sharma K et al., Microbios. 2001; 106(413): 31-8).

Помимо нуклеотидной последовательности, описанной в SEQ ID NO: 1, настоящее изобретение также охватывает нуклеотидные последовательности, гибридизующиеся с указанной последовательностью. В настоящем изобретении термин «гибридизация» используется в значении, определенном в Sambrook et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104). Согласно настоящему изобретению термин «гибридизация» используется, если положительный сигнал гибридизации наблюдается после промывания в течение одного часа 1×SSC и 0,1% SDS при 55°C, предпочтительно при 62°C, более предпочтительно при 68°C. Последовательность, гибридизующаяся с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 в указанных условиях промывания, представляет собой предпочтительную нуклеотидную последовательность настоящего изобретения, кодирующую домен фаголизосомального истечения.

Нуклеотидная последовательность, кодирующая домен фаголизосомального истечения, как описано выше, может быть получена непосредственно из организма Listeria или из любого рекомбинантного источника, например, из рекомбинантной клетки E.coli, содержащей соответствующую молекулу нуклеиновой кислоты Listeria или ее вариант, как описано выше.

Следует понимать, что такая бактериальная клетка, содержащая по меньшей мере одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид фаголизосомального истечения, более конкретно, бактериальная клетка, представляющая собой клетку микобактерии, содержащую Hly, является особенно предпочтительной для композиции настоящего изобретения. В другом предпочтительном варианте осуществления указанная бактериальная клетка является также дефицитной по уреазе, более конкретно, дефицитной по ureC. Такой организм также называют BCG:rBCGΔureC:Hly или BKG.

Микобактерия, более конкретно, бацилла Кальметта-Герена Mycobacterium bovis (BCG), широко используется как жизнеспособная вакцина для профилактики туберкулеза, хотя ее эффективность остается сомнительной. Тем не менее, известно, что BCG может предотвращать возникновение системного туберкулеза у детей или по меньшей мере облегчать его тяжелые формы.

Однако в настоящее время разработаны новые формы BCG. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что эти новые формы BCG являются особенно полезными адъювантами при введении вместе с биологически активным средством и, следовательно, могут использоваться в качестве первого компонента сочетания настоящего изобретения.

Бактериальная клетка, которая используется в качестве первого компонента сочетания настоящего изобретения, предпочтительно является дефицитной по уреазе. Данная особенность приводит к повышению профиля безопасности, поскольку из-за недостатка мочевины микобактериальная клетка не выживает в среде, в которой требуется такая ферментативная активность, например, в фаголизосоме.

Дефицита по уреазе можно достичь путем частичной или полной инактивации одной или нескольких молекул клеточных нуклеиновых кислот, которые кодируют субъединицы уреазы, в частности, ureA, кодирующей субъединицу уреазы A, ureB, кодирующей субъединицу уреазы B и/или ureC, кодирующей субъединицу уреазы C. Последовательности ureA, ureB и ureC из Mycobacteria, в частности, M.bovis и M.tuberculosis, а также кодируемые ими белки, описаны Reyrat et al. (1995) и Clemens et al. (1995), которые включены в данное описание в качестве ссылки.

Предпочтительно дефицитный по уреазе бактериальный штамм получают путем делеций и/или инсерций одного или нескольких нуклеотидов в нуклеотидных последовательностях, кодирующих субъединицы уреазы, и/или в последовательностях, контролирующих экспрессию. Делеции и/или инсерции можно осуществить путем гомологичной рекомбинации, инсерции транспозона или с помощью других подходящих методов.

В особенно предпочтительном варианте осуществления последовательность ureC инактивируют, например, путем конструирования вектора-«самоубийцы», содержащего ген ureC, разорванный геном маркера селекции, трансформирования клетки-мишени вектором и отбора клеток, содержащих маркер селекции и имеющих уреаза-отрицательный фенотип, как описано Reyrat et al. (выше).

В соответствии с настоящим изобретением в качестве бактериальной клетки, образующей первый компонент композиции настоящего изобретения, можно использовать разные виды микобактерий, а именно, M.bovis, M.tuberculosis, M.microti, M.smegmatis, M.canettii, M.marinum или M.fortuitum. Согласно настоящему изобретению также можно использовать другие микроорганизмы, предпочтительно внутриклеточные микроорганизмы, которые обладают одной или обоими из вышеупомянутых характеристических особенностей, а именно, кодируют или экспрессируют пептид или полипептид фаголизосомального истечения, и являются отрицательными по уреазе, более конкретно, ureC-отрицательными.

В другом варианте осуществления соответствующая бактериальная клетка является ослабленной. В более предпочтительном варианте осуществления бактериальная клетка является ослабленной, но еще живой и предпочтительно способной вызывать ответ TH1.

В более предпочтительном варианте осуществления соответствующая бактериальная клетка представляет собой живую бактериальную клетку.

В другом варианте осуществления бактериальная клетка дополнительно содержит по меньшей мере одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид или полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего. В данном описании термин «вызывающий иммунный ответ у млекопитающего» означает, что при воздействии такого пептида или полипептида на иммунную систему млекопитающего, или ее часть, может генерироваться иммунный ответ, опосредованный B-клетками. Однако альтернативно иммунный ответ может опосредоваться T-клетками, более предпочтительно, MHC класса 1-ограниченный CD 8 T-клеточный ответ.

Более предпочтительно такой пептид или полипептид выбран из группы, включающей в себя аутоантигены, опухолевые антигены, вирусные антигены, паразитарные антигены, бактериальные антигены и их иммуногенные фрагменты. Предпочтительно иммуногенный фрагмент представляет собой часть такого антигена, которая еще способна вызвать иммунный ответ. Особенно предпочтительным антигеном является белок gp190/MSP1 Plasmodium, подробно описанный в данном документе. Другим особенно предпочтительным вирусным антигеном является плотное тело HCMV, подробно описанное в данном документе. Следующим антигеном является антиген, способный вызвать иммунный ответ против туберкулеза, более конкретно, против Mycobacterium tuberculosis, M.bovis, M.canettii, M.africanum и M.paratuberculosis. Особенно предпочтительным антигеном является антиген 85. Такой антиген в предпочтительном варианте осуществления представляет собой второй компонент.

Специалистам в данной области следует понимать, что используемый в данном описании термин антиген также может включать в себя фрагменты или мутантные формы антигена. Фрагменты и мутантные формы можно использовать в качестве соответствующих антигенов, если мутантная форма или фрагмент обладают по меньшей мере одной характеристической особенностью полноразмерного антигена или антигена дикого типа. Предпочтительно такая характеристическая особенность представляет собой способность вызывать иммунный ответ, более предпочтительно вызывать иммунный ответ при использовании вместе или в сочетании с первым компонентом или адъювантом, как описано в данном документе. В еще более предпочтительном варианте осуществления такой иммунный ответ представляет собой специфический CD8-иммунный ответ. Вышесказанное применимо также к полипептидам и белкам, соответственно.

Кроме того, специалистам в данной области следует понимать, что термины «нуклеиновая кислота» и «нуклеиновая кислота, кодирующая полипептид или белок» также необязательно включают в себя фрагмент или мутантную форму полипептида или белка, соответственно, как определено в предпочтительных вариантах осуществления данного описания, с учетом вырожденности генетического кода или необходимости адаптации последовательности к использованию кодона соответствующим хозяином или продуцирующим организмом.

Выражение «полипептид, белок или антиген, полученный из организма» предпочтительно означает, что аминокислотная последовательность соответствующего полипептида, белка или антигена является последовательностью соответствующего организма, при этом последовательность и, следовательно, кодирующая ее нуклеиновая кислота могут находиться в виде фрагментов и мутантных форм.

Следует понимать, что пептид или полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, можно использовать в качестве второго компонента композиции. В объем настоящего изобретения входит пептид или полипептид, который является частью слитого полипептида. Предпочтительно такой слитый полипептид содержит пептид или полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, или его домен, сохраняющий данную способность, и, кроме того, слитый полипептид содержит домен фаголизосомального истечения, предпочтительно домен фаголизосомального истечения, описанный выше в связи с вариантами осуществления, относящимися к первому компоненту настоящего изобретения. Домен полипептида, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, в случае, если такой пептид является бактериальным антигеном, может быть получен из микроорганизма, предпочтительно относящегося к роду Mycobacterium, более предпочтительно Mycobacterium tuberculosis или Mycobacterium bovis. Длина данного домена составляет по меньшей мере 6, предпочтительно по меньшей мере 8 аминокислот. Иммуногенный домен предпочтительно является частью нативного полипептида Mycobacterium. Однако в объем настоящего изобретения также входят модифицированные иммуногенные домены, которые можно получить из нативного иммуногенного домена путем замены, делеции и/или добавления одной или нескольких аминокислот.В предпочтительном варианте осуществления домен представляет собой домен белка gp190/MSP1 Plasmodium.

В одном из вариантов осуществления слитый белок кодирует рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, а именно, молекула нуклеиновой кислоты с последовательностью SEQ ID NO: 1. Данная молекула нуклеиновой кислоты содержит последовательность, кодирующую сигнальный пептид (нуклеотиды 1-120), последовательность, кодирующую иммуногенный домен (нуклеотиды 121-153), последовательность, кодирующую линкерный пептид (нуклеотиды 154-210), последовательность, кодирующую фаголизосомальный домен (нуклеотиды 211-1722), последовательность, кодирующую другой линкерный пептид (нуклеотиды 1723-1800), и последовательность, кодирующую рандомизированный пептид (нуклеотиды 1801-1870). Соответствующая аминокислотная последовательность приведена в SEQ ID NO: 2.

В особенно предпочтительном варианте осуществления, более конкретно, если первый компонент представляет собой либо rBCG:Hly, либо rBCGAureC:Hly, второй компонент представляет собой биологически активное средство, более конкретно, генетически измененную клетку. Предпочтительно генетически измененная клетка представляет собой эукариотическую клетку. Более предпочтительно такая генетически измененная клетка экспрессирует по меньшей мере один цитокин. Под цитокином в данном описании подразумевается секретируемый белок, который влияет на поведение и характеристические особенности других клеток. Предпочтительными цитокинами являются интерлейкины, хемокины, лимфокины, монокины и факторы роста. Особенно предпочтительными цитокинами являются интерлейкины и интерфероны, причем предпочтительными интерлейкинами являются интерлейкин-2, интерлейкин-4, интерлейкин-12, предпочтительно интерлейкин-2, а интерферон предпочтительно представляет собой интерферон-альфа, интерферон-бета или интерферон-гамма, более предпочтительно интерферон-гамма.

В данном описании генетически измененная клетка представляет собой клетку, модифицированную с использованием генетической конструкции, которую получают путем вставки экзогенного генетического материала. Такая модификация с использованием генетической конструкции включает в себя введение генетического материала, пока не присутствующего в клетке, который на самом деле является чужеродной нуклеиновой кислотой, или активирует часть эндогенного генетического материала, причем такой эндогенный генетический материал не присутствует или не активен в отсутствие указанного экзогенного генетического материала, а экзогенный генетический материал не обязательно является генетическим материалом, но может представлять собой любое вещество, обладающее соответствующей активностью. Способы осуществления такой модификации хорошо известны в данной области. Например, для введения экзогенной ДНК в клетку можно использовать метод осаждения фосфатом кальция, вирусный вектор, электропорацию, липофекцию, системы вирусных векторов, такие как аденоассоциированные вирусные системы, микроинъекцию или биолистические методы. Результат такой генетической манипуляции заключается в том, что генетически измененная клетка приобретает способность экспрессировать определенный генный продукт, который она не экспрессировала ранее.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что совместная экспрессия интерлейкинов, более конкретно, интерлейкина-2 и интерферона-гамма, в сочетании с бактериальной клеткой, описанной как первый компонент сочетания настоящего изобретения, позволяет эффективно усилить иммунный ответ организма, более конкретно, ответ TH1. Конкретная клетка может быть выбрана из ряда таких клеток, как непрофессиональные антиген-презентирующие клетки, профессиональные антиген-презентирующие клетки, опухолевые клетки и дендритные клетки. Среди указанных типов клеток особенно предпочтительны опухолевые клетки. Введение таких опухолевых клеток раковым пациентам повышает эффективность противоопухолевой вакцинации. Клетки для такой вакцинации предпочтительно получают из опухоли, идентичной или подобной опухоли, подлежащей лечению сочетанием настоящего изобретения. Таким образом, благоприятные эффекты, оказываемые генетически измененными клетками, которые описаны, в числе прочих, в международной патентной заявке WO 94/18995, дополнительно увеличиваются при применении бактериальной клетки в качестве первого компонента сочетания настоящего изобретения.

В объем настоящего изобретения входит профессиональная антиген-презентирующая клетка, которая представляет собой дендритную клетку, либо используемую в качестве биологически активного средства, как описано в данном документе, либо представляющую собой дополнительный компонент биологически активного средства, причем в таком вариан