Питательная добавка для среды спиртового брожения

Питательная добавка для среды спиртового брожения

Иллюстрации

Показать все

Реферат

Изобретение относится к питательной добавке, создающей благоприятные условия при промышленном производстве этанола путем спиртового брожения, более конкретно, способом одновременного осахаривания и сбраживания в спирт ферментируемого углеводного сырья, такого как крахмалистое сырье, в частности зерно, более конкретно, пшеница и отходы производства (дробина, отруби), в случае необходимости, после осахаривания. Изобретение также относится к дробине, полученной при осуществлении этого способа, и к способу изготовления дрожжей в аэробных условиях.

Известен процесс производства этанола из крахмалистого сырья ферментативным способом, включающим этап перехода крахмала в жидкую фазу с помощью альфа-амилазы, который предназначен для солюбилизации и гидролиза крахмала и превращения его в декстрины. В классическом способе для превращения декстринов в глюкозу за этим этапом следует этап осахаривания с помощью глюкоамилазы, которая также называется амилоглюкозидазой. Таким образом, содержание глюкозы в конце осахаривания составляет почти 100% эквивалента глюкозы, соответствующего количеству крахмала в вышеупомянутом крахмалистом материале. Иными словами, весь глюкозный потенциал используемого крахмалистого материала преобразуется в глюкозу.

Затем глюкоза сбраживается в течение этапа ферментации, во время которого она превращается в этиловый спирт под воздействием дрожжей в анаэробных условиях.

Направление исследования по усовершенствованию этого ферментативного способа состояло в попытке объединения этапов ферментации и осахаривания. В связи с этим ученые попытались осуществить ферментацию и осахаривание одновременно во время единого этапа, называемого этап «осахаривания-ферментации», по-английски “simultaneous saccharification and fermentation″ (ООФ). Содержание глюкозы в среде на начальной стадии этого единого этапа, т.е. после завершения перехода в жидкую фазу, обычно составляет менее 3% эквивалента глюкозы, соответствующего количеству крахмала в вышеупомянутом крахмалистом материале.

Также были проведены опыты с целью ограничения продолжительности этапа осахаривания таким образом, чтобы содержание глюкозы после завершения этого этапа было ниже 100% эквивалента глюкозы, соответствующего количеству крахмала в вышеупомянутом крахмалистом материале. В таком случае этап осахаривания определялся как «предварительное осахаривание» или «частичное осахаривание».

Как будет более подробно показано в описании ниже, способы получения этанола, включающие этап неполного осахаривания, и даже не предусматривающие этапа осахаривания, именуемые ниже «способы с неполным осахариванием», предполагают существование определенных ограничений. Следовательно, технические решения, принятые для традиционных способов производства с полным осахариванием перед ферментацией, a priori не могут быть использованы для этих способов.

В условиях способов с неполным осахариванием среда, в которой происходит ферментация и, по меньшей мере, часть процесса осахаривания, называется «средой осахаривания-ферментации».

Существует постоянная потребность в повышении выхода этанола в способах производства этанола, более конкретно, при неполном осахаривании.

Задача настоящего изобретения состоит в удовлетворении этой потребности.

Согласно изобретению эта задача решается с помощью питательной добавки для среды осахаривания-ферментации в условиях способа изготовления этанола путем ферментации крахмалистого сырья, которая включает и предпочтительно состоит из активного природного вещества, полученного в результате ферментации плесневыми грибами. Она может быть в жидкой или твердой форме.

Как будет более подробно показано в описании ниже, присутствие такой питательной добавки в среде осахаривания-ферментации очень благоприятно сказывается на росте и эффективности дрожжей. В результате отмечается значительное увеличение выхода продукции при осуществлении способа изготовления этанола из крахмалистого сырья.

Предпочтительно способ по изобретению включает один и более предпочтительно несколько следующих факультативных признаков:

- Питательная добавка является твердой или жидкой смесью вышеупомянутого активного природного вещества и, по меньшей мере, одного полезного фермента. Понятие полезного фермента включает, более конкретно, один или несколько ферментов, обладающих амилазной активностью, а именно, глюкоамилазной, протеолитической или ксиланазной активностью или сочетанием таковых.

- Активное природное вещество, присутствующее в питательной добавке по изобретению, находится в неочищенном виде, т.е. содержит субстрат, используемый во время ферментации вышеупомянутыми плесневыми грибами, или в виде вытяжки (экстракта), т.е. отделено от вышеназванного субстрата. При необходимости оно находится в смеси с дополнительными ферментами. Предпочтительно, субстратом являются пшеничные отруби.

- Активное природное вещество выбрано из группы веществ, в которую входят эргостерол, N-ацетилглюкозамин, витамины, в частности витамин В, нуклеиновые кислоты, аминокислоты и, предпочтительно, их смеси. В числе аминокислот желательно присутствие одной или нескольких, предпочтительно, совокупности следующих аминокислот: аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, валил, лейцин, глутаминовая кислота. В числе витаминов отмечается в числе прочих присутствие различных витаминов группы В, например, B1, B2, В3, В6 и инозита, витамина Е.

- Питательная добавка при ее введении в среду осахаривания-ферментации проявляет следующую ферментативную активность, которая в частности, обусловлена соответствующим подбором вышеупомянутых плесневых грибов:

- глюкоамилазную: по меньшей мере, 500 единиц глюкоамилазной активности, предпочтительно, 750 единиц глюкоамилазной активности, более предпочтительно, 1500 единиц глюкоамилазной активности на грамм сухих веществ и/или предпочтительно,

- протеолитическую: по меньшей мере, 100 единиц протеолитической активности, предпочтительно, по меньшей мере, 400 единиц протеолитической активности на грамм сухих веществ и/или предпочтительно,

- ксиланазную: по меньшей мере, 100 единиц ксиланазной активности, предпочтительно, по меньшей мере, 400 единиц ксиланазной активности на грамм сухих веществ.

- Питательная добавка получена в результате ферментации, предпочтительно, в твердой среде, субстрата, предпочтительно, пшеничных отрубей с плесневыми грибами, более конкретно, выбранными из числа штаммов Aspergillus niger, предпочтительно из числа штаммов АТСС 201202, АТСС 76060, АТСС 76061, MUCL 28815, MUCL 28816, NRRL 3112 или из числа штаммов Aspergillus опте, предпочтительно из числа штаммов АТСС 22788 и АТСС42149.

- Питательная добавка получена с помощью способа по изобретению, включающего следующие этапы:

i. Обеспечение пшеничных отрубей,

ii. Увлажнение их, подкисление до уровня рН от 4 до 5, предпочтительно, азотной кислотой (HNO₃) и температурная обработка отрубей таким образом, чтобы пастеризовать или стерилизовать их, при этом температурная обработка предпочтительно должна проводиться после увлажнения,

iii. Засев полученных пшеничных отрубей штаммом Aspergillus niger, выбранным из числа штаммов АТСС 201202, АТСС 76060, АТСС 76061, MUCL 28815, MUCL 28816, NRRL 3112 или штаммом Aspergillus orizae, выбранным из числа штаммов АТСС 22788 и АТСС42149,

iv. Ферментация пшеничных отрубей в твердом состоянии в ферментере с периодическим перемешиванием при температуре от 28°С до 38°С при влажности от 45% до 65%, предпочтительно, от 50% до 60% по массе в условиях аэрации, достаточной для предотвращения постоянного накопления углекислого газа в толще пшеничных отрубей, до того момента, когда продукт ферментации будет иметь следующие минимальные значения ферментативной активности:

- глюкоамилазная: по меньшей мере, 500 единиц глюкоамилазной активности, предпочтительно, 750 единиц глюкоамилазной активности, более предпочтительно, 1500 единиц глюкоамилазной активности на грамм сухих веществ и/или предпочтительно,

- протеолитическая: по меньшей мере, 100 единиц протеолитической активности, предпочтительно, 400 единиц протеолитической активности на грамм сухих веществ,

- ксиланазная: по меньшей мере, 100 единиц ксиланазной активности, предпочтительно, 300 единиц ксиланазной активности на грамм сухих веществ.

- Питательная добавка является ферментным комплексом, полученным способом, который описан в заявке US 2002 037342.

Изобретение также относится к способу изготовления этанола из углеводного материала, более конкретно, из крахмалистого материала, включающему после этапа перехода в жидкую фазу этап осахаривания и затем этап ферментации, или после этапа перехода в жидкую фазу и при необходимости этапа предварительного осахаривания этап осахаривания-ферментации в среде осахаривания-ферментации, содержание глюкозы в которой в начале этапа осахаривания-ферментации составляет не более 95% эквивалента глюкозы, соответствующего количеству углеводного материала, более конкретно, крахмала в вышеупомянутом крахмалистом материале. Способ по изобретению характеризуется тем, что в ферментационную среду или в среду осахаривания-ферментации вводят питательную добавку по изобретению. Это введение может проводиться непосредственно в ферментационную среду или в среду осахаривания-ферментации или во время предыдущего этапа.

Удивительным образом, присутствие в ферментационной среде или в среде осахаривания-ферментации питательной добавки по изобретению и, более конкретно, пшеничных отрубей, ферментированных плесневыми грибами, очень благоприятно для повышения эффективности дрожжей. При этом последние превращают в этанол большее количество глюкозы с более предпочтительной кинетикой.

Предпочтительно способ по изобретению включает один и более предпочтительно несколько следующих факультативных признаков:

- Содержание глюкозы в начале этапа осахаривания-ферментации составляет не более 3%, предпочтительно, 2%, и наиболее предпочтительно не более 1% эквивалента глюкозы, соответствующего количеству крахмала в вышеупомянутом крахмалистом материале. Иными словами, способ не включает ни этапа осахаривания, ни этапа предварительного осахаривания.

- Если питательная добавка вводится в неочищенной форме, то количество этой питательной добавки выше или равно 4 кг сухих веществ, предпочтительно 14 кг сухих веществ и/или меньше или равно 60 кг сухих веществ, предпочтительно 34 кг сухих веществ, более предпочтительно меньше 19 кг сухих веществ на тонну крахмала, наиболее предпочтительно около 17 кг сухих веществ на тонну крахмала.

- Питательная добавка готовится путем ферментации субстрата, идентичного углеводному материалу, используемому в способе изготовления этанола.

- Этап осахаривания-ферментации полностью проводится без подачи воздуха или кислорода (отсутствует аэробная фаза в собственном смысле).

- Этап осахаривания-ферментации включает начальную аэробную фазу.

- В качестве агента этаноловой ферментации используются дрожжи, в частности, дрожжи рода Saccharomyces, более конкретно Saccharomyces cerevisiae. Более предпочтительно, чтобы дрожжи работали при концентрации этанола выше 95 г/л.

- В условиях этого способа вышеназванная питательная добавка представляет собой основной источник питания для дрожжей и/или основной источник эргостерола и/или основной источник азота и/или аминокислот и/или фосфора и/или серы и/или витаминов. Предпочтительно, чтобы она представляла собой единственный источник эргостерола и/или азота и/или аминокислот и/или фосфора и/или серы и/или витаминов.

Способ по изобретению позволяет также получать дробину, обладающую прекрасной питательной ценностью. Таким образом, изобретение также относится к дробине, полученной при осуществлении способа изготовления этанола по изобретению и содержащие более 5 г, предпочтительно более 20 г и/или менее 100 г, предпочтительно менее 35 г, наиболее предпочтительно около 30 г эргостерола на тонну сухих веществ дробины.

Предпочтительно вышеупомянутая дробина содержит также более 40%, предпочтительно более 50% сырого протеина, в пересчете на сухое вещество. Как будет показано в описании ниже, такое высокое содержание протеина стало возможным за счет использования части гемицеллюлозы и волокон во время предварительной ферментации или осахаривания-ферментации.

И, наконец, изобретение, в общем, относится к использованию питательной добавки по изобретению для содействия спиртовой ферментации при изготовлении этанола или предварительной ферментации при производстве дрожжей.

Другие характеристики и преимущества настоящего изобретения будут освещены в описании ниже и при рассмотрении приложенного чертежа, на котором фигура 1 представляет схему части способа изготовления этанола по изобретению.

Способы изготовления этанола путем ферментации углеводных материалов, в частности, крахмалистых материалов, хорошо известны специалистам, они могут быть адаптированы и приведены в соответствие со способом по изобретению. Так, специалист при необходимости в состоянии уточнить некоторые пункты описания ниже.

Описанный ниже способ относится к изготовлению этанола из пшеницы, но может быть применен к любому типу крахмалистого материала, в частности, к любому экстракту зерновых. Следовательно, описанные ниже способы осуществления являются только примерами, их можно модифицировать, в частности, путем замены технических эквивалентов, не выходя за рамки изобретения.

Способ изготовления этанола из пшеницы по изобретению может, например, включать следующие этапы:

a) Этап кондиционирования пшеницы для приготовления продукта помола пшеничного крахмала,

b) Этап перехода крахмала в жидкую фазу (разжижение), в частности, в присутствии альфа-амилазы для гидролиза крахмала и превращение его в декстрины,

c) Факультативный этап предварительного осахаривания, в частности, с помощью комплекса ферментов для гидролиза декстринов и превращения их в ферментируемые сахара (глюкозу, мальтозу, мальтотриозу) и некрахмалистые компоненты и

d) Этап осахаривания-ферментации в среде осахаривания-ферментации, содержащей декстрины и/или вышеупомянутые ферментируемые сахара и дрожжи для производства этанола.

Эти различные этапы представлены на фигуре 1.

Этап а) заключается в приготовлении продукта помола пшеничного крахмала, например, муки, путем кондиционирования вышеупомянутой пшеницы.

Затем пшеничную муку смешивают с водой в смесителе, факультативно с бардой, с кислотой и гидролитическим ферментом таким образом, чтобы образовалось «густое сусло».

Обычно густое сусло содержит от 25 до 35% сухих веществ по массе, предпочтительно от 30 до 35%. Содержание сухих веществ было установлено на этом уровне с целью ограничения расходов на электроэнергию при сохранении удовлетворительной текучести. Из экономических соображений содержание сухих веществ было повышено до максимально возможного уровня для ограничения затрат на испарение барды на последующих этапах способа производства. Количество муки, подаваемое в смеситель, регулируется либо с помощью дозирующего устройства, либо с помощью взвешивающего конвейера.

В зависимости от используемого гидролитического фермента необходимо скорректировать pH путем добавления раствора кислоты, например, серной кислоты. В зависимости от используемых ферментов, в классическом варианте бактериальных альфа-амилаз, более конкретно, термостойких, при необходимости можно применять соль кальция. Расход кислоты регулируется с помощью датчика pH, установленного в трубопроводе для смеси воды/барды перед сгустителем. pH в классическом варианте может варьироваться от 5 до 6,5 в зависимости от используемых ферментов.

После этого переход в жидкую фазу (этап b)) проводится при температуре от 80°С до 95°С.Густое сусло может быть доведено до этой температуры путем непосредственного введения пара в резервуар, где происходит переход в жидкую фазу, по трубам или из пароструйного котла. Во втором случае густое сусло за несколько секунд доводится до температуры от 100°С до 150°С за счет подачи пара в трубопровод перед быстрым охлаждением до температуры от 80 °С до 95 °С.Содержимое в резервуарах, где происходит переход в жидкую фазу, можно перемешивать.

Предпочтительно, материал на этапе перехода в жидкую фазу имеет следующие параметры:

- Температура: от 80°С до 90°С

- pH: 5,5-6,5

- Содержание сухих веществ: 30%-35%

- Время пребывания: от 30 мин. до 2 час.

Этап b) приводит к гидролизу крахмала и превращению его в декстрины. При предварительном осахаривании (этап с)) жидкое сусло охлаждается в теплообменниках пластинчатого или трубчатого типа до температуры от 50°С до 60°С.

В некоторых случаях допускается разведение сусла разбавителем, таким как вода или оборотная барда или флегма, образующаяся в перегонной установке.

На факультативном этапе с) в жидкое сусло предпочтительно вводится ферментный комплекс, обладающий требуемой ферментной активностью.

Количество подаваемых ферментов предпочтительно зависит от количества подаваемого сусла, полученной концентрации глюкозы и остаточного содержания крахмала. Цель такой регулировки соотношений заключается в приготовлении раствора, в котором в конце ферментации будет отсутствовать крахмал.

Предпочтительно, материал на этапе предварительного осахаривания с) имеет следующие параметры:

- Температура: от 50°С до 60°С

- pH: 4-5

- Время пребывания: до получения желаемой концентрации глюкозы, обычно менее 24 часов.

Содержимое резервуаров, в которых проводится предварительное осахаривание, подвергают механическому перемешиванию, которое обеспечивает достаточную гомогенизацию сусла во время осахаривания, а также способствует контакту между ферментами и декстринами, подвергаемыми гидролизу.

Использование ферментного комплекса, полученного в результате ферментации пшеничных отрубей плесневыми грибами, позволяет предпочтительно уменьшить вязкость осахаренного сусла и увеличить содержание азота в вышеупомянутом сусле.

По изобретению осахаривание не продолжается до полного гидролиза декстринов и превращения в глюкозу, а прерывается на стадии неполного гидролиза. По изобретению уровень глюкозы в конце этапа предварительного осахаривания ниже 95%, более предпочтительно ниже 50%, наиболее предпочтительно ниже 5%. В связи с этим гидролиз продолжается на этапе осахаривания-ферментации.

Если способ по изобретению не включает этап частичного осахаривания или «предварительного осахаривания», содержание глюкозы в начале этапа осахаривания-ферментации d) составляет не более не более 3%, предпочтительно, 2%, и наиболее предпочтительно не более 1% эквивалента глюкозы, соответствующего количеству крахмала в вышеупомянутом крахмалистом материале.

На этапе d) сусло соединяют с дрожжами в среде осахаривания-ферментации. Его также соединяют с питательной добавкой по изобретению. Порядок введения дрожжей и добавки не имеет значения.

Смесь перемешивают в течение всего этапа d).

Можно использовать все дрожжи, используемые при производстве этанола, в частности дрожжи рода Saccharomyces. Обычно дрожжи вводят в среду осахаривания-ферментации в аэробных условиях. В течение этого этапа происходит некоторое число делений дрожжевых клеток. В этом случае дрожжи не преобразуют глюкозу в этанол, а, наоборот, используют глюкозу для своего роста. Известно, что для улучшения этого роста клеток следует ввести в среду осахаривания-ферментации питательные добавки. Вместе с этим, для ограничения роста клеток, потребляющих глюкозу и, тем самым, снижающих выход этанола, предпочтительно засевать среду осахаривания-ферментации таким количеством дрожжей, чтобы наработанный этими дрожжами этанол быстро достигал такой концентрации в культуральной среде, которая препятствует росту дрожжевых клеток.

По первому варианту этап d) начинается в аэробных условиях в течение времени, необходимого для достаточного размножения дрожжей.

Затем среда осахаривания-ферментации переводится в анаэробные условия. В это время дрожжи преобразуют глюкозу в этанол.

По второму варианту этап d) полностью проводится в анаэробных условиях. Присутствие питательной добавки по изобретению позволяет обойтись без первоначальной аэробной фазы.

Предпочтительно, материал на этапе осахаривания-ферментации d) имеет следующие параметры:

- Температура: от 30°С до 35°С

- pH: корректируется добавлением кислоты (например, серной кислоты) в начале этапа d) до уровня примерно от 3,5 до 5, предпочтительно примерно от 3,8 до 5, более предпочтительно примерно от 4 до 5 и наиболее предпочтительно примерно от 4 до 4,5.

- После корректировки pH в начале этапа d) благодаря буферному действию питательной добавки на последующих фазах этапа d) корректировка pH не предусматривается.

- Инокулят дрожжей: примерно от 10⁶ до 5·10⁸ КОЕ дрожжей на мл среды осахаривания-ферментации, предпочтительно около 10⁷ КОЕ дрожжей на мл среды осахаривания-ферментации.

- Содержание сухих веществ: от 20% до 35%, а именно от 20% до 30%.

- Время пребывания: от 20 до 72 часов, а именно от 20 до 60 часов. Время пребывания увеличивается с повышением содержания сухих веществ.

Среда осахаривания-ферментации по изобретению содержит питательную добавку по изобретению. Эта добавка может быть введена непосредственно в среду осахаривания-ферментации или во время предыдущего этапа. Удивительным образом, добавление в среду осахаривания-ферментации такой питательной добавки, более конкретно, пшеничных отрубей, ферментированных плесневыми грибами, очень благоприятно для повышения эффективности дрожжей. При этом последние превращают в этанол большее количество глюкозы с более предпочтительной кинетикой. Кроме того, питательная добавка по изобретению позволяет сократить продолжительность аэробной фазы в начале этапа осахаривания-ферментации или даже устранить ее. Предпочтительно, это приводит к повышению производительности процесса. Более предпочтительно, питательная добавка по изобретению позволяет снизить гибель клеток по сравнению с такой же культурой, культивируемой в отсутствие вышеназванной питательной добавки. И, наконец, ее присутствие оказывает буферное действие, что позволяет исключить необходимость корректировки рН.

По изобретению предпочтительно среда осахаривания-ферментации первоначально содержит на 1000 кг крахмала, введенного первоначально в среду, от 2,5 кг до 35 кг питательной добавки, более конкретно, ферментированных пшеничных отрубей, в частности от 8 до 10 кг питательной добавки, более конкретно, ферментированных пшеничных отрубей на 1000 кг крахмала.

Таким образом, присутствие в среде осахаривания-ферментации ферментированных пшеничных отрубей позволяет значительно сократить время осахаривания-ферментации.

По-видимому, эта питательная добавка вносит в оптимальном соотношении и в оптимальной форме питательные элементы, которые прекрасно подходят для дрожжей, в частности, для анаэробных культур.

Без привязки к теории изобретатели объясняют эти результаты следующим образом. Они обнаружили присутствие в питательной добавке, используемой по изобретению, аминокислоты, необходимые для дрожжей. Эти аминокислоты, видимо, в значительной степени способствуют азотному питанию дрожжей, в частности, гораздо более эффективно, чем простые соли аммония, которые использовались до настоящего времени, помимо прочего, снижая синтез побочных продуктов, образуемых в процессе ферментации, таких как глицерин, и действительно повышая выход этанола.

Повышенную эффективность дрожжей можно также объяснить присутствием витаминов в питательной добавке по изобретению.

И, наконец, изобретатели обнаружили, что питательная добавка по изобретению содержит эргостерол и N-ацетилглюкозамин, которые являются важными компонентами дрожжей. Их присутствие в среде осахаривания-ферментации способствует росту и успешному функционированию дрожжей в условиях полного анаэробиоза. Действительно в этих условиях его синтез дрожжами невозможен. Таким образом, предпочтительно присутствие эргостерола позволяет сократить, или даже исключить аэробную фазу в начале осахаривания-ферментации.

Однако, испытания, представленные в таблице 1 ниже, показали, что добавление выявленных питательных элементов не приводит к образованию столь же продуктивной среды осахаривания-ферментации, что и добавление питательной добавки по изобретению. Таким образом, в основе полученных исключительно высоких показателей лежит сочетание совокупности компонентов этой питательной добавки в пропорциях, образовавшихся в результате ферментации плесневыми грибами, и предпочтительно их подачи в форме пшеничных отрубей.

Питательная добавка не может проявлять особую или оптимальную ферментативную активность. В связи с этим необходимо добавление ферментов.

Тем не менее, предпочтительно, чтобы питательная добавка по изобретению проявляла также ферментативную активность, полезную в рамках способа изготовления этанола. В частности, предпочтительно, чтобы питательная добавка проявляла глюкоамилазную активность выше 500 единиц глюкоамилазной активности на грамм сухих веществ. Более предпочтительно, чтобы питательная добавка проявляла протеолитическую активность выше 100 единиц протеолитической активности на грамм сухих веществ и/или ксиланазную активность, по меньшей мере, 100 единиц ксиланазной активности на грамм сухих веществ.

Так, несмотря на то, что предусматривается использование других ферментов, таких как очищенные ферменты или комплексы очищенных ферментов, предпочтительно по изобретению использовать ферментированную питательную добавку в условиях, позволяющих ей проявить вышеупомянутую ферментативную активность. В этом случае, эта питательная добавка как ферментный комплекс должна вводиться предпочтительно на этапе d), и/или при необходимости на этапе с).

Предпочтительно, питательная добавка представляет собой ферментированные пшеничные отруби, которые были приготовлены или могут быть получены с помощью следующего способа по изобретению:

i) обеспечение пшеничных отрубей,

ii) увлажнение их и температурная обработка отрубей таким образом, чтобы пастеризовать или стерилизовать их, при этом температурная обработка предпочтительно должна проводиться после увлажнения,

iii) засев полученных пшеничных отрубей штаммом Aspergillus niger, выбранным из числа штаммов АТСС 201202, АТСС 76060, АТСС 76061, MUCL 28815, MUCL 28816, NRRL 3112, предпочтительно из числа штаммов АТСС 76061 и NRRL 3112, более предпочтительно штаммом АТСС 76061, или из числа штаммов Aspergillus orizae АТСС 22788 и АТСС 42149.

iv) ферментация пшеничных отрубей в твердом состоянии, предпочтительно в форме слоя толщиной более 10 см в ферментере с периодическим перемешиванием при температуре от 28°С до 38°С при влажности от 45% до 65%, предпочтительно, от 50% до 60% по массе в условиях аэрации, достаточной для предотвращения постоянного накопления углекислого газа в толще пшеничных отрубей, до того момента, когда продукт ферментации будет иметь следующие минимальные значения ферментативной активности:

- глюкоамилазная: по меньшей мере, 500 единиц глюкоамилазной активности, предпочтительно, 750 единиц глюкоамилазной активности, более предпочтительно, 1500 единиц глюкоамилазной активности на грамм сухих веществ, и предпочтительно,

- протеолитическая: по меньшей мере, 100 единиц протеолитической активности, предпочтительно, 400 единиц протеолитической активности на грамм сухих веществ, и более предпочтительно

- ксиланазная: по меньшей мере, 100 единиц ксиланазной активности, предпочтительно, 300 единиц ксиланазной активности на грамм сухих веществ.

На этапе i) пшеничные отруби предпочтительно выбирают таким образом, чтобы доля частиц размером менее 1 мм составляла, по меньшей мере, 40% по массе.

На этапе ii) пшеничные отруби необходимо увлажнить и подвергнуть температурной обработке с целью их пастеризации или стерилизации. Предпочтительно, чтобы эта температурная обработка не предшествовала увлажнению, поскольку в том случае, когда проводили температурную обработку отрубей перед их увлажнением, были отмечены недостаточно удовлетворительные результаты ферментации.

Температурная обработка может заключаться в нагревании, например, в автоклаве. Обработка в автоклаве в течение 20 мин. при температуре от 120 до 121°С давала весьма удовлетворительные результаты. Подходят также менее жесткие условия пастеризации в сушильном шкафу при 105°С в течение 15 мин. Можно также проводить температурную обработку отрубей, подавая в отруби пар, это позволяет одновременно увлажнить отруби.

Предпочтительно проводят корректировку рН, предпочтительно азотной кислотой во время увлажнения в диапазоне от 4 до 5,5 для усиления пастеризующего эффекта температурной обработки и запуска желаемой ферментации. Особенно предпочтительно использование азотной кислоты, поскольку она также используется в качестве источника азота для плесневых грибов.

Помимо стерилизации температурная обработка также способствует желатинизации крахмала, содержащегося в пшеничных отрубях и, следовательно, доступности этого субстрата для грибов Aspergillus niger и Aspergillus orizae, что повышает эффективность ферментации.

Важна процедура увлажнения отрубей, так как содержание воды влияет на результаты ферментации. Увлажнение проводят таким образом, чтобы содержание воды в отрубях в начале этапа ферментации iv) находилось в пределах 50-60%, предпочтительно 50-55% от общей массы отрубей и воды.

На этапе iii) засев пшеничных отрубей можно проводить с помощью любого подходящего посевного материала. Специалист знает различные способы приготовления подходящего посевного материала на базе отобранного штамма. Предпочтительно норма засева составляет, по меньшей мере, 10⁷ спор/грамм исходных сухих веществ.

На этапе iv) ферментацию можно проводить в любом подходящем ферментере. Примеры ферментеров, которые можно использовать, описаны в статье А.Дюрана и коллег (A.Durand et Coll.), опубликованной в Agro-Food-Industry Hi-Tech (май-июнь 1997, стр.39-42).

Ферментацию следует проводить до того момента, когда глюкоамилазная активность составит по меньшей мере 500 единиц глюкоамилазной активности, предпочтительно, по меньшей мере 750 единиц глюкоамилазной активности, более предпочтительно, по меньшей мере 1500 единиц глюкоамилазной активности на грамм сухих веществ отрубей, то есть обычно в течение периода от 1 до 3 дней, предпочтительно от 30 до 60 часов. Ферментация, продолжительностью менее 1 дня, слишком неполная. По прошествии 3 дней ферментация заканчивается или почти заканчивается, и таким образом, ее продолжение становится экономически нецелесообразным.

Температура среды поддерживается в пределах от 28°С до 38°С, предпочтительно от 32°С до 36°С, что соответствует известной оптимальной области активности используемых штаммов. Предпочтительно, для этого температуру воздуха в течение первых часов ферментации устанавливают в диапазоне от 34°С до 38°С для облегчения прорастания спор, затем на остальную часть этапа ферментации снижают до уровня 28°С-32°С для того, чтобы способствовать корректировке температуры среды.

Содержание влаги в пшеничных отрубях обычно составляет от 50% до 60%. Однако влажность может отклоняться в пределах ±5% от диапазона 50-60% на относительно короткое время между двумя следующими друг за другом корректировками влажности или в конце ферментации. В любом случае достаточно, чтобы уровень влажности не опускался ниже 45%. При культивировании уровень влажности культуральной среды имеет тенденцию к снижению за счет испарения под действием тепла, которое выделяется при росте грибов, поскольку вышеупомянутая среда является плохим проводником тепла. Поэтому во время ферментации необходимо поддерживать определенное содержание влаги, например, периодически добавляя воду в среду, чтобы компенсировать потери воды средой. Качество используемой воды также играет весьма заметную роль. Можно использовать водопроводную воду хорошего качества или дистиллированную воду.

РН среды ферментации обычно не корректируется. Как было объяснено выше, предпочтительно его уровень корректируется первоначально в пределах от 4 до 5.

Если сначала уровень pH составляет примерно 6,0-6,4, при культивировании уровень pH снижается до 3,8-4,2, а затем к концу снова повышается. Это повторное повышение, как правило, соотносится с фазой споруляции гриба. Мониторинг динамики pH является средством определения состояния культуры.

Ферментер должен аэрироваться, предпочтительно постоянно для того, чтобы обеспечить подачу кислорода, необходимого для ферментации, и не допустить избыточного накопления двуокиси углерода, образующейся при ферментации. Кроме того, аэрация участвует в регуляции температуры и влажности культуральной среды. Воздух предпочтительно должен быть насыщен влагой, чтобы ограничить тенденцию к подсушиванию среды. Трудно дать количественные указания по потоку аэрации, поскольку здесь участвуют множество переменных, в частности, размер и геометрия ферментера, количество загруженных отрубей и тому подобное. Однако специалист с помощью простых обычных опытов сможет определить надлежащий поток аэрации в каждом конкретном случае; обычно достаточен поток воздуха из расчета 1-2 м³/час на кг сухих веществ, избыточное давление предпочтительно должно составлять от 0,5 до 1 бар.

Партию загруженных в ферменте отрубей в течение ферментации необходимо периодически перемешивать с помощью перемешивающих стержней, ножей или лопаток или с помощью шнеков для предотвращения образования непроницаемой массы и для обеспечения максимально равномерной аэрации всей массы отрубей. Используемые штаммы удивительным образом устойчивы к перемешиванию. Тем не менее, следует избегать чрезмерно интенсивного перемешивания.

Ферментированные пшеничные отруби, используемые в способе по изобретению, при желании могут быть высушены или заморожены для сохранности или охлаждены и использованы без дополнительной обработки.

Высушивание предпочтительно проводится при умеренной температуре, чтобы не нарушить ферментативную активность. Подходящим способом является нагрев в сушильном шкафу при 40°С. В промышленном масштабе предпочтительно вентилировать сухим воздухом при температуре от 35°С до 40°С в зависимости от используемого плесневого гриба. В свою очередь, замораживанию при низкой температуре, например, при -20°С можно подвергать влажный продукт.

US 2002037342 раскрывает ферментный комплекс, обладающий глюкоамилазной, протеолитической и ксиланазной активностью, полученный при ферментации пшеничных отрубей со штаммами Aspergillus. Этот комплекс может использоваться в качестве питательной добавки по изобретению.

Как правило, в рамках способа, включающего этап осахаривания, по меньшей мере, в той его части, которая проводится одновременно с ферментацией, невозможно предусмотреть действие фермента или многоферментной композиции, использование которой известно в рамках способа с раздельными этапами осахаривания и ферментации. В частности, это подтверждается фактом, когда добавление композиции, например, композиции по US 2002037342, подразумевает включение таких веществ как гемицеллюлоза, способных повышать вязкость во время ферментации.

Этот документ описывает использование этой композиции с целью улучшения условий на этапе осахаривания. Он никоим образом не означает, что композиция может представлять интерес для способа, не включающего этап осахаривания или только один этап предварительного осахаривания.

Действительно, оптимальные условия для осахаривания и для ферментации сильно различаются. В частности, осахаривание зачастую проводится при температуре около 60°С, то есть при температуре, которая не подходит для дрожжей, обычно используемых во время ферментации. Обоюдно, как это иллюстрируется таблицей 7 документа US 2002037342, ферменты композиции по US 2002037342 проявляют оптимальную ферментативную активность при температуре осахаривания, но, как и следовало ожидать, демонстрируют пониженную