Способы переноса молекулярных веществ в клетки растений

Способы переноса молекулярных веществ в клетки растений

Иллюстрации

Показать все

Реферат

ЗАЯВЛЕНИЕ О ПРИОРИТЕТЕ

По настоящей заявке испрашивается приоритет по дате подачи предварительной заявки на патент США с порядковым номером 60/978059, поданной 5 октября 2007 года, в отношении СПОСОБОВ ПЕРЕНОСА МОЛЕКУЛЯРНЫХ ВЕЩЕСТВ В КЛЕТКИ РАСТЕНИЙ.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Наночастицы имеют уникальные свойства, которые использовались для применения в доставке ДНК в клетки. Среди всех исследованных наночастиц наночастицы золота (Au) имеют тенденцию быть превосходными кандидатами для доставки вследствие их низкой цитотоксичности и легкости функционализации различными лигандами биологической важности. Обычно используемый синтез наночастиц Au дает отрицательно заряженную (например, в случае цитратного покрытия) поверхность. Плазмидная ДНК, которая может быть достаточно гибкой для частичного раскручивания ее оснований, может быть доступна наночастицам золота ("GNP"). При этих частично раскрученных условиях, отрицательный заряд на ДНК-скелете может быть достаточно удаленным, так что ван-дер-ваальсовы силы притяжения между этими основаниями и частицей золота являются достаточными для вызывания прикрепления плазмидной ДНК к поверхности частицы золота.

Кроме наночастиц металлов, полупроводниковые наночастицы (например, квантовые точки (quantum dots)) ("QD") в диапазоне размеров 3-5 нм также использовали в качестве носителей для доставки молекул в клетки. ДНК и белки могут быть связаны с лигандом, прикрепленным к поверхности QD (см., например, Patolsky, F. et al., J. Am. Chem. Soc. 125, 13918 (2003)). Покрытые карбоновой кислотой или амином QD могут быть сшиты с молекулами, содержащими тиоловую группу (см., например, Dubertret B. et al., Science 298, 1759 (2002); Akerman, M. E., W. C. W. Chan, P. Laakkonen, S. N. Bhatia, E. Ruoslahti, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 12617 (2002); Mitchell, G. P., C. A. Mirkin, R. L. Letsinger, J. Am. Chem. Soc. 121, 8122 (1999)), или N-гидроксисукцинимил(NHS)эфирной группой с использованием стандартных протоколов биоконъюгации (см., например, Pinaud, F., D. King, H.-P. Moore, S. Weiss, J. Am. Chem. Soc. 126, 6115 (2004); Brachez, M., M. Moronne, P. Gin, S. Weiss, A. P. Alivisatos, Science 281, 2013 (1998)). Одним альтернативным способом является конъюгация покрытых стрептавидином QD с биотинилированными белками, олиго или антителами (см., например, Dahan M. et al., Science 302, 442 (2003); Pinaud, F., D. King, H.-P. Moore, S. Weiss, J. Am. Chem. Soc. 126, 6115 (2004); Dahan M. et al., Science 302, 442 (2003); Wu X. Y., et al., Nature Biotechnol. 21, 41 (2003); Jaiswal, J. K., H. Mattoussi, J. M. Mauro, S. M. Simon, Nature Biotechnol. 21, 47 (2003); и Mansson, A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 314, 529 (2004).

Наночастицы использовали для доставки плазмидной ДНК в различные клетки животных. Было обнаружено, что при инкубировании покрытых ДНК наночастиц с клетками, не имеющими клеточной стенки, эти клетки поглощают эти наночастицы и начинают экспрессировать любые гены, кодируемые этой ДНК. Когда желательна доставка наночастиц в клетки, имеющие в норме клеточную стенку, эту клеточную стенку удаляют перед добавлением этих частиц к протопластам растения (см. Torney, F. et al., Nature Nanotechnol. 2, (2007). В клетках растений эта клеточная стенка является барьером для доставки подаваемых экзогенно молекул. Использовали многочисленные инвазивные способы, такие как генный пистолет (баллистика), микроинъекция, электропорация и Agrobacterium, для достижения доставки генов и малых молекул в клетки с клеточной стенкой растений, но доставка белков достигалась только посредством микроинъекции. Доставка малых молекул и белков в присутствии клеточной стенки растительной клетки остается неисследованной и была бы полезной для развития технологий, пригодных для развертывания в интактных клетке/ткани или органе растения для манипуляций in vitro и in vivo.

Данное изобретение относится к способам применения наночастиц для неинвазивной доставки молекулярных веществ в клетки, имеющие клеточную стенку.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следующие варианты осуществления описаны вместе с системами, инструментами и способами, которые, как предполагается, являются примерными и иллюстративными и не ограничивающими объем изобретения.

Настоящим изобретением представлены способы введения представляющей интерес молекулы в клетку растения, которая имеет клеточную стенку, предусматривающие приведение клетки растения, имеющей клеточную стенку, в контакт с наночастицей и представляющей интерес молекулой и позволение поглощения этой наночастицы и представляющей интерес молекулы в эту клетку.

Далее, представлены способы введения представляющей интерес молекулы в клетку растения, имеющую клеточную стенку, предусматривающие приведение клетки растения, имеющей клеточную стенку, в контакт с наночастицей и молекулой, способной лечить заболевание, и позволение поглощения этой наночастицы и молекулы, способной лечить заболевание, в эту клетку.

Кроме примерных аспектов и вариантов осуществления, описанных выше, дополнительные аспекты и варианты станут очевидными ввиду следующих описаний.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ФИГУР

Фиг.1 изображает фотографии отдельных клеток BY2, наблюдаемых с использованием дифференциального интерференционного контрастного микроскопа, подсоединенного к конфокальной системе визуализации (Панель А). Панель В показывает поле зрения светового микроскопа единственной клетки из варианта BY2, которая окрашена I2KI для более ясного выделения пластиды (амилопласта).

Фиг.2, Панель А, изображает фотоавтотрофные клетки табака (NT1), поддерживаемые в минимальной среде и 5% диоксиде углерода, видимые в световом микроскопе, где видны заметные хлоропласты. Фиг.2, Панель В, показывает сходные клетки NT1, наблюдаемые под флуоресцентным микроскопом, с активными хлоропластами, автофлуоресцирующими красным светом.

Фиг.3 показывает агрегаты суспензии BY2, обработанные только SAMSA-флуоресцеином, и покрытые SAMSA-флуоресцеином GNP. Фиг.3, Панель А, показывает изображение DIC клеток, обработанных только SAMSA-флуоресцеином, в то время как фиг.3, Панель В, показывает флуоресцентное изображение тех же самых клеток. Фиг.3, Панель С, показывает изображение DIC клеток, обработанных покрытыми SAMSA-флуоресцеином GNP, в то время как фиг.3, Панель D, показывает флуоресцентное изображение обработанных покрытыми SAMSA-флуоресцеином GNP. Указаны положения ядра (Nu) и клеточной стенки (CW).

Фиг.4 показывает обработанные покрытыми SAMSA-флуоресцеином GNP отдельные клетки при высоком увеличении. Панель В показывает присутствие большого количества GNP в ядрышке. Панель А показывает вид в ярком поле зрения того же самого ядрышка, показанного в Панели В, при другой плоскости фокусирования.

Фиг.5 показывает фотоавтотрофные клетки, обработанные покрытыми SAMSA-флуоресцеином GNP. Панель А показывает гиалиновые (прозрачные) клетки в 3-4 кластерах с большими хлоропластами, выстилающими внутреннюю сторону клеточной стенки. Панель В показывает накопление наночастиц в хлоропласте. Панели С и D показывают более высокое увеличение единственного хлоропласта с использованием флуоресцентного микроскопа. Наночастицы являются видимыми в мембранных ламеллах хлоропласта и рассеяны среди автофлуоресцирующих хлорофилльных пигментов.

Фиг.6 показывает отражательное и флуоресцентное микроскопические изображения клеток, содержащих наночастицы. Панель А фиг.6 показывает отражательное изображение, где видны преимущественно GNP. Панель В показывает флуоресцирующие частицы в фоне красного автофлуоресцирующего хлоропласта. Объединенное (слитое) отражательное и флуоресцентное изображение показано в Панели С, в которой желтые флуоресцирующие частицы находятся внутри границы хлоропласта.

Фиг.7 показывает графическое представление одной возможной схемы трансформации в соответствии с одним вариантом осуществления данного изобретения.

Фиг.8 показывает клеточную интернализацию GFP, визуализированную посредством отражательной микроскопии после двух часов обработки. Панели А и А1 показывают необработанные контрольные клетки под DIC-микроскопом (Панель A), обработанные GFP-связанными Au-NP клетки, видимые под DIC-микроскопом (Панель А1); Панели В и В1 показывают контрольные клетки под отражательным микроскопом (Панель В) и обработанные GFP-связанными Au-NP клетки, видимые под отражательным микроскопом (Панель B1), показывающие интернализацию частиц из отраженных Au-NP; Панели С и С1 показывают контрольные клетки, на которые наложены изображения DIC-микроскопа и отражательного микроскопа (Панель С1); Панели D и D1 показывают обращенное изображение отражательной способности контрольных клеток для доказательства отсутствия частиц в фоне (Панель D) и обращенное изображение отражательной способности обработанных клеток для очень явного доказательства интернализации частиц (Панель D1).

Фиг.9 показывает интернализацию покрытых красителем SAMSA GNP в отдельных клетках. Панель А показывает окрашенные флуоресцеином клетки, причем клеточная стенка и среда обнаруживают флуоресценцию, но не интернализацию красителя; Панель В показывает отдельные клетки под DIC-микроскопом; Панель С показывает фазово-контрастное изображение для доказательства интернализации наночастиц (GNP 150 нм) в цитозоль и ядро, причем флуоресцеин интернализовался только с частицей и плазмолизованными клетками при пролонгированной экспозиции до 1 часа в УФ-свете.

Фиг.10 показывает конъюгат Au-GFP с флуоресцирующими молекулами GFP, перед смешиванием отдельных клеток. Панель А (FITC), B (яркое поле зрения), C (отражение), D (Панели A+B+C): GFP-флуоресцирующие Au-GNP, наблюдаемые посредством флуоресцентной микроскопии, спустя 2 часа после инкубирования, но перед смешиванием клеток. Сходные флуоресцирующие частицы можно было наблюдать на частице, обнаруживающей отражательную способность в ядре (см. фиг.8).

Фиг.11 показывает опосредованную наночастицей (GNP 90 нм) клеточную интернализацию GFP в клеточные линии BY2-E. Панель А показывает делящиеся контрольные клетки с активными цитоплазматическими тяжами (фазово-контрастное изображение); Панель В показывает те же самые клетки, что и в Панели А, при исследовании с использованием FITC, где автофлуоресценция из незеленых пластид в цитоплазме образует периферию, а также из пластид, ассоциированных с делящимся ядром; и где эти цитоплазматические тяжи и цитоплазма вблизи периферии этих клеток не обнаруживают автофлуоресценции; Панель С показывает контрольные клетки BY2, обработанные GFP, которые не присоединены к GNP (FITC), где эти клетки не обнаруживают поглощения GFP, но GFP окружают эти клетки, но не интернализуются; Панель D показывает опосредованную GNP интернализацию GFP, наблюдаемую через FITC-фильтр, причем периферическая цитоплазма, цитоплазматические тяжи и ядро обнаруживают интернализацию GFP, в сравнении с контролем в Панели В.

Фиг.12 показывает линии отдельных клеток BY2-E, обнаруживающие опосредованную GNP интернализацию YFP спустя 2 часа после инкубации клеток. Панель A (FITC), B (Родамин), C (DIC), D (Панели A+B), E (Панели A+B+C): F (обращенное отражательное изображение): интернализация YFP, наблюдаемая с использованием флуоресцентной микроскопии. Стрелки желтого цвета показывают интернализацию в живой отдельной клетке YFP в цитозоле (диффузную или концентрированную в ядре). Стрелки оранжевого цвета показывают интернализацию в плазмолизованных клетках, где масса сморщенных протопластов в клетке показывает интенсивную флуоресценцию, указывающую на интернализацию в этой клетке. Эта клетка обнаружена в той же самой плоскости фокусирования, что и живая клетка, которая расположена рядом, но ниже других живых клеток. Клетки, которые накапливают высокий уровень частицы и имеют флуоресценцию YFP, обнаруживают смерть клеток при пролонгированном исследовании под флуоресцентным микроскопом.

Фиг.13 и 14 показывают изображения в гелях амплифицированных генных продуктов PAT и YFP, которые были амплифицированы.

Фиг.15 показывает гель-электрофорез, осуществленный с использованием конъюгатов QD-пептид для подтверждения присоединения пептидов к QD.

Фиг.16 показывает плазмиду pDAB3831.

НАИЛУЧШИЕ ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В этом описании и следующих далее таблицах используется ряд терминов. Для обеспечения ясного и однообразного понимания этого описания и формулы изобретения, в том числе рамок, которые должны придаваться таким терминам, обеспечены следующие определения.

Обратное скрещивание. Обратное скрещивание может быть процессом, в котором селекционер повторяемым образом скрещивает гибридное потомство с одним из родителей, например, гибрид первой генерации F₁ с одним из родительских генотипов этого F₁-гибрида.

Зародыш (эмбрион). Зародыш может быть маленьким растением, содержащимся в зрелом семени.

Наночастица. Микроскопическая частица по меньшей мере с одним нанометровым размером, обычно меньшим, чем 100 нм. Наночастицы, подходящие для применения в данном изобретении, могут иметь размер 1 нм - 0,4 мкм. Квантовая точка может иметь средний диаметр 1 нм - 10 нм, предпочтительно 2-4 нм. Наночастица может быть выбрана из покрытых золотом наночастиц, пористых наночастиц, мезопористых наночастиц, наночастиц диоксида кремния, полимерных наночастиц, вольфрамовых наночастиц, желатиновых наночастиц, нанооболочек, наносердцевин (нанокоров), наносфер, наностержней, магнитных наночастиц и их комбинаций.

Квантовая точка. Квантовая точка является полупроводниковой наноструктурой, которая ограничивает движение электронов зоны проводимости и дырок валентной зоны, или экситонов (связанных пар электронов зоны проводимости и дырок валентной зоны) во всех трех пространственных направлениях. Это ограничение может быть обусловлено электростатическими потенциалами (генерируемыми наружными электродами, легированием полупроводника, деформацией, примесями), присутствием границы раздела между различными полупроводниковыми материалами (например, в нанокристаллических системах оболочка-сердечник), присутствием поверхности полупроводника (например, полупроводникового нанокристалла) или их комбинациями. Квантовая точка может иметь дискретный квантованный энергетический спектр. Соответствующие волновые функции пространственно локализованы в квантовой точке, но простираются на протяжении многих периодов кристаллической решетки. Квантовая точка содержит малое конечное число (порядка 1-100) электронов зоны проводимости, дырок зоны валентности или экситонов (т.е. конечное число элементарных электрических зарядов).

Устойчивые к глифосату. Устойчивость к дозе глифосата относится к способности растения выживать (т.е. растение не может быть уничтожено) при данной дозе глифосата. В некоторых случаях устойчивые (толерантные) растения могут быть временно желтыми или иным образом проявлять некоторое индуцированное глифосатом повреждение (например, избыточное побегообразование и/или ингибирование роста), но выживают.

Стабилизированные. Термин «стабилизированные» относится к характеристикам растения, которые воспроизводимо передаются от одной генерации к следующей генерации инбредных растений одного и того же сорта.

Поглощение. Поглощение относится к транслокации (передвижению) частицы, такой как наночастица, например, золота или квантовых точек, через клеточную стенку или клеточную мембрану, где эта транслокация происходит не только как результат количества движения, сообщенного этой частице чем-то иным, чем клетка, в которую поглощается эта частица. Неограничивающие примеры устройств или способов, которые вызывают транслокацию частицы через клеточную стенку или клеточную мембрану только в результате количества движения, сообщаемого этой частице, являются биолистическими технологиями, генным пистолетом, технологиями микроинъекции и/или прокалывания.

В соответствии с вариантами осуществления этого изобретения, может быть предложен способ введения представляющей интерес молекулы в клетку растения, содержащую клеточную стенку, предусматривающий приведение наночастицы, содержащей представляющую интерес молекулу, в контакт с этой клеткой и позволение поглощения этой наночастицы через клеточную стенку растения. В конкретных аспектах изобретения эта наночастица может быть любой наночастицей и может обратимо или необратимо содержать представляющую интерес молекулу, быть покрыта представляющей интерес молекулой или быть иным образом связана с представляющей интерес молекулой и/или нести представляющую интерес молекулу. В некоторых вариантах осуществления представляющая интерес молекула может быть введена в эти наночастицы перед контактом с клеткой растения, имеющей клеточную стенку, или совместно с введением этой наночастицы в клетку растения, имеющую клеточную стенку. Примеры наночастиц, которые могут быть использованы в вариантах осуществления данного изобретения, включают, но не ограничиваются ими, золото, квантовые точки, покрытые золотом наночастицы, пористые наночастицы, мезопористые наночастицы, наночастицы диоксида кремния, полимерные наночастицы, вольфрамовые наночастицы, желатиновые наночастицы, нанооболочки, наносердцевины (нанокоры), наносферы, наностержни, магнитные наночастицы и/или их комбинации.

Согласно вариантам осуществления данного изобретения, клетка растения, имеющая клеточную стенку, может быть любой клеткой растения, содержащей интактную и целую клеточную стенку. Примеры клеток, имеющих клеточную стенку, включают, но не ограничиваются ими, водоросли, табак, морковь, кукурузу, канолу, рапс, хлопчатник, пальму, арахис, сою, сахарный тростник, Oryza sp., Arabidopsis sp. и Ricinus sp., предпочтительно табак, морковь, кукурузу, хлопчатник, канолу, сою и сахарный тростник; более предпочтительно табак и морковь. Варианты этого изобретения могут включать клетки, содержащие клеточную стенку, из любой ткани или где бы они ни были обнаружены, в том числе, но не только, в зародышах, меристематических клетках, каллусе, пыльце, листьях, пыльниках, корнях, кончиках корней, цветках, семенах, стручках, стеблях и культуре ткани.

В вариантах осуществления этого изобретения представляющей интерес молекулой может быть любая молекула, которая может доставляться в клетку растения в соответствии с данным изобретением. Представляющие интерес молекулы или компоненты представляющих интерес молекул могут включать, но не ограничиваются ими, молекулы нуклеиновых кислот, ДНК, РНК, RNAi, гены, плазмиды, космиды, YAC, BAC, полипептиды, ферменты, гормоны, гликопептиды, сахара, жиры, сигнальные пептиды, антитела, витамины, мессенджеры, вторичные мессенджеры, аминокислоты, цАМФ, лекарственные средства, гербициды, фунгициды, антибиотики и/или их комбинации.

Варианты осуществления этого изобретения включают способы профилактики или лечения заболевания. Неограничивающие примеры этих вариантов осуществления включают доставку фунгицидов, антибиотиков и/или других лекарственных средств в клетки, нуждающиеся в этом, с использованием способов данного изобретения.

В конкретных вариантах осуществления данного изобретения поверхность наночастицы может быть функционализована, что может, например, допускать нацеленное поглощение или допустить обратимое или необратимое связывание других веществ с поверхностью этой наночастицы. В качестве неограничивающего примера, поверхность наночастицы (например, золотой наночастицы или квантовой точки) может быть функционализована самособирающимся монослоем, например, алкантиолатов, которые могут быть дополнительно функционализованы или дериватизованы. В следующем неограничивающем примере поверхность наночастицы может быть дериватизована линкерами, которые сами могут быть дополнительно функционализованы или дериватизованы. В одном варианте осуществления эта наночастица может быть ПЭГилирована. Другими словами, эта наночастица может содержать или может быть мультифункционализована одним или несколькими корами (активными или неактивными), стерическим (пространственным) покрытием (активным или инертным), расщепляемой связью и/или нацеливающими молекулой или лигандом.

В аспектах этого изобретения наночастица может поглощаться в различные части клеток. Примеры местоположений, в которые может поглощаться наночастица, включают, но не ограничиваются ими, цитозоль, ядро, тонопласты, пластиды, этиопласты, хромопласты, лейкопласты, элайопласты, протеинопласты, амилопласты, хлоропласты и просвет двойной мембраны. В других вариантах осуществления этого изобретения поглощение наночастицы в клетку, содержащую клеточную стенку, может происходить посредством симпластного или апопластного пути.

Дополнительные варианты этого изобретения включают генетически модифицированные клетки растений и способы генерирования их, где эти клетки растений имеют одну или несколько нуклеиновых кислот, введенных в них способами по данному изобретению. В одном примере одного варианта плазмида, содержащая представляющий интерес ген и селектируемый маркер, может быть введена в клетку растения, имеющую клеточную стенку, посредством наночастицы в соответствии с данным изобретением. В дополнительных вариантах осуществления могут быть отобраны стабильные трансформанты, которые стабильно интегрировали представляющий интерес ген и/или селектируемый маркер. В альтернативных вариантах осуществления клетка растения, содержащая представляющий интерес ген, может быть размножена для получения других клеток, содержащих представляющую интерес молекулу. В других вариантах осуществления клетки растений, содержащие представляющую интерес молекулу, могут быть регенерируемой клеткой, которая может быть использована для регенерации целого растения, включающего эту представляющую интерес молекулу.

В другом аспекте, данное изобретение обеспечивает способы создания регенерируемых клеток растений, содержащих представляющую интерес молекулу, для применения в культуре ткани. Эта культура ткани будет предпочтительно способна регенерировать растения, имеющие по существу тот же самый генотип, что и регенерируемые клетки. Регенерируемые клетки в таких культурах ткани могут быть зародышами, протопластами, меристематическими клетками, каллусом, пыльцой, листьями, пыльниками, корнями, кончиками корней, цветками, семенами, стручками или стеблями. Кроме того, один вариант этого изобретения обеспечивает растения, регенерированные из культур ткани этого изобретения.

Альтернативно, данное изобретение обеспечивает способ введения желаемого признака в клетку растения, имеющую клеточную стенку, предусматривающий приведение наночастицы и представляющей интерес молекулы, способной обеспечивать желаемый признак клетке растения, в контакт с этой клеткой и позволение поглощения этой наночастицы через клеточную стенку. Примеры желаемых признаков включают, но не ограничиваются ими, признаки, выбранные из мужской стерильности, устойчивости к гербицидам, устойчивости к насекомым и устойчивости к бактериальному заболеванию, грибковому заболеванию и/или вирусному заболеванию.

Другие аспекты этого изобретения обеспечивают способы генерирования стабилизированных линий растений, содержащих желаемый признак или представляющую интерес молекулу, в которых желаемый признак или желаемая представляющая интерес молекула могут сначала вводиться поглощением наночастицы через клеточную стенку растения. Способы генерирования стабилизированных клеточных линий хорошо известны специалисту с обычной квалификацией в данной области и могут включать, но не ограничиваются ими, такие способы, как самоопыление, обратное скрещивание, получение гибридов, скрещивания с популяциями и т.п. Все растения и клетки растений, содержащие желаемые признак или представляющую интерес молекулу, первыми введенные в клетку растения (или ее предшественники) поглощением наночастиц через клеточную стенку, входят в объем настоящего изобретения. Предпочтительно, клетки растения, содержащие желаемые признак или представляющую интерес молекулу, первыми введенные в это растение или в клетку (или ее предшественники) поглощением наночастиц через клеточную стенку, могут быть использованы в скрещиваниях с другими, отличающимися, клетками растений для получения гибридных клеток первой генерации (F₁), семян и/или растений с улучшенными характеристиками.

В вариантах осуществления, в которых представляющая интерес молекула содержит один или несколько генов, эти гены могут быть доминантным или рецессивным аллелем. В качестве примера, ген (гены) будут сообщать такие признаки, как устойчивость к гербицидам, устойчивость к насекомым, устойчивость к бактериям, грибную устойчивость, устойчивость к вирусным заболеваниям, мужскую фертильность, мужскую стерильность, улучшенное пищевое качество и промышленную применимость.

С появлением молекулярно-биологических способов, которые позволили выделять и характеризовать гены, которые кодируют конкретные белковые продукты или РНК-продукты (например, RNAi), исследователи в области биологии растений проявляли большой интерес к получению генной инженерией генома клеток, который содержит и экспрессирует чужеродные гены или дополнительные или модифицированные версии нативных или эндогенных генов (возможно, запускаемых отличающимися промоторами) для изменения этих признаков клетки специфическим образом. Такие чужеродные дополнительные и/или модифицированные гены называют здесь в совокупности "трансгенами". На протяжении последних пятнадцати-двадцати лет были разработаны несколько способов получения трансгенных клеток и, в конкретных вариантах, данное изобретение относится к трансформированным версиям клеток и способам их получения посредством введения в клетку, имеющую клеточную стенку, трансгена через поглощение наночастицы через клеточную стенку. В вариантах этого изобретения этот трансген может содержаться в экспрессирующем векторе.

Трансформация клеток может включать конструирование экспрессирующего вектора, который будет функционировать в конкретной клетке. Такой вектор может содержать ДНК, которая включает ген под контролем регуляторного элемента, или ген, функционально связанный с регуляторным элементом (например, промотором). Этот экспрессирующий вектор может содержать одну или несколько таких комбинаций функционально связанных генов/регуляторных элементов. Этот вектор (векторы) могут быть в форме плазмиды и могут быть использованы отдельно или в комбинации с другими плазмидами для обеспечения трансформированных клеток с использованием способов трансформации, описанных здесь, для включения трансгена (трансгенов) в генетический материал клетки растения, имеющий клеточную стенку.

Экспрессирующие векторы для поглощения посредством наночастицы: Маркерные гены

Экспрессирующие векторы могут включать один генетический маркер, функционально связанный с регуляторным элементом (например, промотором), который позволяет трансформированным клеткам, содержащим этот маркер, либо извлекаться отрицательным отбором (т.е ингибированием роста клеток, которые не содержат ген этого селектируемого маркера) либо положительным отбором (т.е. скринингом на продукт, кодируемый этим генетическим маркером). Многие гены селектируемых маркеров для трансформации хорошо известны в областях трансформации и включают, например, гены, которые кодируют ферменты, которые метаболически детоксифицируют селективный химический агент, который может быть антибиотиком или гербицидом, или гены, которые кодируют измененную мишень, которая может быть нечувствительной к этому ингибитору. Несколько способов положительного отбора также известны в данной области.

Один обычно используемый ген селектируемого маркера, подходящий для трансформации растений, может включать ген неомицинфосфотрансферазы II (nptII) под контролем регуляторных сигналов растения, который придает устойчивость к канамицину. См., например, e.g., Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:4803 (1983). Другим обычно используемым геном селектируемого маркера может быть ген гигромицинтрансферазы, который придает устойчивость к антибиотику гигромицину. См., например, Vanden Elzen et al., Plant Mol. Biol., 5:299 (1985). Дополнительные гены селектируемых маркеров бактериального происхождения, которые придают устойчивость к антибиотикам, включают гентамицинацетилтрансферазу, стрептомицинфосфотрансферазу, аминогликозид-3'-аденилтрансферазу и детерминанту устойчивости к блеомицину. См. Hayford et al., Plant Physiol. 86:1216 (1988), Jones et al., Mol. Gen. Genet, 210:86 (1987), Svab et al., Plant Mol. Biol. 14:197 (1990), Hille et al., Plant Mol. Biol. 7:171 (1986). Другие гены селектируемых маркеров придают устойчивость к гербицидам, таким как глифосат, глюфосинат или бромоксинил. См. Comai et al., Nature 317:741-744 (1985), Gordon-Kamm et al., Plant Cell 2:603-618 (1990) и Stalker et al., Science 242:419-423 (1988).

Другие гены селектируемых маркеров, подходящие для трансформации растений, являются генами небактериального происхождения. Эти гены включают, например, дигидрофолатредуктазу мыши, 5-енолпирувилшикимат-3-фосфатсинтазу растений и ацетолактатсинтазу растений. См. Eichholtz et al., Somatic Cell Mol. Genet. 13:67 (1987), Shah et al., Science 233:478 (1986), Charest et al., Plant Cell Rep. 8:643 (1990).

Другой класс генов маркеров, подходящих для трансформации растений, требует скрининга предположительно трансформированных клеток растений, а не прямого генетического отбора трансформированных клеток на устойчивость к токсичному веществу, такому как антибиотик. Эти гены особенно применимы для количественного определения или визуализации пространственного характера экспрессии гена в конкретных тканях, и их часто называют репортерными генами, так как они могут быть слиты с геном или регуляторной генной последовательностью для исследования экспрессии гена. Обычно используемые гены для скрининга трансформированных клеток включают β-глюкуронидазу (GUS), β-галактозидазу, люциферазу и хлорамфениколацетилтрансферазу. См. Jefferson, R. A., Plant Mol. Biol. Rep. 5:387 (1987), Teeri et al., EMBO J. 8:343 (1989), Koncz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:131 (1987), DeBlock et al., EMBO J. 3:1681 (1984).

Недавно были сделаны доступными in vivo способы для визуализации активности GUS, которые не требуют разрушения ткани растения. Molecular Probes publication 2908, Imagene Green.TM., p. 1-4(1993) и Naleway et al., J. Cell Biol. 115:151a (1991). Однако, эти in vivo способы для визуализации активности GUS оказались неприменимыми для извлечения трансформированных клеток вследствие низкой чувствительности, высоких флуоресцентных фонов и недостатков, ассоциированных с применением генов люциферазы в качестве селектируемых маркеров.

Совсем недавно гены, кодирующие флуоресцентные белки (например, GFP, EGFP, EBFP, ECFP и YFP), были использованы в качестве маркеров для экспрессии генов в прокариотических и эукариотических клетках. См. Chalfie et al., Science 263:802 (1994). Флуоресцентные белки и мутации флуоресцентных белков могут быть использованы в качестве поддающихся скринингу маркеров.

Экспрессирующие векторы для поглощения посредством наночастицы: Промоторы

Гены, включенные в экспрессирующие векторы, должны запускаться нуклеотидной последовательностью, содержащей регуляторный элемент, например, промотор. В настоящее время несколько типов промоторов известны хорошо в областях трансформации, как и другие элементы, которые могут использоваться отдельно или в комбинации с промоторами.

В данном контексте, "промотор" включает ссылку на область ДНК, которая может находиться слева (апстрим) от старта транскрипции и которая может участвовать в узнавании и связывании РНК-полимеразы и других белков для инициации транскрипции. "Промотором растений" может быть промотор, способный инициировать транскрипцию в клетках растений. Примеры промоторов под относящимся к развитию контролем включают промоторы, которые преимущественно инициируют транскрипцию в определенных тканях, таких как листья, корни, семена, волокна, сосуды ксилемы, трахеиды или склеренхима. Такие промоторы называют “тканепредпочтительными”. Промоторы, которые инициируют транскрипцию только в определенных тканях, называют "тканеспецифическими". Специфический в отношении "типа клетки" промотор запускает экспрессию в определенных типах клеток в одном или нескольких органах, например, клетках сосудов в корнях или листьях. "Индуцируемый" промотор может быть промотором, который может находиться под относящимся к окружающей среде контролем. Примеры относящихся к окружающей среде условий, которые могут влиять на транскрипцию посредством индуцируемых промоторов, включают анаэробные условия или присутствие света. Тканеспецифические, тканепредпочтительные, специфические в отношении типа клеток и индуцируемые промоторы составляют класс "неконститутивных промоторов". "Конститутивный промотор" может быть промотором, который может быть активным при большинстве условий окружающей среды.

A. Индуцируемые промоторы

Индуцируемый промотор может быть функционально связан с геном для экспрессии в клетке. Необязательно, индуцируемый промотор может быть функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальную последовательность, которая может быть функционально связана с геном для экспрессии в клетке. С индуцируемым промотором скорость транскрипции увеличивается в ответ на индуцирующий агент.

Любой индуцируемый промотор может быть использован для данного изобретения. См. Ward et al., Plant Mol. Biol. 22:361-366 (1993). Примеры индуцируемых промоторов включают, но не ограничиваются ими, промоторы из системы ACEI, которая отвечает на медь (Mett et al., PNAS 90:4567-4571 (1993)); ген In2 из кукурузы, который отвечает на бензолсульфамидные гербицидные предохраняющие агенты (Hershey et al., Mol. Gen Genetics 227:229-237 (1991) и Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 243:32-38 (1994)); и Tet репрессор из Tn1O (Gatz et al., Mol. Gen. Genetics 227:229-237 (1991)). Одним особенно применимым индуцируемым промотором может быть промотор, который отвечает на индуцирующий агент, на который растения обычно не отвечают. Примером индуцируемого промотора может быть индуцируемый промотор из гена стероидного гормона, транскрипционная активность которого может быть индуцирована глюкокортикостероидным гормоном. Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:0421 (1991).

B. Конститутивные промоторы

Конститутивный промотор может быть функционально связан с геном для экспрессии в клетке, или конститутивный промотор может быть функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальную последовательность, которая может быть связана с геном, для экспрессии в клетке.

Различные конститутивные промоторы могут быть использованы в данном изобретении. Примеры конститутивных промоторов включают, но не ограничиваются ими, промоторы из вирусов растений, такие как промотор 35S из CaMV (Odell et al., Nature 313:810-812 (1985)); промоторы генов актина риса (McElroy et al., Plant Cell 2:163-171 (1990)); убиквитина (Christensen et al., Plant Mol. Biol. 12:619-632 (1989) и Christensen et al., Plant Mol. Biol. 18:675-689 (1992)); pEMU (Last et al., Theor. Appl. Genet. 81:581-588 (1991)); MAS (Velten et al., EMBO J. 3:2723-2730 (1984)); и гистона Н3 из кукурузы (Lepetit et al., Mol. Gen. Genetics 231:276-285 (1992) и Atanassova et al., Plant Journal 2 (3): 291-300 (1992)). Промотор ALS, XbaI/NcoI-фрагмент 5' (слева) от структурного гена ALS3 Brassica napus (или нуклеотидная последовательность, сходная с указанным XbaI/NcoI-фрагментом), представляет особенно применимый конститутивный промотор. См. заявку PCT WO 96/30530.

C. Тканеспецифические или тканепредпочтительные промоторы

Тканеспецифический промотор может быть функционально связан с геном для экспрессии в клетке. Необязательно, этот тканеспецифический промотор может быть функционально связан с нуклеотидной последовательностью, кодирующей сигнальную последовательность, которая может быть функционально связана с геном, для экспрессии в клетке. Растения, трансформированные представляющим интерес геном, функционально связанным с тканеспецифическим промотором, могут продуцировать белковый продукт этого трансгена исключительно или преимущественно в конкретной ткани.

Любой тканеспецифический или тканепредпочтительный промотор может быть использован в данном изобретении. Примеры тканеспецифических или тканепредпочтительных промоторов включают, но не ограничиваются ими, корнепредпочтительный промотор - такой как промотор гена фазеолина (Murai et al., Science 23:476-482 (1983) и Sengupta-Gopalan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3320-3324 (1985)); листоспецифический и индуцируемый светом промотор, такой как промотор cab или rubisco (рубиско) (Simpson et al., EMBO J. 4(11):2723-2729 (1985) и Timko et al., Nature 318:579-582 (1985)); специфический для пыльников промотор, например, из LAT52 (Twell et al., Mol. Gen. Genetics 217:240-245 (1989)); специфический для пыльцы промотор, например, из ZM13 (Guerrero et al., Mol. Gen. Genetics 244:161-168 (1993)), или микроспоропредпочтительный промотор, например, из apg (Twell et al., Sex. Plant Reprod. 6:217-224 (19