Способы и композиции для лечения фенилкетонурии

Способы и композиции для лечения фенилкетонурии

Реферат

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОМУ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Область изобретения

Настоящее изобретение относится, главным образом, к способам и материалам для лечения состояний и нарушений, связанных с метаболизмом фенилаланина и, более конкретно, к способам и материалам для лечения фенилкетонурии.

Описание связанной области

Фенилкетонурия (PKU) представляет собой гипераминоацидемию фенилаланина (Phe), связанную с врожденным нарушением метаболизма фенилаланина - мутацией гена, кодирующего фенилаланин-4-гидроксилазу (PAH), которая превращает фенилаланин в тирозин. В некоторых случаях происходит дополнительный метаболический дефект в синтетическом каскаде либо дигидроптеридина, либо тетрагидробиоптерина (BH4), кофакторов фенилаланин-4-гидроксилазы, что далее способствует гиперфенилаланинемии (HPA). В то время как нормальный уровень фенилаланина в плазме составляет приблизительно 0,05 мМ (1), пациенты с "классической" PKU без лечения имеют уровни фенилаланина в плазме выше 1 мМ, например, уровни фенилаланина от приблизительно 1 мМ до приблизительно 2,5 мМ или более, и, хотя лечение диетой с низким содержанием фенилаланина имеет цель снижения уровня фенилаланина в плазме до менее чем 0,3 мМ, этого трудно достигнуть вследствие проблем с соблюдением режима питания. В США 1 на 10000 детей рождаются с PKU. Избыточные уровни фенилаланина в плазме, наблюдаемые при PKU, в сочетании с относительно высокой аффинностью фенилаланина к участкам связывания на белке-переносчике системы транспорта нейтральных аминокислот в гематоэнцефалическом барьере (BBB) приводит к (i) накоплению фенилаланина Phe и его нейротоксических метаболитов, например, фенилпирувата, фенилацетата, фениллактата, в головном мозге (ii) снижению уровней нейтральных аминокислот, не являющихся фенилаланином, проникающих в головной мозг, что приводит к нарушенному развитию и функционированию головного мозга, поскольку ключевые каскады метаболизма, например, синтез нейротрансмиттеров, требуют аминокислот-предшественников, таких как тирозин. Это снижение выражено для тирозина, снабжение которым с помощью плазмы является низким вследствие метаболического нарушения фермента, ответственного за превращение фенилаланина в тирозин. В настоящее время полагают, что неврологические дефициты PKU, главным образом, являются следствием снижения уровней не являющихся Phe нейтральных аминокислот, проникающих в головной мозг (2).

Хотя диета с низким содержанием фенилаланина может снизить уровни фенилаланина в плазме при "классической" PKU ниже 0,3 мМ и смягчить задержку психического развития, связанную с PKU без лечения, соблюдение диеты может быть проблематичным и оно может стать особенно проблематичным, когда пациенты с PKU достигают подросткового возраста, что приводит к повышению уровней фенилаланина в плазме и как к снижению умственных способностей, так и к изменениям белого вещества в головном мозге. В дополнение к требуемому соблюдению пациентом диеты, способы лечения на основе ограничения питания также требуют, чтобы пациент знал уровень фенилаланина, имеющегося в пище. Более того, также в результате диет с ограничением по фенилаланину может возникнуть дефицит питательных веществ.

Таким образом, разработаны альтернативные способы лечения. Например, для преодоления ожидаемого истощения нейротрансмиттеров дофамина и серотонина, пациентов с PKU лечили предшественниками нейротрансмиттеров тирозином и триптофаном (3). Для снижения входящего потока фенилаланина в головной мозг, пожилым пациентам с PKU вводили добавку из нейтральных аминокислот с разветвленной цепью, содержащих валин, изолейцин и лейцин (4), для которых было описано значительное улучшение в отношении расстройств поведения. Было сделано предположение, что добавление предшественников нейротрансмиттеров, тирозина и триптофана (2) в добавку Berry (4), должно привести к дальнейшему улучшению. Однако эффективность этих способов лечения с добавкой в диету аминокислот является спорной.

Ввиду указного выше, существует признанная необходимость в способах и композициях для лечения фенилкетонурии и других состояний и нарушений, связанных с метаболизмом фенилаланина. Конкретно, в предшествующем уровне техники отсутствуют способы лечения фенилкетонурии введением фенилаланин-4-гидроксилазы отдельно или в сочетании с одним или несколькими другими ферментами, которые повышают ее активность в отношении метаболизма фенилаланина. Настоящее изобретение удовлетворяет этой давно существующей потребности и желанию в данной области.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способу лечения субъекта, страдающего фенилкетонурей. Способ включает введение одного или нескольких из фенилаланин-4-гидроксилазы или фенилаланинаммиаклиазы субъекту в условиях, эффективных для доставки фенилаланин-4-гидроксилазы и/или фенилаланинаммиаклиазы в тонкий кишечник субъекта. В способе, предоставляется дополнительная стадия введения пептидазы субъекту в условиях, эффективных для доставки пептидазы в желудок и/или тонкий кишечник субъекта.

Также настоящее изобретение относится к способу увеличения терапевтической активности фенилаланин-4-гидроксилазы (PAH) у субъекта, страдающего фенилкетонурией. Способ включает введение одного или нескольких из тиолированной рекомбинантной фенилаланин-4-гидроксилазы или фенилаланинаммиаклиазы субъекту в условиях, эффективных для доставки тиолированной рекомбинантной фенилаланин-4-гидроксилазы и/или фенилаланинаммиаклиазы в тонкий кишечник субъекта. В способе также предусмотрена дополнительная стадия введения пептидазы, как описано выше. Настоящее изобретение, кроме того, относится к пероральной дозированной форме. Пероральная дозированная форма содержит одну или несколько центральных частей, содержащих один или оба из фенилаланин-4-гидроксилазы или фенилаланинаммиаклиазы и растворяющееся в кишечнике покрытие на одной или нескольких центральных частях. В сходной пероральной дозированной форме, предусмотрен дополнительный компонент, содержащий пептидазу.

Другие и дополнительные аспекты, признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидны из следующего писания предпочтительных в настоящий момент вариантов осуществления изобретения. Эти варианты осуществления приведены для целей раскрытия.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

Для того чтобы эти приведенные выше признаки, преимущества и задачи изобретения, а также прочее, которое станет очевидным, достигались и могли быть понятными в деталях, представлено более конкретное описание изобретения, кратко описанного выше, применительно к его определенным вариантам осуществления, которые проиллюстрированы в прилагаемых рисунках. Эти рисунки составляют часть описания. Однако следует отметить, что прилагаемые рисунки иллюстрируют предпочтительные варианты осуществления изобретения и, таким образом, их объем не следует считать ограничивающим.

На фиг.1 графически проиллюстрировано протеолитическое расщепление фенилаланингидроксилазы, фенилаланингидроксилазы, слитой со связывающим мальтозу белком, и фенилаланингидроксилазы в присутствии трипсина и химотрипсина.

На фиг. 2A-2B графически проиллюстрированы уровни в крови фенилаланина (фиг.2A) и тирозина (фиг.2B) у мышей с фенилкетонурией, которых кормили покрытыми растворимыми в кишечнике гранулами фенилаланингидроксилазы.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Как используют в настоящем документе, форма единственного числа может означать один или более. Как используют в настоящем документе в формуле изобретения, форма единственного числа, когда она используется вместе со словом "содержащий", может означать один или более одного. Как используют в настоящем документе "другой" может означать по меньшей мере второй или более. Более того, если контекстом не требуется иное, термины в форме единственного числа включают множественное число и термины в форме множественного числа включают единственное число.

Как используют в настоящем документе, термин "или" в формуле изобретения используется для обозначения "и/или", если явно не указано на отнесение к альтернативам или если альтернативы не являются взаимоисключающими, хотя описание основано на определении, которое относится только к альтернативам и "и/или".

Как используют в настоящем документе, "PAH" обозначает фенилаланингидроксилазу и ее конъюгаты, которые превращают фенилаланин в тирозин. PAH может представлять собой фенилаланин-4-гидроксилазу "дикого типа", например, выделенную из природных источников, таких как ткань печени, или она может представлять собой рекомбинантную фенилаланин-4-гидроксилазу, например, продуцируемую рекомбинантно путем экспрессии в пригодном хозяине, таком как E. coli. В случаях, когда фенилаланин-4-гидроксилаза представляет собой рекомбинантно продуцируемую фенилаланин-4-гидроксилазу, она может представлять собой рекомбинантно продуцируемую фенилаланин-4-гидроксилазу мыши, человека или другого млекопитающего, например, она может быть рекомбинантно продуцирована путем экспрессии гена фенилаланин-4-гидроксилазы мыши, человека или другого млекопитающего в E. coli или другом пригодном хозяине. Рекомбинантно продуцируемая фенилаланин-4-гидроксилаза может представлять собой полноразмерную фенилаланин-4-гидроксилазу, или она может представлять собой укороченную фенилаланин-4-гидроксилазу, при условии, безусловно, что укороченная фенилаланин-4-гидроксилаза сохраняет активность фенилаланин-4-гидроксилазы. Альтернативно рекомбинантно продуцируемая фенилаланин-4-гидроксилаза может быть слитой или иным образом конъюгированной с другими материалами, такими как материалы, которые способствуют выделению и/или очистке рекомбинантно продуцируемой фенилаланин-4-гидроксилазы, например, как и в случае, когда рекомбинантно продуцируемая фенилаланин-4-гидроксилаза является слитой со связывающим мальтозу белком (MBH). В определенных вариантах осуществления, рекомбинантно продуцируемая фенилаланин-4-гидроксилаза представляет собой фенилаланин-4-гидроксилазу, которая является тиолированной в области PAH, богатой серином/треонином/тирозином.

Как используют в настоящем документе, "область, богатая серином/треонином/тирозином" обозначает область фенилаланин 4-гидроксилазы, которая является богатой остатками серина, богатой остатками треонина, богатой остатками тирозина, и/или является богатой любым сочетанием из остатков серина, треонина и тирозина. Иллюстративно, одна такая область, богатая серином/треонином/тирозином фенилаланин-4-гидроксилазы представляет собой область вблизи аминокислотного остатка серин-16 фенилаланин-4-гидроксилазы. Пригодные способы получения рекомбинантно продуцируемой фенилаланин-4-гидроксилазы и тиолирования такой продуцированной рекомбинантно фенилаланин-4-гидроксилазы в области, богатой серином/треонином/тирозином, включают способы, представленные ниже.

Как используют в настоящем документе, "PAL" обозначает фенилаланинаммиаклиазу и ее конъюгаты, которые превращают фенилаланин в транс-коричную кислоту (например, пегилированная PAL).

Как используют в настоящем документе, "пептидаза" обозначает ферменты, которые расщепляют белки и пептидные цепи меньших размеров на свободные аминокислоты, и включает протеазы.

Указание на "пептидазу" в настоящем документе означает включение одной или нескольких пептидаз. Примеры пригодных пептидаз, которые можно использовать в способе по настоящему изобретению, включают трипсин, химотрипсин и сочетания трипсина и химотрипсина или одной или нескольких дипептидаз.

Как используют в настоящем документе, "растворяющееся в кишечнике покрытие" включает покрытие, которое (i) остается интактным в течение по меньшей мере 2 часов, когда оно контактирует с искусственными пищеварительными соками желудка, такими как HCl с pH 1 при от 36 до 38°C и (ii) впоследствии дезинтегрирует в пределах 30 минут в искусственных пищеварительных соках кишечника, таких как буферный раствор KH₂PO₄ с pH 6,8.

Как используют в настоящем документе, "лечение" или "лечить" означает лечение прямой или непрямой причины состояния, лечение симптомов состояния; или оба варианта. Подразумевают, что его эффект может быть полным или частичным по отношению к желаемому исходу. Как используют в настоящем документе, "субъект" означает любое животное, такое как любое млекопитающее, например, мыши, крысы, кошки, кролики, собаки, свиньи, лошади, коровы и приматы, такие как люди. Иллюстративно, "субъект", как используют в настоящем документе, включает людей, страдающих фенилкетонурией, человеческих младенцев, человеческих детей, человеческих подростков, взрослых людей, мужчин, женщин, людей в возрасте менее чем приблизительно 2 года, людей в возрасте приблизительно между 2 годами и 5 годами, людей в возрасте между приблизительно 5 и приблизительно 10 годами, людей в возрасте между приблизительно 10 и приблизительно 18 годами, людей в возрасте между приблизительно 18 и приблизительно 30 годами, людей в возрасте между приблизительно 30 и приблизительно 40 годами, людей в возрасте между приблизительно 40 и приблизительно 50 годами, людей в возрасте между приблизительно 50 и приблизительно 60 годами, людей в возрасте более 60 лет. В дополнение к субъектам, страдающим фенилкетонурией, подходящие субъекты-люди включают субъектов, которые также страдают тирозинемией. Подходящие субъекты-люди также включают субъектов, которые также страдают фенилкетонурией, но которые не страдают тирозинемией.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ лечения субъекта, страдающего фенилкетонурией, причем способ включает введение одной или нескольких из фенилаланин-4-гидроксилазы или фенилаланинаммиаклиазы субъекту в условиях, эффективных для доставки фенилаланин-4-гидроксилазы и/или фенилаланинаммиаклиазы в тонкий кишечник субъекта.

В дополнение к этому варианту осуществления, способ включает введение пептидазы субъекту в условиях, эффективных для доставки пептидазы в желудок и/или тонкий кишечник субъекта. Пептидаза может представлять собой одну или несколько дипептидаз. Также, пептидазу можно вводить одновременно или последовательно с одной или несколькими из фенилаланин-4-гидроксилазы или фенилаланинаммиаклиазы. Кроме того, пептидазу и одну или обе из фенилаланин-4-гидроксилазы или фенилаланинаммиаклиазы вводят в отдельных составах или в одном составе. Составы могут быть покрыты растворяющимся в кишечнике покрытием. Также, составы могут быть изготовлены для замедленного высвобождения пептидазы(пептидаз) и/или одной или обеих из фенилаланин-4-гидроксилазы или фенилаланинаммиаклиазы. Более того, одну или обе из фенилаланин-4-гидроксилазы или фенилаланинаммиаклиазы можно включать в состав вместе с растворяющемся в кишечнике покрытием в качестве одного состава или отдельных составов.

В обоих вариантах осуществления фенилаланин-4-гидроксилаза может представлять собой полноразмерную или укороченную рекомбинантную фенилаланин-4-гидроксилазу. Также, фенилаланин-4-гидроксилаза может представлять собой фенилаланин-4-гидроксилазу млекопитающих. Например, фенилаланин-4-гидроксилаза может представлять собой фермент человека. Кроме того, фенилаланин-4-гидроксилаза может быть тиолированной в области, богатой серином/треонином/тирозином. В частности, тиол может находиться вблизи аминокислоты серин-16.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрен способ повышения терапевтической активности фенилаланин-4-гидроксилазы (PAH) у субъекта, страдающего фенилкетонурией, причем способ включает введение одной или нескольких из тиолированной рекомбинантной фенилаланин-4-гидроксилазы или фенилаланинаммиаклиазы субъекту в условиях, эффективных для доставки тиолированной рекомбинантной фенилаланин A-гидроксилазы и/или фенилаланинаммиаклиазы в тонкий кишечник субъекта.

В дополнение к этому варианту осуществления, способ включает введение пептидазы, как описано выше. Пептидаза также является такой, как описано выше. Также, пептидаза и/или тиолированная фенилаланин-4-гидроксилаза и/или фенилаланинаммиаклиаза могут быть включены в состав, как описано выше. Также, составы могут быть изготовлены для замедленного высвобождения, как описано выше. Кроме того, тиолированная фенилаланин-4-гидроксилаза является такой, как описано выше.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрена пероральная дозированная форма, содержащая одну или несколько центральных частей, содержащих одну или обе из фенилаланин-4-гидроксилазы или фенилаланинаммиаклиазы; и растворяющееся в кишечнике покрытие на одной или нескольких центральных частях. В дополнение к этому варианту осуществления пероральная дозированная форма содержит пептидазу, такую как описана выше. В обоих вариантах осуществления, фенилаланин-4-гидроксилаза может представлять собой рекомбинантный и/или тиолированный фермент, как описано выше. Также, пероральная дозированная форма может представлять собой форму с замедленным высвобождением.

В настоящем документе предусмотрены способы и пероральные составы для лечения субъекта, страдающего фенилкетонурией, причем способ включает введение фенилаланингидроксилазы (PAH) и/или фенилаланинлиазы (PAL) субъекту в условиях, эффективных для доставки фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL в тонкий кишечник субъекта. Этого можно достигать рядом способов. Например, фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL можно вводить путем прямой инъекции в тонкий кишечник субъекта. Альтернативно фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL можно вводить непосредственно в тонкий кишечник субъекта постоянно, полупостоянно или временно посредством помещенной трубки, которая сообщается с тонким кишечником. Примеры таких трубок включают дуоденальные зонды, зонды для еюностомии и т.п., а также трубки, которые обычно используют для назоэнтеральной интубации, например, для доставки в двенадцатиперстную кишку, тощую кишку и/или подвздошную кишку.

Альтернативно фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL можно доставлять в тонкий кишечник субъекта включением в состав фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL с растворяющимся в кишечнике покрытием и пероральным введением покрытой растворяющимся в кишечнике покрытием фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL субъекту. Покрытая растворяющимся в кишечнике покрытием фенилаланин-4-гидроксилаза и/или PAL может быть предоставлена, например, в дозированной форме, которая включает (i) центральную часть, содержащую фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL, и (ii) растворяющееся в кишечнике покрытие, окружающее центральную часть. Термин "центральная часть" включает не только таблетки, пилюли, бусы, зерна и гранулы, но также капсулы, например, мягкие или твердые капсулы из желатина или крахмала. Такие центральные части можно изготавливать любым общепринятым способом. В центральных частях могут находиться другие фармацевтически приемлемые ингредиенты, например, ингредиенты, обычно используемые для изготовления фармацевтических композиций, например, наполнители, например, лактоза, вещества, способствующие скольжению, например, диоксид кремния, и смазывающие вещества, например, стеарат магния.

Растворяющееся в кишечнике покрытие может быть предназначено для обеспечения защиты фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL при pH менее 3, как в желудке, в целях обеспечения высвобождения фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL при pH в местном окружении тонкого кишечника. Например, растворяющееся в кишечнике покрытие может быть предназначено для обеспечения высвобождения фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL при pH дуоденальной части тонкого кишечника, при pH еюнальной части тонкого кишечника, и/или при pH подвздошной части тонкого кишечника. Для дальнейшей иллюстрации, растворяющееся в кишечнике покрытие может быть предназначено для обеспечения высвобождения фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL при pH более чем приблизительно 4,5, приблизительно 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5 или 8. Растворяющееся в кишечнике покрытие может быть предназначено для быстрого высвобождения фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL, например, так чтобы после начала высвобождения фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL, по существу вся фенилаланин-4-гидроксилаза и/или PAL, например, более чем 60%, 70%, 80% или 90% и т.д. фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL, содержащейся в дозированной форме, высвобождалось в течение менее чем 8 часов, например, в течение менее чем 7 часов, 6 часов, 5 часов, 4 часов, 3 часов, 2 часов или 1 часа, и т.д.

В качестве иллюстрации, пригодные растворяющиеся в кишечнике покрытия включают покрытия, которые включают один или несколько полимерных материалов, которые окружают центральную часть, содержащую фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL. Примеры пригодных растворяющихся в кишечнике покрытий, которые можно использовать в способах по настоящему изобретению, включают покрытия, которые не обладают существенным растворением при уровнях pH менее 4,5, не обладают существенным растворением при уровнях pH менее 4, не обладают существенным растворением при уровнях pH менее 3,5, и т.д. Примеры пригодных покрытых растворяющимся в кишечнике покрытием дозированных форм, которые можно использовать в способах по настоящему изобретению, включают дозированные формы, которые не обладают существенным высвобождением фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL, содержащихся в дозированной форме, например, они обладают высвобождением менее 50%, например, менее 40%, 30%, 20% или 10% и т.д., в течение менее чем 3 часов, например в течение менее чем 2,5 часов, 2 часов, 1,5 часов или 1 часа, и т.д.

В качестве иллюстрации, для обеспечения предсказуемого профиля растворения, соответствующего типичному времени прохождения через тонкий кишечник человека, составляющему приблизительно 3 часа, и для обеспечения возможности воспроизводимого высвобождения в нем, растворяющееся в кишечнике покрытие может быть предназначено для того, чтобы оно начинало растворяться при значении pH между приблизительно 4,5 и 5,5, которое находится в пределах диапазона pH двенадцатиперстной кишки, и чтобы оно продолжало растворяться при диапазоне pH в тонком кишечнике, который составляет вплоть до приблизительно pH 7,2. Например, количество используемого растворяющегося в кишечнике покрытия можно выбирать так, чтобы растворяющееся в кишечнике покрытие по существу растворялось в течение времени прохождения через тонкий кишечник, составляющего приблизительно три часа, или количество используемого растворяющегося в кишечнике покрытия можно выбирать так, чтобы растворяющееся в кишечнике покрытие по существу растворялось задолго до времени прохождения через тонкий кишечник, составляющего приблизительно три часа. Например, растворяющееся в кишечнике покрытие по существу растворяется в течение 30 минут, 1 часа, 1,5 часов или 2 часов и т.д. после поступления в тонкий кишечник.

Растворяющиеся в кишечнике покрытия, пригодные для применения в способах по настоящему изобретению, включают полимеры растворяющегося в кишечнике покрытия, известные в данной области, например, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы (HPMCP-HP50, USP/NF 220824 HPMCP-HP55, USP/NF типа 200731 и HP55S; Shin Etsu Chemical), фталат поливинилацетата (COATERIC^TM; Colorcon Ltd.), фталат поливинилацетата (SURETERIC^TM; Colorcon, Ltd.), и фталат ацетата целлюлозы (AQUATERIC^TM; FMC Corp.) и т.п. Растворяющееся в кишечнике покрытие может включать сополимер метакриловой кислоты, например в случае, где сополимер метакриловой кислоты представляет собой водную дисперсию акриловой смолы. В качестве дальнейшей иллюстрации, в растворяющемся в кишечнике покрытии может быть использован анионный сополимер, образованный из метакриловой кислоты и этилакрилата, например, имеющий отношение свободных карбоксильных групп к сложному эфиру, составляющее приблизительно 1:1, и/или имеющий среднюю молекулярную массу приблизительно 250000. Один такой анионный сополимер поставляется в качестве водной дисперсии, содержащей 30% масс./масс. сухого лакового вещества, Rohm-Pharma Co., Germany (EUDRAGIT^TM L30D-55).

Некоторые растворяющиеся в кишечнике материалы покрытия, известные в данной области, являются кислыми по своему характеру и могут вызывать химическую деградацию неустойчивых к кислотам активных веществ при прямом контакте с активным веществом. Особенно это касается условий высокой температуры и влажности, имеющихся в ходе процессов нанесения водных растворяющихся в кишечнике покрытий. Для снижения этой вызываемой кислотой деградации, на частицы, зерна, пилюли и т.д. можно наносить защитную оболочку или подоболочку перед нанесением растворяющегося в кишечнике покрытия. Эта защитная оболочка физически разделяет неустойчивое к кислотам активное вещество и растворяющееся в кишечнике покрытие, и она может быть пригодна для повышения стабильности активного вещества. Для дальнейшего уменьшения этой проблемы полимер растворяющегося в кишечнике покрытия может быть выбран так, чтобы он имел значение pH, например, приблизительно pH 4,5 или более, или приблизительно 5 или более, и т.д., которое не вызывает существенной деградации каких-либо неустойчивых к кислотам активных веществ, содержащихся в центральной части.

При использовании кислого полимера растворяющегося в кишечнике покрытия, pH кислого полимера растворяющегося в кишечнике покрытия можно повышать с использованием пригодного подщелачивающего вещества, например, гидроксида натрия, до точки ниже pH, где целостность полимера в кишечнике может быть утрачена. Эту частичную нейтрализацию кислотой можно использовать для обеспечения более стабильной композиции для любых неустойчивых к кислотам активных веществ, содержащихся в центральной части. С использованием этого способа частичной нейтрализации кислоты, несовместимость между неустойчивым к кислотам активным веществом и растворяющимся в кишечнике покрытием может быть снижена до такой степени, чтобы защитная подоболочка между активным веществом и растворяющимся в кишечнике покрытием не была необходимой для снижения деградации центральной части. Способ частичной нейтрализации кислоты позволяет более быстрое высвобождение лекарственного средства, поскольку слой подоболочки может замедлять высвобождение лекарственного средства и поскольку pH растворяющегося в кишечнике покрытия должен будет только немного повыситься для того, чтобы произошло разрушение растворяющегося в кишечнике покрытия. Растворяющееся в кишечнике покрытие также может содержать пластификатор. Примеры пригодных пластификаторов включают триэтилцитрат (Citroflex-2), диэтилфталат, триацетин, трибутилсебацат и полиэтиленгликоль.

Количество используемого растворяющегося в кишечнике покрытия будет зависеть от ряда факторов, например, от требуемого профиля времени высвобождения, от типа материала(ов), используемого для получения растворяющегося в кишечнике покрытия и от того, используют ли подоболочку, и т.д. Например, масса используемого растворяющегося в кишечнике покрытия может составлять от приблизительно 5% до приблизительно 30% от массы центральной части. В качестве иллюстрации, растворяющееся в кишечнике покрытие может включать сополимер метакриловой кислоты, например, в количестве приблизительно от 5% до 30%, предпочтительно, приблизительно от 10% до 20, по массе, и пластификатор, например, в количестве приблизительно от 1% до 6%, предпочтительно, приблизительно от 2% до 3%, по массе. Эти массы основаны на общей концентрации твердых веществ в растворе/суспензии растворяющегося в кишечнике покрытия.

Материал растворяющегося в кишечнике покрытия может быть предоставлен на поверхности дозированной формы, например, таблетки с растворяющимся в кишечнике покрытием, в которой материал растворяющегося в кишечнике покрытия окружает одну центральную часть, которая содержит фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL. Альтернативно материал растворяющегося в кишечнике покрытия можно использовать в процессе микроинкапсулирования, например, при котором материал растворяющегося в кишечнике покрытия используют для нанесения покрытия на поверхности множества центральных частей, содержащих фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL, где множество покрытых растворяющемся в кишечнике покрытием центральных частей упакованы в капсулу или другую такую дозированную форму.

В качестве дальнейшей иллюстрации, пригодные растворяющиеся в кишечнике покрытия могут включать любое фармацевтически приемлемое покрытие, которое препятствует высвобождению активного вещества (фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL) в желудке и которое в достаточной степени дезинтегрирует в кишечнике при контакте с приблизительно нейтральными или щелочными пищеварительными соками для обеспечения высвобождения активного вещества (фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL) в тонкий кишечник. Различные тесты in vitro для определения того, относится ли или не относится покрытие к растворяющемуся в кишечнике покрытию, опубликованы в фармакопеях различных стран.

Толщина растворяющегося в кишечнике покрытия может варьировать и зависит, помимо прочего, от его проницаемости для воды и кислот. Количество растворяющегося в кишечнике покрытия может составлять приблизительно 16-30 мг, например, 16-20 мг или 16-25 мг на 1 желатиновую капсулу. Аналогичная толщина может быть применима в других составах. В качестве иллюстрации, пригодные растворяющиеся в кишечнике покрытия включают покрытия толщиной 5-100 мкм, например, 20-80 мкм.

Покрытие может быть пригодным образом выбрано из макромолекулярных полимеров, как известно, и оно является стандартом в данной области (5-8). Пригодные полимеры включают, но не ограничиваются ими, производные сложных эфиров целлюлозы, простые эфиры целлюлозы, акриловые смолы, такие как метилакрилатные сополимеры и сополимеры производных малеиновой кислоты и фталевой кислоты. В качестве дальнейшей иллюстрации, растворяющееся в кишечнике пленочное покрытие может быть изготовлено из фталата и тримеллитата ацетата целлюлозы, из сополимеров метакриловой кислот, например, сополимеров метилакриловой кислоты и ее сложных эфиров, содержащих по меньшей мере 40% метилакриловой кислоты, и из фталата гидроксипропилметилцеллюлозы.

Метилакрилаты включают метилакрилаты с молекулярной массой более 100000 Дальтон, на основе, например метилакрилата и метил- или этилметилакрилата в соотношении приблизительно 1:1. Пригодные метилакрилаты включают Endragit L, например, L 100-55, (Rohm GmbH, Darmstadt, Germany). Пригодные фталаты ацетата целлюлозы включают фталаты ацетата целлюлозы, имеющие содержание ацетила 17-26% и содержание фталата 30-40% с вязкостью приблизительно 45-90 спз. Пригодные тримеллитаты ацетата целлюлозы включают тримеллитаты ацетата целлюлозы, имеющие содержание ацетила 17-26%, содержание тримеллитила 25-35% с вязкостью приблизительно 15-20 спз. Примером пригодного тримеллитата ацетата целлюлозы является выпускаемый на рынок продукт CAT (Eastman Kodak Company, USA). Пригодные фталаты гидроксипропилметилцеллюлозы включают фталаты гидроксипропилметилцеллюлозы, имеющие молекулярную массу от 20000 до 100000 дальтон, например, от 80000 до 130000 дальтон, например, содержание гидроксипропила от 5 до 10%, содержание метокси от 18 до 24% и содержание фталила от 21 до 35%. Примером соответствующего фталата ацетата целлюлозы является выпускаемый на рынок продукт CAP (Eastman Kodak, Rochester N.Y., USA). Примеры пригодных фталатов гидроксипропилметилцеллюлозы включают выпускаемые на рынок продукты, имеющие содержание гидроксипропила 6-10%, содержание метокси 20-24%, содержание фталила 21-27%, молекулярную массу приблизительно 84000 Дальтон, известные под торговым названием HP50 и доступные от Shin-Etsu Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan. Другие примеры пригодных фталатов гидроксипропилметилцеллюлозы включают выпускаемые на рынок продукты, имеющие содержание гидроксипропила, содержание метокси и содержание фталила 5-9%, 18-22% и 27-35% соответственно, и молекулярную массу 78000 Дальтон, известные под торговым названием HP55 и доступные от Shin-Etsu Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan.

Растворяющееся в кишечнике покрытие можно наносить общепринятым способом, например, на центральную часть распыляют раствор растворяющегося в кишечнике покрытия. Пригодными растворителями для растворяющегося в кишечнике покрытия являются, например, органические растворители, например, спирт, например, этанол, кетон, например, ацетон, галогенированные углеводороды, например, CH₂Cl₂, или смеси таких растворителей, например, этанол/ацетон в соотношении, например, от 1:1 до 10:1. В такой раствор можно добавлять смягчитель, такой как ди-н-бутилфталат или триацетин, например, в соотношении материала покрытия к смягчителю от приблизительно 1:0,05 до приблизительно 1:0,3. Если желательно в случае фталатов целлюлозы и других кислых материалов покрытия, можно получать соль аммония и можно использовать водный раствор. Для покрытия можно использовать устройство для нанесения покрытия в псевдоожиженном слое. В одном иллюстративном варианте осуществления, центральные части обрабатывают при комнатной температуре или нагревают до 40°С, например, теплым воздухом при температуре от 40° до 70°С, перед напылением. Для избежания слипания центральных частей, процесс напыления можно прерывать через определенные промежутки времени, а затем центральные части снова нагревать. Однако также процесс можно проводить без прерывания процесса напыления, например, путем автоматического регулирования количества спрея с учетом температуры выпускаемого воздуха и/или центральных частей. Давление при напылении может варьировать в широких диапазонах. Пригодное давление для напыления включает давление от приблизительно 1 до приблизительно 1,5 бар. Дальнейшие детали по выбору, изготовлению и нанесению растворяющихся в кишечнике покрытий доступны в литературе (5-8).

Следует отметить, что часть фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL, которые вводят субъекту может доставляться в другие сегменты желудочно-кишечного тракта субъекта, например, в желудок субъекта, при условии что существенная часть фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL доставляется в тонкий кишечник субъекта. Полагают, что кислое окружение желудка нарушает или существенно снижает активность фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL, и, таким образом, любая фенилаланин-4-гидроксилаза и/или PAL, которая высвобождается в желудок, разрушается или становится неактивной.

Независимо от того, как фенилаланин-4-гидроксилаза и/или PAL доставляется в тонкий кишечник субъекта, например, посредством прямого введения в тонкий кишечник путем инъекции или зонда или посредством покрытой растворяющимся в кишечнике покрытием пероральной дозированной формы, способ по настоящему изобретению, необязательно, может дополнительно включать введение пептидазы субъекту в условиях, эффективных для доставки пептидазы в желудок и/или тонкий кишечник субъекта. В случаях, когда пептидаза является устойчивой к кислотам, ее можно добавлять в желудок или тонкий кишечник. В случае, когда кислые условия желудка могут нарушить или существенно снизить активность пептидазы, доставка в тонкий кишечник является предпочтительной. Пептидазу можно вводить последовательно с фенилаланин-4-гидроксилазой и/или PAL, где пептидазу вводят перед введением фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL, например, от 5 минут до приблизительно 2 часов ранее, или где пептидазу вводят после введения фенилаланин-4-гидроксилазы и/или PAL, например, от приблизительно 5 минут до приблизительно 2 часов после. Альтернативно пептидазу можно вводить одновременно с фенилаланин-4-гидроксилазой и/или PAL, где пептидазу вводят одновременно с фенилаланин-4-гидроксилазой и/или PAL или по существу в то же время, что и фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL, например, где пептидазу и фенилаланин-4-гидроксилазу и/или PAL вводят в пределах 5 минут друг от друга. В случаях, где пептидазу вводят одновременно с фенилаланин-4-гидроксилазой и/или PAL, пептидазу можно вводить с фенилаланин-4-гидроксилазой и/или PAL в отдельных составах, или пептидазу можно вводить с фенилаланин-4-гидроксилазой и/или PAL в одном составе, например, в одном покрытом растворяющимся в кишечнике покрытием составе. В случаях, когда пептидазу вводят с фенилаланин-4-гидроксилазой и/или PAL в одной дозированной форме, д